重组人微小纤溶酶原在制备防、治眼科疾病药物中的应用

摘要

本发明属生物技术领域，涉及重组人微小纤溶酶原的药物新用途，具体涉及重组人微小纤溶酶原在制备防、治眼科疾病药物中的应用。本发明将t－PA激活重组人微小纤溶酶原形成微小纤溶酶后，将微小纤溶酶微量用于实验动物玻璃体腔内，实验结果表明：经t－PA激活的微小纤溶酶能诱导完全性的玻璃体后脱离，并保持视网膜内层结构的完整性。本发明的重组人微小纤溶酶原可制备治疗或预防眼科疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及重组人微小纤溶酶原的药物新用途，更具体地，本发明涉及重组人微小纤溶酶原在制备防、治眼科疾病药物中的应用。

背景技术

正常人眼玻璃体是由99％的水和1％的大分子构成的凝胶状透明结缔组织，这些大分子包括胶原纤维、透明质酸、可溶性糖蛋白交织成网状，起到支撑眼球的作用。玻璃体的后部(即玻璃体后皮质)主要是通过I型、IV型胶原蛋白、糖蛋白(层粘连蛋白、纤维连接蛋白)及其它糖耦化合物与视网膜内表面(即视网膜内界膜)直接相连，在玻璃体基底部、视盘周围、视网膜内表面大血管处，连接尤其牢固。

随着年龄的增长，玻璃体逐渐由凝胶状转变为液态，并收缩、与视网膜内界膜分离，这个过程称为玻璃体后脱离(posterior vitreous detachment，PVD)，通常发生在40岁以上人群。然而，对于近视眼患者，玻璃体后脱离可能会提前发生；某些疾病如糖尿病、Eale’s病、也可导致玻璃体变性、玻璃体后脱离。一般情况下，玻璃体会与视网膜完全分开，但有时，玻璃体与视网膜在某些位点上依然紧紧黏附在一起。这些黏附位点直接介导玻璃体对视网膜的牵引，导致视网膜马蹄形撕裂。除非撕裂的视网膜被修复，否则玻璃体液通过撕裂处渗入视网膜下，引起视网膜脱离，严重威胁患者视力。同时，黏附还可导致视网膜血管破裂、出血并渗入玻璃体内，引起玻璃体混浊。

不完全性玻璃体后脱离对许多玻璃体视网膜疾病都产生重要的影响，如：玻璃体黄斑牵引综合症、玻璃体出血、黄斑裂孔、黄斑水肿、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑病变、视网膜脱离。因此，玻璃体手术的一个重要目的就是将玻璃体从视网膜上剥离下来，防止玻璃体对视网膜的牵引。

为了去除玻璃体，通常要实施玻璃体切割术的显微外科手术：通过显微器械将玻璃体从眼球中去除，同时置换入生理盐水以防止眼球塌陷。这种方法完全依靠操作者经验，也很难将玻璃体后皮质彻底清除干净，而且带有很高的风险性，如引起视网膜瘢痕、撕裂和其它损伤，影响术后视力的恢复。

因此，采用新的方法从视网膜上去除玻璃体成为近年来关注的焦点，其中运用化学物质或酶促进玻璃体液化或诱导玻璃体后脱离，即“药物玻璃体切除术”得到广泛的研究。这些药物包括一些蛋白水解酶，如α-糜蛋白酶、透明质酸酶、细菌来源的胶原蛋白酶、扩散酶、软骨素酶等。然而，现有技术通过动物或临床实验研究证实，上述酶中，大部份都不能诱导完全性的玻璃体后脱离或防止并发症的产生。相反，其中的一些方法导致了严重的副作用，例如：将细菌来源的蛋白酶用于哺乳动物系统引起强烈的免疫反应，导致视网膜增殖性病变，从而产生了视网膜重复脱离；胶原蛋白酶，据报道可液化玻璃体，但同时也显示可破坏视网膜内层结构；α-糜蛋白酶可导致视盘周围和玻璃体出血；扩散酶在注入眼内15分钟后即产生对视网膜内层结构的毒性效应。

基于细菌来源的蛋白酶所产生的免疫反应和毒副作用，采用人源性蛋白酶也许更具有实用价值。纤溶酶是来源于纤溶酶原的一种丝氨酸蛋白酶。纤溶酶原是哺乳动物血液中的一种重要成分。人纤溶酶原是一种由791个氨基酸残基构成的糖蛋白，分子量：92kDa。从肝细胞生成的纤溶酶原带有谷氨酸氨基末端，称为Glu-Plasminogen，经纤溶酶限制性降解Arg₆₈-Met₆₉、Lys₇₇-Lys₇₈或Lys₇₈-Val₇₉位点上的肽键，生成广泛定义的Lys-Plasminogen。纤溶酶激活剂如尿激酶(u-PA)、组织型纤溶酶激活剂(t-PA)通过切割纤溶酶原Arg₅₆₁-Val₅₆₂位的肽键，将其转化为具有酶活性、双链结构形式的纤溶酶。纤溶酶由重链A、轻链B两条肽链组成，两者通过两个二硫键相连；B链含有丝氨酸蛋白酶催化结构域。纤溶酶的丝氨酸蛋白酶催化活性在体内溶解血栓过程中发挥重要的作用。

