一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒及其应用。应用本发明所提供的试剂盒和方法，可准确定量待测标本中人乳腺球蛋白mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒和方法可用于临床及科研中，可对肿瘤患者的外周血、骨髓中hMAMmRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，评价治疗效果及动态观察病情具有重要意义。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒及其应用。

背景技术

乳腺癌是人类最常见的一种恶性肿瘤，为女性主要恶性肿瘤之一。世界各国因地理环境、生活习惯的不同，乳腺癌的发病率有很大差异，北美和北欧的大多数国家为高发区，南美和南欧一些国家为中等，亚洲、拉丁美洲和非洲的大多数国家为低发区。在北美、两欧等发达国家，女性乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤发病率的首位。据美国癌症协会估计，美国每年有12万乳腺癌新发病例，发病率为72.2/10万。我国虽属世界上女性乳腺癌的低发区，但近年来乳腺癌的发病率明显增高。我国各地区乳腺癌的发病率也不相同，沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。2006年我国乳腺癌发病率为52/10万，居女性恶性肿瘤中的第一位。

乳腺癌的治疗方法有多种，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗等。目前，手术切除为乳腺癌综合治疗方法中的首选，然而在手术切除技术已达到相当成熟和普及的同时，乳腺癌切除后的高复发和转移率已成为阻碍乳腺癌患者生存期提高的主要原因。手术前乳腺癌细胞由于自然或侵袭性医源性因素脱落至外周血并随血转移至乳腺外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，随血液循环返回到乳腺，并在乳腺内恢复增殖，从而导致了乳腺癌的复发。肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学(X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。影像学检查中，病灶或转移灶需要形成一定大小才能够被仪器成像和有效分辨；病理形态检查中，需要取到合适的检测标本，且有相当数量可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移的早期，能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力，因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。

外周血中肿瘤特异性基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。

人乳腺球蛋白(Human mammaglobin，hMAM)基因，由Watson MA等利用mRNA差异显示技术分离得出，位于11q12-q13，cDNA全长503bp，其中开放阅读框279bp，编码93个氨基酸，相对分子质量10.5kD。大量研究结果显示，hMAM基因只在成人乳腺中表达，其他组织器官不表达，在原发性乳腺癌中过度表达，正常人外周血hMAMmRNA呈阴性；游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被RNA酶解，故在外周血中若测得hMAM mRNA，则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞。(Watson MA，FlemingTP.Mammaglobin，a mammary-specific member of the uteroglobin gene family，is overexpressed in human breast cancer.Cancer Res，1996，56(4)：860-865.Gal S，Fidler C，Lo YM，et al.Detection of mammaglobin mRNA in the plasmaof breast cancer patients.Ann N Y Acad Sci，2001，945：192-194.)。因此，hMAM mRNA是一项较好的血源性乳腺癌细胞的监测指标。

检测乳腺癌患者骨髓及血中的hMAM mRNA对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技术，例如韩正祥等应用普通的RT-PCR检测乳癌患者外周血hMAM mRNA的表达，阳性率仅为30.8％(16/52)，乳腺良性疾病患者和健康人对照组均为阴性(韩正祥，张敬川.hMAM mRNA和CEA mRNART-PCR检测乳腺癌外周血微转移.中国肿瘤临床，2004，31(21)：1235-1239.)；普通的RT-PCR检测只能对乳腺癌患者外周血hMAM mRNA的表达进行定性检测，不能进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒。

本发明所提供的检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒，含有一对引物和探针。

上述试剂盒中，所述引物对的一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。

上述试剂盒中，所述探针的核苷酸序列是序列表中序列3。

所述试剂盒中还可包括进行实时荧光定量RT-PCR所需的试剂，这些试剂均可从商业途径得到。

上述检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的方法。

上述检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的方法为：利用上述检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒采用实时荧光定量RT-PCR检测人乳腺球蛋白mRNA表达量。

