葡萄酒中DNA的简单快速提取方法

摘要

葡萄酒中DNA的简单快速提取方法，包括以下步骤：A用纯水将5g的Silica清洗干净，加入5ml水悬浮Silica沉淀，混匀，置4℃备用；B建立最佳吸附条件的葡萄酒；C葡萄酒DNA的吸附及回收：(1)向上述葡萄酒混合液中加入Silica悬浮液；(2)4℃下保育1－2小时，不断摇晃、振荡；(3)离心，5000g，5min，4℃；(4)弃上清液，用含0.1M Tris－HCl，pH 8.0，1％CTAB，1M NaCl的冲洗液短暂冲洗Silica沉淀1－2次；(5)离心，5000g，5min，收集Silica沉淀；(6)向上述Silica沉淀加入等量的纯水，摇匀，于65℃保温5－10min热洗脱DNA；(7)离心(10000g，5min)收集含有DNA的上清液；(8)等体积氯仿抽提步骤(7)的上清液，离心10000g，3min，收集含有DNA上相；(9)用异内醇沉淀法回收、浓缩上清液中DNA；(10)回收的葡萄酒DNA溶于50μlTE(10mM Tris－HCl，pH 8.0)缓冲液。

说明书

技术领域

本发明属于提取葡萄酒中DNA的技术，具体就是提取葡萄酒DNA以用于鉴别葡萄酒真假的DNA分析技术。

背景技术

众所周知，葡萄酒是一种世界通畅性的酒种，具有很高的营养价值和保健作用。葡萄酒发酵理论的奠基人，法国大科学家路易.巴斯德(L. Pasteur)曾说：“葡萄酒是最健康的饮料”。医学研究表明，葡萄酒中含有大约600种对人体有益的成份，其中的白藜芦醇(resveratrol)具有预防癌症、降低胆固醇的效果(Jang et al.1997)。目前，饮用葡萄酒的人越来越多，名优红(白)葡萄酒尤其为世人所青睐。在许多发达国家，喝葡萄酒已经成为一种生活时尚。

长期以来，市场上各种葡萄酒的质量参次不齐，价格从2美元到200美元不等，并且还存在用酒精、糖精、葡萄香精、色素等按一定比例勾兑而成的假葡萄酒。葡萄酒的品质主要由经验丰富的品酒师的感官辨别，而普通的经销商和消费者很难辨别名优葡萄酒与假冒伪劣产品的区别。近年来，国际上一些著名的葡萄酒公司及有关研究机构试图通过DNA分析技术鉴定葡萄酒的品种，以保护其名贵葡萄酒品种，赢得消费者的信赖。例如，澳大利亚Handry公司将DNA防伪标签标用于他们的陈年葡萄酒上。然而，通过DNA分析鉴定葡萄酒品种的技术，在很大程度上取决于从葡萄酒中提取的DNA的质和量。

由下列文献可知，(Jang M，Cai L，Udeani GO et al.(1997)Cancerchemopreventive activity of resveratrol，a natural product from grapes.Science 275：218-220)、(Rogstad SH.(2003)Plant DNA extraction usingSi lica.Plan tMol.Biol.Rep.21：463a-463g)、(Siret R，Gigaud O et al.(2002)Analys i s of grape Vitis vinifera L. DNA in must mixtures andexperimental mixed wines using microsatellite markers.J.Agric.FoodChem.50(13)，3822-3827)、(García-Beneytez E，Moreno-Arribas MV et al.(2002)Application of a DNA analysis method for the cultivaridentification of grape musts and experimental and commercial wines ofVitisvinifera L.using microsatellite markers.J.Agric.Food Chem.50(21)，6090-6096)和(SiretR，BoursiquotJM et al.(2000)Toward theauthentication of varietal wines by the analysis of grape(Vitis viniferaL.)residual DNA in must and wine using microsatellite markers.J.Agric.Food Chem.48(10)，5035-5040)，目前从红(白)葡萄酒中提取DNA的方法，均是通过异丙醇沉淀(Siret R et al.2000，2002；García-Beneytez et al.2002)。从新葡萄酒(must)或未经过澄清处理的葡萄酒中提取DNA相对容易，因为其中可能包含破碎的葡萄组织，从离心收集的沉淀中可以提取相当量的DNA。对于商业零售的瓶装葡萄酒，由于经过发酵、澄清等多种工序，来源于葡萄组织的DNA被破坏殆尽，瓶装葡萄酒中残留的痕量DNA片段必然很小。因此，从零售的瓶装葡萄酒中提取DNA需要大体积(500-1000ml)的葡萄酒，常规的异丙醇沉淀法不仅操作不便，且DNA产率低，重复性差。因此，建立一种简便快速的从葡萄酒中提取DNA的技术势在必行，以满足日益增长的利用DNA分析技术鉴定葡萄酒品质的需要。