患者自体的纤溶酶被临床用作玻璃体切割手术的辅助药物或单独用于药物玻璃体切除术。然而，使用纤溶酶存在以下弊端：首先，目前临床使用的纤溶酶都来自于患者自体血浆，分离纤溶酶是一个非常耗时、费力的过程，包括抽血、分离、激活、纯化、热源测试等，价格不菲，去除致病性微生物也使这个过程复杂化；其次，纤溶酶非常容易降解，不能长期存放，只能临时配制；纤溶酶的另一个弊端是它的大分子量：65kDa-82kDa。因此，像如此大的分子从注射至玻璃体内的位置扩散至玻璃体视网膜界面显然要比小分子要慢的多。

视网膜静脉阻塞(Retinal Vein Occlusion，RVO)是仅次于糖尿病视网膜病变的视网膜血管疾病，可引起视力丧失，人群中发病率为0.7％-1.6％。该病病因复杂，临床并发症多样，治疗棘手，为眼科疑难病症之一。RVO的危害主要包括两个方面：一是视网膜缺血缺氧，导致感光细胞和神经细胞的死亡。二是视网膜循环障碍，导致黄斑水肿与血管新生等并发症的产生。目前的系统溶栓疗法虽有一定的治疗效果，但易引起广泛的出血，不易推广。获得FDA批准进入临床使用的溶栓药物都为纤溶酶原激活剂，如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶及其突变体等。其本身不能溶解血栓，需激活纤溶酶原(Plasminogen，Plg)为纤溶酶后才能发挥溶栓作用。由于栓塞局部血流阻断，纤溶酶原无法得到补充，因此用溶栓药物治疗血管再通率不高，并有初始灌注延迟、再栓塞等缺陷。

按组织液向静脉回流的规律，玻璃体内注射rh-μPlm将会进入视网膜静脉，使静脉血栓溶解，血管再通，从而达到治疗效果。

因此，需要采用新的方法来克服纤溶酶用于药物玻璃体切除术，视网膜静脉阻塞以及其它眼科疾病、疾病并发症中的弊端。特别是运用一种比纤溶酶分子量小、扩散快、易于大批量制备、可长期贮存，并可避免交叉污染的药物用于治疗或预防眼科疾病以及疾病并发症。

发明内容

本发明的目的是提供重组人微小纤溶酶原的药物新用途，更具体地，提供重组人微小纤溶酶原在制备防、治眼科疾病药物中的应用。

本发明的重组人微小纤溶酶原具有序列1的cDNA、氨基酸残基序列。

本发明主要是将t-PA激活重组人微小纤溶酶原形成微小纤溶酶后，通过动物实验，将微小纤溶酶用于玻璃体腔内，治疗或预防眼科疾病，所述的眼科疾病，涉及各种原因引起的玻璃体出血、玻璃体内纤维蛋白渗出、不完全性玻璃体后脱离、视网膜静脉阻塞，以及由此引起的视网膜脱离、血管增生、黄斑裂孔、水肿、阻塞性青光眼等并发症。微小纤溶酶快速扩散至玻璃体视网膜界面或视网膜血管内，降解玻璃体后皮质与视网膜内界膜连接处的纤维连接蛋白、层粘蛋白或溶解血栓。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

1.制备微小纤溶酶：重组人微小纤溶酶原、t-PA(Genentech，South San Francisco，California，USA)按所需浓度溶于林格氏液，并以摩尔比200∶1比例进行混合，37℃水浴1小时，还原性SDS-PAGE观察微小纤溶酶原激活比例，并以混合血浆提取的纤溶酶(Sigma，Missouri，USA)为标准，通过底物S2390发色法测定微小纤溶酶活性。

2.动物实验：于实验动物角巩缘1mm处用注射器穿刺前房放液，以防止注入药物后导致眼内压升高，然后于颞下方距角巩缘后2mm处进针，缓慢注入药物，湿棉签按压注射点1分钟，防止药液外流，随即用裂隙灯和间接眼底镜观察有无相关并发症。

3.观察指标：分别于注药前、注药后1天、7天，通过B超、眼部CT、视网膜电图观察玻璃体后脱离、视网膜功能改变。同时将部分动物注射过量戊巴比妥钠处置，取眼球，进行巨体检查，并将球后全层组织固定、制半薄或超薄切片，分别用于HE染色、扫描电镜、透射电镜检测，两个不同观察者单独判断视网膜内表面玻璃体皮质残留情况及视网膜结构有无改变。