本发明所提供的试剂盒和方法，可准确定量待测标本中人乳腺球蛋白mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒和方法可用于临床及科研中，可对肿瘤患者的外周血、骨髓中hMAM mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，评价治疗效果及动态观察病情具有重要意义。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为标准品的检测结果

图2为标准品的标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、人乳腺球蛋白mRNA表达量检测试剂盒的制备

试剂盒中各组分为：(一)细胞裂解液I；(二)细胞裂解液II；(三)RNA洗涤缓冲液I；(四)RNA洗涤缓冲液II；(五)无RNA酶的水；(六)RNA分离柱；(七)收集管；(八)PCR管；(九)DNA酶I储存液；(十)反转录缓冲液；(十一)dNTP混合物；(十二)逆转录酶储存液；(十三)PCR反应液和探针；(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液；(十五)标准品；(十六)对照品(包括阳性对照品和阴性对照品)。

上述各组分的组成或制备如下：

(一)细胞裂解液I

溶质是如下终浓度的物质：0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.1mol/L氯化钠和0.05mol/L氯化镁。溶剂是水。

细胞裂解液I在25℃条件下，pH值为7.6。

(二)细胞裂解液II

溶质是如下终浓度的物质：3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠、0.2％十二烷基硫酸钠。溶剂是水。

细胞裂解液II在25℃条件下，pH值为5.2。

(三)RNA洗涤缓冲液I

溶质是如下终浓度的物质：0.2mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸。溶剂是水。

RNA洗涤缓冲液I在25℃条件下，pH值为7.6。

(四)RNA洗涤缓冲液II

溶质是如下终浓度的物质：1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸。溶剂是水。

RNA洗涤缓冲液II在25℃条件下，pH值为7.5。

(五)无RNA酶的水

向去离子水中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)(购自Biobasic公司)，至终浓度为0.05％，22-25℃放置10-12小时后，121℃高压灭菌20分钟，22-25℃放置备用。

(六)RNA分离柱

购于安徽优晶生物工程有限公司。

(七)收集管

购于安徽优晶生物工程有限公司。

(八)PCR管

购于美国Applied Biosystems(ABI)公司。

(九)DNA酶I储存液

溶质是如下终浓度的物质：50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、25mmol/L三羟甲基氨基甲烷-乙酰、12.5mmol/L氯化镁、5.5mmol/L氯化钙、25％甘油、0.5U/μlDNA酶I。溶剂是水。

DNA酶I储存液在25℃条件下，pH值为7.5。

(十)反转录缓冲液

溶质是如下终浓度的物质：9.1μmol/L Oligo(dT)_12-18(TaKaRa)、3.6U/μl RNA酶抑制剂、72.7mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen)、182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、273mmol/L氯化钾、11mmol/L氯化镁。溶剂是水。

反转录缓冲液在25℃条件下，pH值为8.3。

(十一)dNTP混合物

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，25℃条件下，pH值为7.0-7.5，四种dNTP浓度终浓度均为10mmol/L。

如dATP为脱氧腺苷三磷酸，磷酸上的三个氢中的一个或两个被钠所取代，便形成了钠盐。其他几种也是如此，即dNTP是以钠盐形式存在的。

(十二)逆转录酶储存液

溶质是如下终浓度的物质：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钠、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen)、50％甘油、0.01％Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(Invitrogen)。溶剂是水。

逆转录酶在25℃条件下，pH值为7.5。

(十三)PCR反应液和探针

1、PCR反应液

溶质是如下终浓度的物质：18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2.78mmol/L氯化镁、92.6mmol/L氯化钾、0.37μmol/L上下游引物、0.1U/μl Taq酶(TaKaRa)、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/L dTTP。溶剂是水。

