猪颗粒型冻精的制备及解冻方法

摘要

一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法，方法的步骤为：猪精液的采集和常规检查、稀释液的配制、精液的稀释与平衡、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻。本发明还涉及所述稀释液及解冻液的配制。与已有的技术相比，本发明的优点在于：鲜精经水浴平衡后直接离心，不用加入其它稀释液，减少操作步骤，降低成本；冻精的颗粒剂型操作简单，取用方便；解冻液配方简单，易得，能起到精液解冻和解冻后保存的作用，精液解冻后的存活时间不低于420min。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法。

背景技术

精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要的作用。使用冷冻精液可以不受时间、地域和公畜寿命的限制，减少公畜饲养数量，减低生产成本，提高优良种畜的利用率，为畜牧业生产带来巨大的经济效益。同时，精液的冷冻保存在品种改良、血缘更新、疾病控制和濒危动物品种保护上也具有极其重要的意义。

猪精液冷冻技术，从20世纪50年代开始以来，进展缓慢，在发达国家猪冻精技术已基本可以应用于养猪业生产，但从世界范围内看，猪冻精技术的应用还不够理想。该技术在我国猪的研究起步较晚，于1974年由广西壮族自治区畜牧研究所首先研究成功。我国大规模开展猪冻精技术研究始于七十年代，但由于效果不稳定、平均妊娠率较低(45％～50％)，始终未能在生产上推广应用。主要问题是：冷冻液、解冻液的组成不一致，输精量大，受精率和产仔数比鲜精低，操作程序复杂，难以在生产中推广应用。同时，由于猪精液冷冻具有潜在的巨大商业价值和重要的现实意义，因此，目前猪精液冷冻仍是动物繁殖领域内研究的热点。

发明的内容

本发明的目的是提供一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法。

为了实现本发明的目的，本发明的猪颗粒型冻精的制备及解冻方法包括以下步骤：

1、猪精液的采集和常规检查：

采精前，先用0.1％高锰酸钾溶液擦拭公猪腹部，手握法采集猪富含精子段精液于盖有四层消毒纱布的集精杯中。将采得猪精液于30分钟内带回实验室，观察精液为乳白色，呈云雾状，嗅之略带腥味，镜检活率为0.7以上者，可用于冷冻保存。

2、稀释液的配制：

由葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、蔗糖0.5～4.0g、SDS0.1～0.5g、咖啡因0.0097～0.1554g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸馏水100ml配制成基础液，取80ml所述基础液加入20ml卵黄构成稀释液I液，在100mlI液中加入3ml的甘油为稀释液II液，所有液体配好后保存在0～4℃备用；

3、精液的稀释与平衡：

将经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35℃水浴中预孵育30～60分钟后，以1000转/分离心10分钟，弃上清液，按1∶1体积比加入稀释液I液，混匀，使重悬浮的精子密度达(4～7)×10⁹个/ml；用8层纱布将稀释精液包裹好并放入4℃冰箱平衡2h；平衡结束后，再以1∶1加入稀释液II液(基础液+20％卵黄+3％甘油)，充分混匀，再于4℃冰箱继续平衡2h；

4、精液的冷冻和保存：

平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有凹窝的氟板放入盒内，距液氮面2～3cm，调节氟板温度为-130℃～-120℃，每个凹窝滴入0.1ml精液，迅速滴冻，氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5～8min后，将氟板连同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋放入液氮内预冷，然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中，冻精颗粒的收集过程必须在液氮中进行；冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上标签，记录好精液的相关信息，然后移入液氮罐长期保存；

5、冷冻精液的解冻：

1)、解冻液的配置：葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.5g、安钠咖(10％)5ml、青霉素80000IU、链霉素100000IU及蒸馏水100ml；

2)、解冻方法：将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留20s后迅速放入42℃水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的充分混合。解冻液的添加量为1ml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。

6、冷冻精液的品质评定方法和判定指标

精液解冻后，对其进行活力、顶体完整率、弯尾率、畸形率、复苏率及存活时间的检测，综合评价其质量。具体操作如下：

1)、活力检测

精液解冻后，置于室温下放置3～5分钟，取50ul精液滴于37℃预热的载玻片上，迅速盖上盖玻片，在显微镜下观察呈直线运动的精子所占百分率。解冻后的活率不低于0.52。