4.采用SPSS软件进行数据统计。

本发明实验结果证实，所述的重组人微小纤溶酶原可诱导实验动物新西兰白兔完全性玻璃体后脱离，形成光滑的视网膜内界膜表面，并对视网膜内层结构不产生明显的影响。

附图说明

图1.还原性SDS-PAGE显示t-PA激活重组人微小纤溶酶原

图2.SD大鼠眼扫描电镜结果：2A对照眼视网膜内表面覆盖致密胶原纤维；2B不完全玻璃体后脱离兔眼，内表面有散在的胶原纤维；2C完全性玻璃体脱离兔眼，显示光滑的视网膜内界膜。

图3.SD大鼠眼视网膜全层组织切片HE染色：5A、5B分别为对照眼、1.5IU微小纤溶酶治疗眼，两者视网膜各层结构无明显差别。

图4.SD大鼠眼透射电镜结果：6A对照眼视网膜前玻璃体后皮质的网状结构；6B不完全脱离兔眼视网膜前存在少量絮状胶原纤维；6C 1.5IU微小纤溶酶诱导完全性玻璃体皮质后脱离；6D 1.5IU微小纤溶酶治疗后视网膜神经节细胞无明显异常。

图5.SD大鼠免疫荧光组织化学结果：5A对照眼玻璃体视网膜交界面，纤维连接蛋白(绿色荧光)嵌入含层粘连蛋白(红色荧光)的视网膜内界膜中；5B经扫描电镜证实为完全性玻璃体后脱离的大鼠眼，玻璃体视网膜界面无纤维连接蛋白，而层粘连蛋白依然可见。

图6.兔眼巨检结果：1A对照眼视网膜内表面布满絮状沉积(箭头所指)，用PBS无法冲洗下来；1B不完全性玻璃体脱离兔眼视网膜内表面，局部有絮状沉积(箭头所指)，用PBS无法冲洗下来；1C完全性玻璃体脱离视网膜内表面光滑、无絮状沉积。

图7.兔眼扫描电镜结果：2A对照眼视网膜内表面覆盖致密胶原纤维；2B不完全玻璃体后脱离兔眼，内表面有散在的胶原纤维；2C完全性玻璃体脱离兔眼，显示光滑的视网膜内界膜。

图8.兔眼部B超结果：3A对照眼视网膜至晶状体后界面空间无明显的回声带；3B不完全玻璃体后脱离兔眼，视网膜前可见部分脱离的回声带(箭头所指)；3C完全性玻璃体脱离兔眼，可见一条与视网膜脱离并与视网膜平行的光带，并随眼球运动而前后摆动。

图9.兔眼部CT结果：4A-4C，分别显示未脱离、不完全脱离、完全脱离的玻璃体后皮质。

图10.兔眼视网膜全层组织切片HE染色：5A、5B分别为对照眼、1.5IU微小纤溶酶治疗眼，两者视网膜各层结构无明显差别。

图11.SD大鼠视网膜静脉阻塞模型眼底及造影图：11A-12B正常SD大鼠眼底及造影；11C-11D造模后1小时眼底及造影；11E-11F造模后1天眼底及造影；黑色箭头指激光照射处形成血栓；白色箭头指视网膜血管渗漏处。

图12.造模后视网膜铺片(ADP酶法)：12A正常SD大鼠；12B造模后1天；白色箭头指视网膜静脉；黑色箭头指视网膜动脉。

图13.造模后组织化学图片：13A正常SD大鼠HE染色；13B-13C造模后1天HE染色；13D造模后1天PTAH染色；黑色箭头指阻塞的静脉；白色箭头指神经节细胞。

图14.治疗后7天眼底造影：14A对照眼；14B玻璃体内注射0.03ug rt-PA；14C玻璃体内注射0.04U rh-μPlm；白色箭头指视网膜静脉；黑色箭头指再通的视网膜静脉。

图15.药物处理后7天各组血管再通比率。

图16.治疗后7天组织化学：16A玻璃体内注射0.03ug；16B玻璃体内注射0.04Urh-μPlm；白色箭头指神经节细胞；黑色箭头指视网膜静脉；红色箭头指玻璃体的后界膜。

图17.治疗后7天视网膜铺片(ADP酶法)：17A对照眼；17B玻璃体内注射0.04Urh-μPlm；白色箭头指增殖的血管；黑色箭头指侧支循环。

图18.SD大鼠视网膜透射电镜：18A正常SD大鼠；18B造模后1天；18C BSS治疗后7天；18D 0.04U rh-μPlm治疗后7天；▲指视网膜双极细胞；＊指神经节细胞。