PCR反应液在25℃条件下，pH值为8.3。

上述引物为：

P1(上游引物)：5’-TGAAGTTGCTGATGGTCCTCAT-3’       (SEQ ID NO：1)，

P2(下游引物)：5’-TCAGTCTTAGACACTTGTGGATTGATT-3’  (SEQ ID NO：2)。

引物可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)。

2、探针

探针序列为：5’-FAM-AGCACTGCTACGCAGGCTCTGGCT-TAMRA-3’(SEQ ID NO：3)。

探针可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)，探针的浓度为2μmol/L。

上述引物和探针是以hMAM全长cDNA序列(GenBank登录号为：NM_002411.1)为模板，使用ABI7000型实时荧光定量PCR仪随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑hMAM基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合得到的。上述引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液

溶质是如下终浓度的物质：50％甘油、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、150mmol/L氯化钠、1.0mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen)、0.05％Tween20、1U/μl尿嘧啶DNA糖基化酶。溶剂是水。

UNG酶储存液在25℃条件下，pH值为7.5。

(十五)标准品

标准品为终浓度为2×10⁸拷贝数/μl的pMD18-hMAM121重组质粒，TE溶液溶解(TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)。

标准品中插入的hMAM片段(名称为hMAM121)的DNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

1、细胞总RNA的提取

1)将人乳腺癌SK-BR-3细胞，用DMEM完全培养基(Gibco公司)按常规方法进行培养。

2)将培养的细胞用0.25％胰蛋白酶(质量百分含量)消化，1000rpm离心收集细胞，转移到1.5mL离心管中，每管约1×10⁶个细胞。

3)提取细胞总RNA，具体过程如下：

①往沉淀的细胞中加入650μl细胞裂解液II(向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为每1mL细胞裂解液II加入20μl浓度为14.5mol/L的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风橱下进行)，漩涡振荡充分混匀。

②再加入650μl的70％乙醇，漩涡振荡混匀。

③把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内，10000g离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤③的操作。

④向DNA酶I储存液管中加入400μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

⑤吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上洗涤柱子，10000g离心1分钟，弃去2mL收集管。

⑥将RNA分离柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500μl经稀释的RNA洗涤缓冲液II(RNA洗涤缓冲液II在使用前，每3mL加入12mL无水乙醇)，10000g离心1分钟，弃去流出液，该收集管可重复使用。

⑦再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后12000g离心1分钟，甩干RNA分离柱基质。

⑧把柱子转移到无RNA酶的1.5ml离心管，加入50μl无RNA酶的水，确保加入的无RNA酶的水直接加在柱基质上，10000g离心1分钟，洗脱RNA。将装有RNA溶液的离心管置于冰盒上，备用。

2、逆转录反应

将dNTP混合物及逆转录酶储存液加入反转录缓冲液中配制成反转录反应液(dNTP混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液的体积比为2∶1∶11)，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余的反转录反应液可于-20℃冰箱中保存。

反转录体系为：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液4.0ul、无RNA酶的水2.5ul。

反转录反应条件为：42℃，15分钟→95℃，5分钟。

反应结束后，取出离心管置于冰盒上。

3、PCR扩增

用TaKaRa公司的普通PCR扩增试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。

PCR反应体系为：反转录产物5ul、10×PCR缓冲液5.0ul、dNTP混合物4.0ul、上、下游引物(P1、P2)各2.0ul、Taq酶0.5ul、水31.5ul。

PCR反应条件为：先94℃、3分钟→再94℃、30秒，60℃、45秒，72℃、50秒，共35个循环→最后72℃、7分钟。

4、hMAM121扩增产物的获得

1)将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含121bp目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg＝100μl的比例确定胶的体积。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自上海英俊生物技术有限公司)回收扩增产物

①按照试剂盒说明书中的比例在回收胶中加入DE-A液，60℃加热至完全熔化。

②加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20％。

③将上述液体转入制备管中，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

④加入0.5mL缓冲液W1后，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

⑤加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥再加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1分钟，弃滤液；12000rpm，离心1分钟，以甩干滤膜基质。