2)、顶体完整率

精子解冻后的顶体完整率主要采用考马斯亮蓝染色法评定。经考马斯亮蓝染色后的精子呈蓝色着染，顶体不完整或缺失的精子其顶体部不着色，如图3，图4-1和4-2所示。在1000×油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个精子，计算精子顶体完整率＝顶体完整的精子数/计数总精子数。

3)、畸形率

精子解冻后畸形率主要采用用凡那他氏镀银染色法进行评定。如图1-1、1-2、1-3所示为正常精子；图2-1、2-2、2-3、2-4所示为畸形精子。将制作好的标本置1000×油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个精子，计算精子畸形率＝畸形精子数/计数总精子数。

4)、弯尾率

用低渗肿胀实验测定解冻精子的弯尾率，即可检测精子的质膜完整率。将精液与低渗液以1∶30的比例稀释后，置37℃水浴中孵育30～60min。取50ul低渗精液滴于血细胞计数板上，计数5个中方格中的精子总数和弯尾精子数，两个计数室的结果相加计算平均数。弯尾率＝弯尾数子数/计数总精子数。

5)、存活时间

将解冻后的精液放入37℃水浴锅中，每间隔一个小时观测一次活率，当活率下降到一半时，每隔0.5h检查一次，直至活率为零，存活时间不低于420min。

与已有的技术相比，本发明的优点在于：

1.鲜精经水浴平衡后直接离心，不用加入其它稀释液，减少操作步骤，降低成本；

2.冻精的颗粒剂型操作简单，取用方便；

3.顶体完整与否是精子能否受精的关键因素，传统的顶体染色方法杂质较多，样本检查看得不太清楚，采用考马斯亮蓝染色能克服这一问题，且操作简单方便。

4.解冻液配方简单，易得，能起到精液解冻和解冻后保存的作用，精液解冻后的存活时间不低于420min。

附图说明

图1-1、1-2、1-3解冻后在1000倍油镜下观察的正常精子；

图2-1、2-2、2-3、2-4分别为解冻后在1000倍油镜下观察的畸形精子；

图3为解冻后在1000倍油镜下观察的顶体完整精子；

图4-1和4-2为解冻后在1000倍油镜下观察的顶体部分和全部脱落精子。

具体实施方式

实施例1颗粒型冻精的制备

1、猪精液的采集和常规检查：采精前，先用0.1％高锰酸钾溶液擦拭公猪腹部，手握法采集猪富含精子段精液于盖有四层消毒纱布的集精杯中。将采得猪精液于30分钟内带回实验室，观察精液为乳白色，呈云雾状，嗅之略带腥味，镜检活率为0.7以上者，可用于冷冻保存。

2、稀释液的配制：葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、蔗糖1.5g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、SDS 0.25g、咖啡因0.0971g、溶于100ml蒸馏水中为基础液，青霉素和链霉素各1000IU/ml。取80ml基础液并加入20ml卵黄为I液，在100mlI液中加入3ml的甘油为II液。所有液体配好后保存在0～4℃备用。

3、精液的稀释与平衡：经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35℃水浴中预孵育30～60min后，以1000转/分离心10min，弃上清液，按1∶1加入稀释液I液(基础液+20％卵黄)，混匀，使重悬浮的精子密度达(4～7)×10⁹个/ml。用8层纱布将稀释精液包裹好并放入4℃冰箱平衡2h；平衡结束后，再以1∶1加入II液(基础液+20％卵黄+3％甘油)，充分混匀，再于4℃冰箱继续平衡2h。精液最终稀释比例为1∶3。

4、精液的冷冻和保存：平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有凹窝的氟板放入盒内，距液氮面2～3cm，调节氟板温度为-130～-120℃。每个凹窝滴入0.1ml精液，迅速滴冻。氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5～8min后，将氟板连同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋放入液氮内预冷。然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中。冻精颗粒的收集过程必须在液氮中进行。冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上标签，记录好精液的相关信息。制备完成，移入液氮罐长期保存。