具体实施方式

通过下述实施例对本发明的技术方案作进一步的描述

实施例1重组人微小纤溶酶诱导SD大鼠完全性玻璃体后脱离的实验研究

1.微小纤溶酶的制备：采用毕赤酵母菌株(Invityogen公司)表达重组人微小纤溶酶原，表达产物经纯化、透析、分装至无热源安培瓶中，冷冻干燥，-20℃保存。临用前适量林格氏液溶解，并以摩尔比200∶1比例与组织型纤溶酶原激活剂进行混合，37℃水浴激活1小时，还原性SDS-PAGE观察微小纤溶酶原激活比例，并以混合血浆提取的纤溶酶(Sigma，Missouri，USA)为标准，通过底物S₂₃₉₀发色法测定微小纤溶酶活性。

2.实验动物选择：成年Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体重200g~300g，雌雄不拘，随机分到3个组中，每组20只。所有SD大鼠，统一以左眼用于药物治疗，右眼注射等量林格氏液作为阴性对照。术前30分钟起，2％戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉，1％阿托品滴眼液滴眼，10分钟一次共3次。间接眼底镜检查眼底和玻璃体，排除已有的异常病变后方入选。

3.SD大鼠实验：于角巩缘后1mm处用皮试针穿刺前房放液10μl，以防止注入药物后导致眼内压升高。然后于颞下方距角巩缘后2mm处进针，穿刺方向朝向视乳头，当瞳孔区见到针头后停止进针，缓慢注入药物10μl，针尖开口朝向后极部。注药完毕拔出针头，湿棉签按压注射点1分钟，防止药液外流。随即用裂隙灯和间接眼底镜观察有无相关并发症。1、2、3组分别注射0.01IU、0.02IU、0.03IU微小纤溶酶。

4.观测指标：分别于注药后1天、7天，每组随机抽10只SD大鼠，腹腔注射过量戊巴比妥钠处死，迅速取出眼球，将球后全层组织固定、制半薄或超薄切片，分别用于HE染色、免疫组织化学、扫描电镜、透射电镜检测。两个不同观察者分别判断视网膜内表面玻璃体皮质残留情况及视网膜结构有无改变。

4.1.HE染色：摘除的眼球标本以0.02mol/l磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，在上方角巩缘12点处用逢线做方向标记，在巩膜四个方向切口，迅速浸入固定液(含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛)中，4℃冰箱内固定18小时后，沿角巩缘后3mm小心去除角膜和晶体，用切片刀沿水平方向将眼球一分为二，将其中半个眼球切成长条状全层组织作扫描电镜，再分别留取后极部、基底部，切成2mm×2mm小块作透射电镜，其余部份作HE染色、免疫荧光组织化学。

4.2.抗体准备：第一抗体包括小鼠抗大鼠层粘连蛋白(fibronectin，FN)单克隆抗体(博士德公司，武汉)、兔抗大鼠纤维连接蛋白(lamina，LN)多克隆抗体(博士德公司，武汉)，第二抗体包括羊抗小鼠FITC标记IgG、羊抗兔Cy3标记IgG(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)，均用0.05mol/L磷酸缓冲液(含1％牛血清白蛋白、0.2％叠氮化钠)1∶500倍稀释。

4.3.免疫荧光组织化学：将全层视网膜组织0.02mol/l磷酸盐缓冲液漂洗三次，梯度庶糖脱水过夜，Epon812(Sakura Finetek，Torrance，U.S.A)包埋，切取6μm切片，加入混合第一抗体(包括小鼠抗大鼠层粘连蛋白(fibronectin，FN)单克隆抗体和兔抗大鼠纤维连接蛋白(lamina，LN)多克隆抗体，均1∶500稀释)，4℃冰箱内孵育18小时，恢复至室温，0.02mol/l磷酸盐缓冲液漂洗三次，加入混合第二抗体(包括：FITC标记羊抗小鼠IgG和Cy3标记羊抗兔IgG)，37℃孵育1小时。0.02mol/l磷酸盐缓冲液漂洗三次，荧光显微镜(OLYMP-US-BX61，Tokyo，Japan)观察，拍照。

4.4.扫描电镜检查：样品经1％饿酸固定液固定2小时，乙醇和醋酸正戊醇梯度脱水，HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时，1B-3型离子溅射仪喷镀样品，扫描电镜(Hi tachi S-520，Tokyo，Japan)观察、拍片。两个不同观察者单独判断视网膜内表面玻璃体皮质残留情况及视网膜结构有无改变。

4.5.透射电镜检查：样品经1％饿酸固定液固定2小时，梯度丙酮脱水，Epon618(Sakura Finetek，Torrance，U.S.A)浸透包埋。LKB-1型超薄切片机上切取厚约0.5-1μm的半薄切片，高碘酸液洗去锇酸，1％甲苯胺蓝和1％天青I溶液预染，铜网附贴切片。醋酸铀及构椽酸铅染色，透射电镜(JEM-1200EX)观察，拍照。