⑦将制备管置于新的1.5mL离心管中，在滤膜中央加入25μl水，室温静置1分钟后，12000rpm，离心1分钟洗脱DNA。

5、hMAM121的克隆及鉴定

1)重组载体的构建

①10μl体系中，加入1μl T载体(pMD18-T Vector)(TaKaRa)，4μl DNA样品，加入5μl连接缓冲液(100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、15mmol/L氯化镁、1.0mmol/L三磷酸腺苷、20mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen)、1U/μlDNA连接酶。连接缓冲液在25℃条件下，pH值为7.5。)，16℃反应14小时。

②取5μl连接产物，加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细菌中，混匀后冰浴40分钟，置于42℃水中热休克90秒，冰浴2分钟。

③加入无抗生素的LB培养基400μl，于37℃摇床上以150rpm的速度混合振摇45分钟后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37℃平放20分钟后，倒置培养12小时。

2)重组载体的鉴定

①观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mL LA培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD₆₀₀≈0.4。

②取1.5mL培养物至离心管中，4℃，11000rpm离心30秒，弃尽上清液。

③100μl预冷的裂解液I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200μl新配制的裂解液II(200mmol/l NaOH，1％SDS，水)，混匀后，冰浴3分钟，再加入150μl预冷的裂解液III(3mol/L醋酸钾；pH5.2，25℃)，颠倒混匀后冰浴3-5分钟；4℃，11000rpm离心5分钟后将上清转移至另一离心管中。

④加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡后4℃，11000rpm离心2分钟，再将上清转移至另一离心管。

⑤加入1/10体积的3M NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混匀后，室温静置10分钟，4℃，11000rpm离心10分钟后弃上清。

⑥加入1mL 70％乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm离心2分钟；弃去上层液体。

⑦加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm离心2分钟，弃去乙醇后，室温倒置10分钟，加入30μl蒸馏水溶解质粒DNA。

⑧取适量的质粒DNA作为模板，在引物P1和P2的引导下，进行PCR鉴定，可扩增出151bp DNA片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。

3)hMAM121扩增产物的鉴定

①质粒的大量抽提

A)取1mL含目的菌落的菌液，加入到30mL LA培养基中，摇床培养至OD₆₀₀约为0.6。

B)取25mL上述菌液接种至300mL LA培养基中，37℃，250rpm培养10-14小时，然后4℃，4500rpm，20分钟离心收菌。

C)用200mL预冷的STE(10mmol/L Tris-HCl(PH8.0，25℃)，0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(PH8.0，25℃)，水)重悬菌体，4℃，4500rpm，20分钟离心收菌。

D)加入9mL Solution I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)，混匀，再加入1mL用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)新鲜配制的溶菌酶(10mg/mL)，再加入10mL新鲜配制的Solution II(200mmol/l NaOH，1％SDS，水)，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟。

E)加入7.5mL冰冷的SolutionIII(3mol/L醋酸钾；pH5.2，25℃)，轻轻混匀，冰浴10分钟；4℃，11000rpm离心10分钟，取上清。

F)加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，11000rpm离心10分钟，弃上清。

G)用70％乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15分钟离心回收，用2mL TE溶解沉淀。

H)加入2mL 5mol/L的LiCl，混匀，10000g离心10分钟，弃去上清。

I)用70％乙醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

J)加入300μl TER，溶解沉淀，转移至1. 5mL离心管中，37℃水浴1-2小时。

K)加入300μl 1.6mol/L NaCl(含13％聚乙二醇)，混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。

L)250μl TE(pH8.0)溶解沉淀，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。

M)取上清，加入60μl 10mol/L NH₄Ac及2倍体积的无水乙醇(或95％乙醇)，混匀，4℃，12000g离心5分钟，弃上清。

N)120μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心10分钟，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

O)加入100μl三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。

②质粒的序列测定

对含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列测定，结果重组载体中的插入片段hMAM121具有序列表中SEQ IDNO：4的DNA序列，将该重组载体命名为pMD18-hMAM121。将pMD18-hMAM121作为标准品。

③将上述抽提得到的质粒pMD18-hMAM121用TE溶液溶解(TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)至终浓度为2×10⁸拷贝数/μl。