实施例2  冷冻精液的解冻

1、解冻液的配方：葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.5g、安钠咖(10％)5ml、青霉素和链霉素各100000IU、蒸馏水100ml。

2、解冻方法：将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留20s后迅速放入42℃水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的充分混合。解冻液的添加量为1ml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。

实施例3  冷冻精液的品质评定方法和判定指标

精液解冻后，对其进行活力、顶体完整率、弯尾率、畸形率、复苏率及存活时间的检测，综合评价其质量。具体操作如下：

1、活力检测

精液解冻后，置于室温下放置3～5分钟，取50ul精液滴于42℃预热的载玻片上，迅速盖上盖玻片，在显微镜下观察呈直线运动的精子所占百分率。解冻后的活率不低于0.52。

2、顶体完整率

精子解冻后的顶体完整率主要采用考马斯亮蓝染色法评定。具体操作如下：

(1)溶液的配制

A.称取50mg考马斯亮蓝R250溶于蒸馏水100ml中，煮沸溶解，0.45μm滤膜过滤。

B.加入高氯酸3.5ml

(2)染色步骤：

A.染色前，先将染液置于37℃水浴锅中预热10min；

B.取50ul解冻精液，滴于载玻片上，抹片、风干；

C.将精子涂片置于考马斯亮蓝-高氯酸染色液中浸染5～7min；染色后涂片用自来水冲洗后吹干、封片，镜检。

(3)顶体完整率检查

经考马斯亮蓝染色后的精子呈蓝色着染，顶体不完整或缺失的精子其顶体部不着色。如图3，图4-1和4-2所示。

在1000×油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个精子，计算精子顶体完整率＝顶体完整的精子数/计数总精子数。

3、畸形率

精子解冻后畸形率主要采用用凡那他氏镀银染色法进行评定，如图1-1、1-2、1-3所示为正常精子；图2-1、2-2、2-3、2-4所示为畸形精子。具体操作如下：

(1)染色液的配制

A.胡氏固定液：福尔马林2ml、醋酸1ml、蒸馏水100ml；

B.染色液：单宁酸5g、石炭酸1g、蒸馏水100ml；

C.硝酸银溶液：硝酸银0.25g、蒸馏水100ml

(2)染色步骤：

A.取50ul解冻精液，滴于载玻片上，抹片，风干后，将胡氏固定液滴于玻片上，停1min，自来水冲洗10s，滴干水分；

B.将染色液滴于玻片上，置酒精灯上加热至玻片上出现蒸汽为止，自来水冲洗30s，滴干水分；

C.滴2～3滴硝酸银溶液于玻片上，同时滴加一滴氨水，左右摇晃玻片，使硝酸银溶液与氨水充分混合，染液变为浑浊的黄褐色后，置酒精灯上慢慢加热，经20～30s。

D.最后用自来水冲洗干净，风干，镜检。

(3)畸形率检查

在1000×油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个精子，计算精子畸形率＝畸形精子数/计数总精子数。

4、弯尾率

用低渗肿胀实验测定解冻精子的弯尾率，即可检测精子的质膜完整率。

(1)低渗溶液的配制：果糖0.6756g、二水柠檬酸钠0.3676g，溶于50ml双蒸水中。最终渗透压150mosm/kg

(2)操作步骤：将精液：低渗液为1∶30的比例稀释后，置37℃水浴中孵育30～60min。

(3)弯尾率检查

取50ul精液滴于血细胞计数板上，计数5个中方格中的精子总数和弯尾精子数，两个计数室的结果相加计算平均数。弯尾率＝弯尾数子数/计数总精子数

5.存活时间

将解冻后的精液放入42℃水浴锅中，每间隔一个小时观测一次活率，当活率下降的一半时，每隔0.5h检查一次，直至活率为零，存活时间不低于420min。

实施例4

实施例1中稀释液的配制不同之处在于：

稀释液的配方为葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、蔗糖3.0g、SDS 0.2g、咖啡因0.0388g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸馏水100ml。

实施例5

实施例1中稀释液的配制不同之处在于：

稀释液的配方为葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、蔗糖1.5g、SDS 0.25g、咖啡因0.0188g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸馏水100ml。