4.6.统计处理，采用SPSS 12.0软件进行Pearson’s卡方检验，方差不齐时，采用确切概率法。

5.药效学研究结果：

5.1.还原性SDS-PAGE显示：经t-PA 37℃水浴1小时后，90％以上微小纤溶酶原激活为微小纤溶酶。

5.2.经扫描电镜检测显示：各治疗组玻璃体后皮质残留与对照组比较，都有显著性差异(P＜0.01)；0.03IU微小纤溶酶组与0.01IU微小纤溶酶组相比存在显著的剂量效应关系(P＜0.05)；各组在注药后7天时完全性玻璃体后脱离的眼球皆比注药后1天时增多，但无显著性差别；0.02IU微小纤溶酶注药后1天可诱导60％(6/10)眼球完全性玻璃体后脱离，7天可诱导90％(9/10)眼球完全性玻璃体后脱离；剂量增加至0.03IU未明显增强治疗效果(P＞0.05)。

5.3.组织化学HE染色和透射电镜结果表明：与对照眼相比，各剂量微小纤溶酶均未造成视网膜结构的明显改变，内界膜保存完好。

5.4.免疫荧光组织化学显示：经扫描电镜证实为完全性玻璃体后脱离的大鼠眼，玻璃体视网膜界面无纤维连接蛋白，而构成视网膜内界膜的主要成分层粘连蛋白保持完好，说明内界膜未受到损伤。

表1为对照组、治疗组玻璃体后皮质残留情况比较，其中，

*“++”为未发生玻璃体后脱离，视网膜内表面覆盖致密胶原纤维；“+”为不完全性玻璃体后脱离，视网膜内表面有零星胶原纤维；“-”为完全性玻璃体后脱离，呈现光滑的视网膜内界膜；

各治疗组与对照组玻璃体后皮质残留情况比较。

表1

实施例2重组人微小纤溶酶诱导新西兰白兔完全性玻璃体后脱离实验研究

1.制备微小纤溶酶：同SD大鼠。

2.实验动物选择：成年雄性新西兰白兔48只，体重2.5kg~3.0kg，随机分到3个组中，每组16只。所有动物，统一以左眼用于药物治疗，右眼注射等量林格氏液为阴性对照。术前30分钟起，耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(25-30mg/kg)全身麻醉，1％阿托品滴眼液滴眼，10分钟一次共3次。间接眼底镜检查眼底与玻璃体，排除已有的异常病变后方入选。

3.新西兰白兔眼球内注射：注药方法同SD大鼠，所有新西兰白兔，统一眼前房放液100μl后，左眼注射药物100μl，右眼注射等体积林格氏液。1、2、3组分别注射0.5IU、1.0IU、1.5IU微小纤溶酶。

4.药效学研究：分别于注药后1天、7天，每组随机抽8只新西兰白兔通过眼部B超、CT观察玻璃体后脱离，然后耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死，迅速取出眼球，将球后全层组织固定、制半薄或超薄切片，分别用于HE染色、扫描电镜、透射电镜检测。两个不同观察者分别判断视网膜内表面玻璃体皮质残留情况及视网膜结构有无改变。

4.1.石蜡切片HE染色、扫描电镜、透射电镜检测方法同SD大鼠。

4.2.眼球巨检：摘除的眼球标本以0.02mol/l磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，在上方角巩缘12点处用逢线做方向标记，在巩膜四个方向切口，迅速浸入固定液(含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛)中，用切片刀沿水平方向将眼球一分为二，将其中半个眼球用于巨检：0.02mol/L PBS预先冲洗二至三遍，半个眼球开口朝上，均匀滴加5滴(30μl/滴)曲安奈德至整个视网膜内表面，室温放置20分钟，0.02mol/L PBS冲洗五遍后，观察、拍照。

5.药效学研究结果：

5.1.经扫描电镜检测显示：各治疗组玻璃体后皮质残留与对照组比较，都有显著性差异(P＜0.01)；1.0IU微小纤溶酶组与0.5IU微小纤溶酶组相比存在显著的时间、剂量效应关系(P＜0.05)；1.0IU微小纤溶酶注药后1天可诱导75％(6/8)眼球完全性玻璃体后脱离，7天可诱导100％(10/10)眼球完全性玻璃体后脱离；剂量增加至1.5IU未明显增强治疗效果(P＞0.05)。新西兰白兔眼球巨检、B超检测、扫描电镜检测结果彼此无显著差别(P＞0.05)，而与CT结果皆存在显蓍差别(P＜0.05)。