(十六)对照品

阳性对照品为含有hMAM mRNA的总RNA，阴性对照品为正常人外周血总RNA，RNA提取方法同样品RNA提取方法(实施例2的步骤三)。将提取到得两种总RNA分别用无RNA酶的水溶解至终浓度为0.2ug/ul，取5ul上述RNA样品加入1ml无水乙醇中，-20℃保存。

将上述各组分分装，组合为10人份的试剂盒，每盒中各组分的量为：细胞裂解液I1瓶(30mL/瓶)、细胞裂解液II1瓶(10mL/瓶)、RNA洗涤缓冲液I1瓶(10mL/瓶)、RNA洗涤缓冲液II1瓶(3mL/瓶)、无RNA酶水1瓶(4mL/瓶)、RNA分离柱、收集管、PCR管、DNA酶I储存液1管(120ul/管)、反转录缓冲液1管(33ul/管)、dNTP混合物1管(6.0ul/管)、逆转录酶1管(3.0ul/管)、PCR反应液1管(251.75ul/管)、UNG酶储存液1管(4.75ul/管)、探针1管(28.5ul/管)、标准品1管(10ul/管)、阳性对照品1管(1.0ug/管)、阴性对照品1管(1.0ug/管)。

实施例2、人乳腺球蛋白基因mRNA表达量的检测

用实施例1制备的10人份的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的人乳腺球蛋白基因mRNA表达量。

实验组：46例病理诊断确诊的乳腺癌患者，其中13例临床确诊已发生转移。

对照组：10例肺癌患者，4例胃癌患者，6例肝癌患者，18例乳腺良性疾病患者及10例健康对照。

一、实验准备

1、将细胞裂解液I按1∶9的比例用灭菌去离子水稀释成细胞裂解液I稀释液。

2、向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为：每1mL细胞裂解液II中加入20μl浓度为14.5M的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风橱下进行。

3、RNA洗涤缓冲液II在使用之前，每瓶加入12mL无水乙醇。

4、配制70％的乙醇溶液10mL。

二、取样

采受试者静脉血3mL于无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(1.44mg/mL全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存1-2小时，但时间不宜过长，否则将影响测定结果。全血经处理后，得到的有核细胞可于-80℃或液氮中保存。得到实验组样品和对照组样品。

三、实验组样品和对照组样品的细胞总RNA的提取

1)取3mL步骤二获得的新鲜抗凝血液加入到50mL无菌离心管后，再加入15mL的细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡混匀。

2)冰浴15分钟后，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变澄清表明红细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，可延长冰浴时间至20分钟。

3)4℃、450g离心10分钟沉淀有核细胞，完全弃去上清液。

4)用5mL的细胞裂解液I稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞。

5)4℃、450g离心10分钟，并再次完全弃去上清。

6)向沉淀的有核细胞中加入1mL细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡以完全悬浮细胞，将其转移至无菌的1.5mL离心管中，4℃、450g离心10分钟，完全弃去上清。

7)往沉淀的有核细胞中加入650μl细胞裂解液II(已加入2-巯基乙醇)，漩涡振荡充分混匀。

8)再加入650μl的70％乙醇，漩涡振荡混匀。此时可能会由于乙醇的加入而产生沉淀物，但这不会影响RNA的提取。

9)把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内(该柱最大结合能力是800μl，故每次加入量不宜超过750μl)，10000g离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤9的操作。

10)向DNA酶I储存液管中加入480μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

11)吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上洗涤柱子，10000g离心1分钟，弃去2mL收集管。

12)将RNA分离柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500μl已稀释的RNA洗涤缓冲液II，10000g离心1分钟，弃去流出液。该收集管可重复使用。

13)再用500μl已稀释的RNA洗涤缓冲液II洗涤RNA分离住，离心并弃去流出液。然后12000g离心1分钟，以甩干RNA分离柱基质。

14)将RNA分离柱转移至无RNA酶的1.5mL离心管上，取50μl无RNA酶的水加入到RNA分离柱基质上，10000g，离心1分钟。将装有RNA的离心管置于冰盒上，备用。得到实验组样品RNA和对照组样品RNA。