从葡萄酒中提取DNA的主要难点包括：(1)葡萄酒中DNA含量甚微；(2)葡萄酒中存在大量的多酚类(单宁)、多糖、有机酸等，它们严重干扰DNA提取及下游利用DNA的分子实验(如PCR)；(3)常规的异丙醇沉淀法用于大体的葡萄酒操作不便；(4)DNA提取之前通过透析除去多酚等污染物，或利用冷冻干燥及离心技术浓缩葡萄酒等费时，且需要额外的仪器设备；(5)葡萄酒呈弱酸性，其pH一般在3.4-4.2之间，这也限制了常规DNA提取方法的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是建立一种简便、快速、可靠的从葡萄酒中提取DNA的方法，并将提纯DNA用于基于PCR技术的葡萄酒品种鉴定，以便为商业上名贵葡萄酒的防伪提供DNA分子标签。

本发明是这样实现的，葡萄酒中DNA的简单快速提取方法，包括以下步骤：

A用纯水将5g的Silica清洗干净，加入5ml水悬浮Silica沉淀，混匀，置4℃备用；

B建立最佳吸附条件的葡萄酒

在磁力搅拌器上缓慢加入下列制剂调节葡萄酒：

1)加入10N的NaOH溶液调节葡萄酒的pH为8.0左右；

2)加入CTAB至1％(w/v)；

3)加入NaCl至1.0M；

4)加入巯基乙醇至0.2％(v/v)；

C葡萄酒DNA的吸附及回收

(1)向上述葡萄酒混合液中加入Silica悬浮液；

(2)4℃下保育1-2小时，不断摇晃、振荡；

(3)离心，5000g，5min，4℃；

(4)弃上清液，用含0.1M Tris-HCl，pH 8.0，1％CTAB，1M NaCl的冲洗液短暂冲洗Silica沉淀1-2次；

(5)离心，5000g，5min，收集Silica沉淀；

(6)向上述Silica沉淀加入等量的纯水，摇匀，于65℃保温5-10min热洗脱DNA；

(7)离心(10000g，5min)收集含有DNA的上清液；

(8)等体积氯仿抽提步骤(7)的上清液，离心10000g，3min，收集含有DNA上相；

(9)用异丙醇沉淀法回收、浓缩上清液中DNA；

(10)回收的葡萄酒DNA溶于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0)缓冲液。

所述用纯水将5g的Silica清洗干净，是指5g干燥的Silica与5ml纯水充分混合，室温沉降5-10小时，吸去上清液，再加入5ml纯水充分混合，室温沉降5-10小时，吸去上清液。

所述向上述葡萄酒混合液中加入Silica悬浮液；是指按5ml Silica/1000ml的量加入Silica悬浮液。

所述等体积氯仿抽提步骤(7)的上清液，是指重复氯仿抽提步骤。

所述氯仿抽提步骤(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。

本发明可以将以下方法同时使用；

所述用纯水将5g的Silica清洗干净，是指5g干燥的Silica与5ml纯水充分混合，室温沉降5-10小时，吸去上清液，再加入5ml纯水充分混合，室温沉降5-10小时，吸去上清液；