5.2.组织化学及透射电镜结果显示：与对照眼相比，各剂量微小纤溶酶均未造成视网膜结构的明显改变，内界膜保存完好。

表2.为对照组、治疗组玻璃体后皮质残留情况比较，其中，

＊“++”为视网膜内表面覆盖致密胶原纤维；

“+”为不完全性玻璃体后脱离，视网膜内表面有零星胶原纤维；

“-”为完全性玻璃体后脱离，呈现光滑的视网膜内界膜；

各治疗组与对照组玻璃体后皮质残留情况比较。

表3.为四种检测玻璃体皮质后脱离方法的比较，其中，

*部分兔眼注射药物1天后，降解的胶原纤维使玻璃体混浊，无法清晰观察眼底，绝大多数7天后眼底可见；对于脱离太远的玻璃体后皮质也无法准确判断。

表2

表3.

实施例3重组人微小纤溶酶治疗视网膜静脉阻塞

1.制备微小纤溶酶：采用所构建的壁赤酵母菌株表达重组人微小纤溶酶原，中试研究所得的rh-μPlg纯品经透析、除菌、分装至无热源安培瓶中，冷冻干燥，-20℃保存。临用前适量BSS溶解，并以摩尔比200∶1比例与rt-PA进行混合，37℃水浴激活，还原性SDS-PAGE确定rh-μPlg最适激活时间，并以纤溶酶(Sigma，Missouri，USA)为标准，通过底物S₂₃₉₀发色法测定微小纤溶酶活性，调节rh-μPlg使其激活后的微小纤溶酶浓度分别为2.0、4.0U·ml^-1。

2.实验动物选择：雄性SD大鼠，体重250-300克，购自复旦大学上海医学院动物实验中心，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(240mg·kg^-1体重)麻醉，美多丽滴眼液(0.5％托比卡胺，0.5％盐酸去氧肾上腺素)充分散瞳，倍诺喜(0.4％盐酸奥布卡因)表面麻醉，10分钟一次共3次。裂隙灯、间接检眼镜检查眼底和玻璃体，排除已有的异常病变后方可入选。

3.视网膜静脉阻塞动物模型：利用孟加拉玫瑰红联合氩激光制备视网膜静脉阻塞模型。照射前3分钟，将孟加拉玫瑰红溶液(40mg·kg^-1体重)经大鼠尾静脉注入体内。随后，应用氩激光照射视网膜静脉，在距视盘1-3个视盘距离(PD)范围内，从视网膜静脉远端开始激光，光斑连续排列。激光波长：532nm；能量：100mW；光斑直径：50μm；时间：0.5秒。大鼠有6个视网膜静脉，完全阻塞3个，分布在三个象限内。每处血管平均照射25-30点，直至血流中断，形成一段约1PD的静脉血栓。照射后5分钟，将10％荧光素钠注入大鼠腹腔内(50mg·kg^-1体重)，行眼底荧光造影确认视网膜静脉的阻塞情况，激发光：675nm，490nm观察。每只SD大鼠均左眼进行氩激光照射，如果造影显示视网膜静脉不完全阻塞，或者出现玻璃体出血以及严重的视网膜脱离，则排除本实验，造影显示造模成功的SD大鼠避光饲养12小时。

4.大鼠眼球内注射：SD大鼠造模成功后1天，3％戊巴比妥钠常规全身麻醉，美多丽滴眼液(0.5％托比卡胺，0.5％盐酸去氧肾上腺素)充分散瞳，倍诺喜(0.4％盐酸奥布卡因)表面麻醉同前。间接眼底镜、眼底荧光造影确认视网膜静脉未发生再通，并记录、拍照注药前眼底情况。将造模成功的SD大鼠40只随机分为4组，每组10只大鼠。每只SD大鼠左眼注射药物10μl，右眼不进行处理。

注药前于角巩缘处穿刺放液10μl，以防止注入药物后导致眼内压升高。然后于颞下方距角巩缘后1mm处以自制30gauge针头的注射器进行穿刺，穿刺方向朝向视乳头，当瞳孔区见到针头后停止进针，缓慢注入10μl药物，针尖开口朝向后极部。注药完毕停留10秒后再拔出针头，湿棉签按压注射点1分钟，防止药液外流。

第1组SD大鼠注射平衡盐溶液(BSS)；第2组注射0.03μgrt-PA；第3组注射0.015μgrt-PA激活的微小纤维蛋白溶酶0.02U；第4组注射0.03μgrt-PA激活的μPlm 0.04U。

5.观测指标：

(a)眼科常规检查及荧光造影：注药后随即用裂隙灯和眼底镜检查眼部情况，排除注药引起的眼部损伤。此后1天、7天再各进行一次眼部检查。所有大鼠于注药后7天，进行眼底血管荧光造影，观察视网膜静脉再通及眼底变化情况。