四、荧光定量PCR

1、实验组样品RNA、对照组样品RNA、阳性对照和阴性对照的反转录

将装有反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将dNTP混合物及反转录缓冲液全部加入逆转录酶管中配制成反转录反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余反转录反应液可于-20℃冰箱中保存。

反转录体系：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液5.0ul、无RNA酶的水1.5ul。

反转录反应条件为：42℃、15分钟→95℃、5分钟。

反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。得到实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性对照反转录产物和阴性对照反转录产物。

2、标准品的处理

将标准品贮存液(2×10⁸拷贝数/ul)梯度稀释为2×10⁷，2×10⁶，2×10⁵，2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹拷贝数/ul。

3、荧光定量PCR

将装有PCR反应液、探针及UNG酶储存液的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR反应液全部加入UNG酶储存液管中，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余液体于-20℃冰箱中保存。在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR反应体系为：模板5.0μl、PCR反应液15.0μl、水5.0μl。

其中，模板为实验组样品反转录产物或对照组样品反转录产物或阳性对照反转录产物或阴性对照反转录产物或标准品。

PCR反应条件为：37℃，10分钟→95℃，15分钟→95℃，15秒→60℃，1分钟。共50个循环。

五、标准曲线的制作

标准品荧光定量PCR检测结果如图1所示。横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝数。

根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。横坐标为标准品起始拷贝数的对数值，纵坐标为Ct值。图2中的Log特指Log₁₀。

六、检测结果

选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数(M)。每毫升全血样本中hMAM mRNA的拷贝数N＝M×6.6。

1)13例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表1所示。

表1 13例临床确诊已转移的乳腺癌患者hMAM mRNA拷贝数的检测结果

患者编号性别   年龄标本hMAM mRNA值(拷贝数/毫升全血)    1    2    3    4    5  女  女  女  女  女    42    65    50    62    40外周血外周血外周血外周血外周血        3.2×10⁶        1.4×10⁷        5.7×10⁵        7.1×10⁶        1.8×10⁷

    6    7    8    9    10    11    12    13    女    女    女    女    女    女    女    女    52    44    57    66    80    42    70    63    外周血    外周血    外周血    外周血    外周血    外周血    外周血    外周血    1.2×10⁶    9.3×10⁵    1.7×10⁶    2.7×10⁶    4.3×10⁵    6.2×10⁴    8.1×10⁵    5.2×10³

2)33例临床未确诊转移的乳腺癌患者中10例为阳性，其余23例为阴性。阳性结果如表2所示。

表2 33例临床未确诊转移的乳腺癌患者hMAM mRNA拷贝数的阳性检测结果

患者编号性别年龄  标本    hMAM值(拷贝数/毫升全血)    17    18    21    25    29    30    34    39    40    45  女  女  女  女  女  女  女  女  女  女  38  56  49  56  62  55  48  55  61  70  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血  外周血    6.5×10⁵    4.4×10⁵    1.3×10⁶    2.0×10⁴    5.0×10⁵    2.7×10³    8.2×103    3.6×10³    6.4×10²    2.0×10⁵

3)对照组：10例肺癌患者、4例胃癌患者、6例肝癌患者、18例乳腺良性疾病患者及10例正常健康人均为阴性，未检测到hMAM的表达。

上述结果表明用本发明的试剂盒可对hMAM mRNA的表达进行较为准确的定性及定量分析。

序列表

<110>中国科学技术大学

<120>一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒及其应用

<130>CGGNARY71692

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgaagttgct gatggtcctc at                                               22

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcagtcttag acacttgtgg attgatt                                          27

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agcactgcta cgcaggctct ggct                                             24

<210>4

<211>121

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>4

tgaagttgct gatggtcctc atgctggcgg ccctctccca gcactgctac gcaggctctg      60

gctgcccctt attggagaat gtgatttcca agacaatcaa tccacaagtg tctaagactg     120

a                                                                     121