所述所述向上述葡萄酒混合液中加入Silica悬浮液；是指按5mlSilica/1000ml的量加入Silica悬浮液；

所述等体积氯仿抽提步骤(7)的上清液，是指重复氯仿抽提步骤；

所述氯仿抽提步骤(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。

本发明的原理是利用Silica(硅石，silicon dioxide)可以选择性地可逆吸附DNA片段的特性。非特异性吸附到Silica颗粒上的蛋白质、多糖、多酚等干扰化合物可通过冲洗除去，而Silica吸附的DNA需要在加热时才可以解吸附。在本发明确定的立最佳条件下，Silica可以高效地与红(白)葡萄酒中痕量的DNA结合，然后通过离心收集结合DNA的Silica颗粒，从而避免了异丙醇沉淀法操作大量液体的不便以及重复性差、DNA产率低的弊端。尽管有一些利用Silica从植物叶片中提取DNA的例子(如Rogstad 2003)，但葡萄酒中痕量的DNA与植物叶片中DNA不同，国内外目前尚无利用Silica从葡萄酒中提取DNA的报道。

本发明建立的方法简便、快速、容易操作，且不需要任何试剂盒；获得的DNA纯度高(A260/280为1.8-2.0)，且产率高，重复性高。所采用的Silica，价格低廉，无毒副作用。该发明面向国内外葡萄酒厂及从事葡萄、葡萄酒研究的高等院校和研究所，适用于依靠DNA分析的葡萄酒品质鉴定及名贵葡萄酒的DNA分子标签技术，具有重要的应用价值及经济效益。

具体实施方式

1Silica的预处理Silica购买自Sigma-Aldrich公司(产品代号S5631；2006年12月2日查询的价格为509RMB/100g)。5g干燥的Silica与5ml纯水充分混合，室温沉降5-10小时，吸去上清液。重复上述洗涤过程1次，最后加入5m l水悬浮Silica沉淀，混匀，置4℃备用。

2最佳吸附条件的建立

(1)葡萄酒pH的调节利用10N的NaOH溶液调节葡萄酒的pH为8.0左右，此时其颜色刚开始变蓝。颜色变化归因于来源于葡萄果皮的花色素苷(anthocynin)；

(2)加入CTAB至1％(w/v)(10g/1000ml终体积)；

(3)NaCl至1.0M(58.44g/1000ml终体积)；

(4)加入巯基乙醇至0.2％(v/v)(2ml/1000ml终体积)。

以上操作应在磁力搅拌器上缓慢进行。

3葡萄酒DNA的吸附及回收

(1)向上述葡萄酒混合液中加入Silica悬浮液(5ml Silica/1000ml)；

(2)4℃下保育1-2小时，不断摇晃、振荡；

(3)离心，5000g，5min，4℃(最好用离心管500ml在制备型离心机上进行)；

(4)弃上清液，用冲洗液(含0.1M Tri s-HCl，pH 8.0，1％CTAB，1M NaCl)短暂冲洗Silica沉淀1-2次，以去除非DNA类物质(该步骤可用30-50ml的离心管)；

(5)离心，5000g，5min，收集Silica沉淀；

(6)向上述Silica沉淀加入等量的纯水，摇匀，于65℃保温5-10min热洗脱DNA；

(7)离心(10000g，5min)收集含有DNA的上清液；

(8)等体积氯仿抽提步骤(7)的上清液，进一步去除污染物；离心10000g，3min，收集上相(含有DNA)(必要时可重复氯仿抽提步骤，并增加苯酚抽提)；

(9)上清液中DNA采用常规的异丙醇沉淀法回收、浓缩；

(10)回收的葡萄酒DNA溶于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0)缓冲液，并进行定量、定性检测。

4DNA检测：

提纯的葡萄酒DNA可利用紫外分光光度法检测定量，或者通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色定性分析(灵敏性的染色可采用SYBR Green1，Gel Red andGelGreen等)。分子检测主要利用针对叶绿体a/b结合蛋白基因的保守区域设计的引物或利用微卫星标记引物(如VVMD5)，通过PCR扩增产生的特异片断鉴定提取的DNA是否来源于特定的葡萄品种。