(b)组织化学检查：于注药前、注药后7天，每组各随机取1只大鼠，3％戊巴比妥钠常规全身麻醉，打开鼠胸腔，暴露心脏，用灌注针头刺入左心室同时用显微剪刀剪开右心房先用生理盐水灌注约2-3分钟，然后灌注4％多聚甲醛溶液约5分钟。迅速摘除眼球，0.02M PBS漂洗，在上方角巩缘12点处用逢线做方向标记，清理眼球表面组织后，在巩膜四个方向切口，迅速浸入固定液(4％多聚甲醛)中，4℃冰箱内固定20小时后，沿睫状体扁平部剪除角膜，晶体，去除玻璃体，选择后极部及周边部视网膜及血管组织、视网膜静脉血栓处，切成4mm×5mm的材料，0.02M PBS漂洗，制5μm切片，分别进行HE、PTAH染色。

(c)视网膜铺片(ADP酶染色法)：同样于注药前和注药后7天，每组各随机取1只大鼠。3％戊巴比妥钠常规全身麻醉、心脏灌注同前。摘除眼球固定于4％多聚甲醛溶液中，4℃过夜。在鼠眼球的角膜缘后约1mm沿角膜缘环行剪开，去除角膜，取出晶状体，以视乳头为中心作4-5个放射状切开，去除巩膜、脉络膜，用毛笔扫除视网膜外层的色素上皮。用浓度为0.05M、pH为7.2的Tris-马来酸缓冲液冲洗5次，每次15分钟。于37℃反应液(0.2M、PH为7.2的Tris-马来酸缓冲液中加入3mmol·L^-1硝酸铅、6mmol·L^-1氯化镁、1mg·mL^-1ADP)中孵育15分钟后，0.05M、PH为7.2的Tris-马来酸缓冲液冲洗5次，每次15分钟。0.2％硫化铵反应1分钟。0.05M、PH为7.2的Tris-马来酸缓冲液冲洗3次，每次5分钟后甘油明胶封片。

(d)透射电镜观察：在组织化学检测查样本处理的同时，留取阻塞血管周边视网膜组织进行透射电镜检查。

(e)统计处理：采用SPSS 12.0软件进行Pearson卡方检验，单格样本数不足时，采用Fisher确切概率法。

6.药效学研究结果：

6.1SD大鼠视网膜静脉阻塞动物模型的建立

6.1.1眼底观察及视网膜血管造影

眼底观察可见正常SD大鼠视网膜血管清晰，动脉细而直，静脉粗稍有弯曲(图11A)。所有血管血液畅通，血管造影显示造影剂灌注正常(图11B)。通过大鼠尾静脉注射孟加拉玫瑰红，氩激光照射视网膜静脉，至照射部位发白、血液中断。于造模后1小时，眼底镜及视网膜血管造影观察到视网膜静脉有1-2DP长度的血液阻断(图11C，11D)。1天后阻塞部位远端血管痉挛、扭曲，周边组织视网膜水肿混浊，有明显的视网膜出血(图1E)。血管造影显示荧光造影剂在阻塞处突然中断或灌注延迟，在该处管壁有荧光渗漏(图11F)。

6.1.2视网膜铺片(ADP酶法)

将视网膜剥离后铺片，采用ADP酶法对SD大鼠视网膜血管进行显影，视网膜动脉细而直，呈树枝状，静脉稍粗，分支少，着色较浅(图12A)。与正常SD大鼠视网膜相比，视网膜静脉阻塞1天后无明显的血管增生(图12B)。

6.1.3组织化学检测

与正常SD大鼠视网膜(图13A)相比，视网膜静脉阻塞SD大鼠造模后1天，可见静脉血管内血栓形成，其中包含较多的红细胞、血小板以及网状纤维，经PTAH特殊染色后证实：血栓中含有较高纤维蛋白成份。阻塞血管周边的节细胞层结构紊乱，神经节细胞与内板层相脱离而与内界膜相连。分析原因为静脉阻塞后导致视网膜水肿，缺血、缺氧后周边组织自溶(图13B-13D)。

6.2微小纤溶酶溶栓效果

6.2.1眼底观察和视网膜血管造影

造模后1天的SD大鼠玻璃体内注射BSS 7天时，87.5％眼视网膜血管未发生再通，眼底观察有大面积的视网膜出血，其中4眼发生了视网膜脱离，3眼并发了增生性青光眼。造影显示阻塞静脉无荧光灌注，而周边血管受血流增加的影响有明显的增粗、扭曲、侧支循环形成、血管通透性增高，荧光渗漏严重(图14A)。0.03μgrt-PA治疗眼有75％眼未发生再通，其中2眼发生了视网膜脱离，3眼并发了增生性青光眼。眼底观察视网膜出血均较治疗前明显增加，但较对照眼少，荧光渗漏也较少(图14B)。0.02U、0.04U μPlm治疗组的再通率分别为37.5％、75％，与对照组相比，三者具有量效关系(p＜0.05)(图15)，此外也有1眼并发青光眼。造影显示阻塞的血管有荧光灌注，部分血管灌注延迟，荧光渗漏明显较少(图14C)。

6.2.2组织化学检测

玻璃体内注射BSS后7天，SD大鼠视网膜血管无明显的再通，阻塞血管周围组织自溶，节细胞层严重破坏，并与内板层脱离。神经节细胞脱落，并通过崩解的内界膜进入到玻璃体腔内，视网膜内层组组织结构相对稳定(图16A)。而注射玻璃体内注射0.04U μPlm后7天，再通后的血管周边组织水肿消失，节细胞复位，并可见与视网膜脱离的玻璃体后界膜(图16B)。

6.2.3视网膜铺片(ADP酶法)

对照眼在注药后7天，阻塞视网膜静脉有血管新生，并与视网膜动脉相连，动静脉吻合，形成侧支循环(图17A)。0.04U μPlm治疗眼阻塞血管周边新生血管较少(图17B)。

6.2.4透射电镜观察

对正常及造模后1天的SD大鼠阻塞血管周边的视网膜内层细胞结构进行透射电镜观察后发现：造模后1天后，双极细胞、神经节细胞发生自溶，胞浆内线粒体、内质网结构破坏，但细胞膜、核膜较完整，未发生核浓缩(图18A，18B)。治疗后7天，对照组神经节细胞胞浆自溶，出现大面积空区，0.02U μPlm治疗组神经节细胞也有部分自溶，但稍轻(图18C，18D)。

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>重组人微小纤溶酶原在制备防、治眼科疾病药物中的应用

<130>0651-1-C10809

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>重组人微小纤溶酶原(recombinant human microplasminogen)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(786)

<400>1

aaa ctt tac gac tac tgt gat gtc cct cag tgt gcg gcc cct tca ttt

48

Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe

1               5                   10                  15

gat tgt ggg aag cct caa gtg gag ccg aag aaa tgt cct gga agg gtt

96

Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val

            20                  25                  30

gtg ggg ggg tgt gtg gcc cac cca cat tcc tgg ccc tgg caa gtc agt

144

Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser

        35                  40                  45

ctt aga aca agg ttt gga atg cac ttc tgt gga ggc acc ttg ata tcc

192

Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser

    50                  55                  60

cca gag tgg gtg ttg act gct gcc cac tgc ttg gag aag tcc cca agg

240

Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg

65                  70                  75                  80

cct tca tcc tac aag gtc atc ctg ggt gca cac caa gaa gtg aat ctc

288

Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu

                85                  90                  95

gaa ccg cat gtt cag gaa ata gaa gtg tct agg ctg ttc ttg gag ccc

336

Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro

            100                 105                 110

aca cga aaa gat att gcc ttg cta aag cta agc agt cct gcc gtc atc

384

Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile

        115                 120                 125

act gac aaa gta atc cca gct tgt ctg cca tcc cca aat tat gtg gtc

432

Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val

    130                 135                 140

gct gac cgg acc gaa tgt ttc atc act ggc tgg gga gaa acc caa ggt

480

Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly

145                 150                 155                 160

act ttt gga gct ggc ctt ctc aag gaa gcc cag ctc cct gtg att gag

528

Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu

                165                 170                 175

aat aaa gtg tgc aat cgc tat gag ttt ctg aat gga aga gtc caa tcc

576

Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser

            180                 185                 190

acc gaa ctc tgt gct ggg cat ttg gcc gga ggc act gac agt tgc cag

624

Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln

        195                 200                 205

ggt gac agt gga ggt cct ctg gtt tgc ttc gag aag gac aaa tac att

672

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile

    210                 215                 220

tta caa gga gtc act tct tgg ggt ctt ggc tgt gca cgc ccc aat aag

720

Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys

225                 230                 235                 240

cct ggt gtc tat gtt cgt gtt tca agg ttt gtt act tgg att gag gga

768

Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly

                245                 250                 255

gtg atg aga aat aat taa

786

Val Met Arg Asn Asn

            260

<210>2

<211>261

<212>PRT

<213>重组人微小纤溶酶原(recombinant human microplasminogen)

<400>2

Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe

1               5                   10                  15

Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val

            20                  25                  30

Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser

        35                  40                  45

Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser

    50                  55                  60

Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg

65                  70                  75                  80

Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro

            100                 105                 110

Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile

        115                 120                 125

Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val

    130                 135                 140

Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly

145                 150                 155                 160

Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu

                165                 170                 175

Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser

            180                 185                 190

Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln

        195                 200                 205

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile

    210                 215                 220

Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys

225                 230                 235                 240

Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly

                245                 250                 255

Val Met Arg Asn Asn

            260