酵母菌混合发酵乳清生产燃料乙醇的方法

摘要

一种利用乳清生产燃料乙醇的方法，特别是涉及马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母混合发酵及其固定化发酵乳清生产燃料乙醇的方法，以缩短乳清发酵周期，提高底物利用率。本发明以现有的酵母菌株为基础，通过液体培养、细胞固定化、增殖培养、发酵(混合发酵、混合固定化发酵和固定化串连发酵)等技术手段，可以使酵母菌利用乳清发酵生产燃料乙醇的周期缩短为48小时，酒精度达到5.0％(V/V)，底物利用率为98.2％，与单一马克斯克鲁维酵母发酵比较，发酵周期缩短50％，出酒率提高31.6％。

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种利用乳清生产燃料乙醇的方法，特别是涉及两株酵母菌种的混合发酵及其固定化发酵乳清生产燃料乙醇的方法。

【背景技术】：乳清是生产干酪、干酪素等的副产品，是制造上述产品时从牛乳中分离出来的液体部分。乳清具有较高的营养价值，其含有牛奶营养成分的55％(w/w)，主要包括乳糖、蛋白质、矿物质和多种维生素等。目前，世界上尚有一半左右的乳清未被利用被排放掉，由于乳清中乳糖含量较高，消耗水中的溶解氧，污染力要比城市一般污水的污染力大100倍。因此合理的开发利用乳清资源已经成为亟待解决的问题。

乳糖是一种二糖，需要在乳糖酶的作用下分解为葡萄糖和半乳糖才能被生物所利用。一般的酿酒酵母菌由于细胞中缺少乳糖酶，无法直接利用乳清中的乳糖。已知能够发酵乳糖的酵母菌主要集中在克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和假丝酵母属(Candida)等。这两个属的部分酵母菌可以利用乳糖，但是它们在生产酒精方面的一些特性不如酿酒酵母，存在发酵周期长，糖残留量高和发酵酒精度不高等问题。目前工业上乳清主要被加工成乳清饮料、乳清粉、乳清膏、乳清蛋白、乳清浓缩物和乳清蛋白粉等，还没有大规模利用乳清生产燃料乙醇的工业化生产。

【发明内容】：本发明的目的是提供一种利用乳清生产燃料乙醇的新方法，解决利用乳清发酵酒精不彻底、糖残留量高和酒精得率低等问题。本发明涉及的一种高效利用乳清生产酒精的方法，以缩短乳清发酵周期，提高乳清的利用率和发酵酒精度，减少对环境的污染，为生产燃料乙醇提供一个潜在资源，并为开发利用乳清资源提供一个较好的解决办法。

为实现本发明的目的，采用了如下的技术方案，该方法包括以下步骤：

1).将马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母分别接种于液体培养基(YEPD培养基)中，进行种子培养。

2).直接混合酵母发酵：将获得的两种酵母菌(马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母)液体种子按一定比例(比例为3∶1至1∶3)和间隔时间(时间为0至12小时)分别接入发酵培养基中(发酵培养基配方为：乳清粉12％，其中乳糖含量100.2g/L，pH6.0，110℃，20min灭菌)进行混合发酵生产燃料乙醇。

或

3).混合固定化发酵：将液体培养获得的两种酵母菌种子按一定比例混合后固定化，并对固定化酵母凝胶粒子进行增殖培养(增殖培养基为YEPD液体培养基)，然后将培养好的固定化混合酵母凝胶粒子接入发酵培养基中发酵生产燃料乙醇。

a).将两种酵母菌种子按一定比例混合后(比例可以为3∶1至1∶3)，与3.0％海藻酸钠混合均匀(海藻酸钠溶液用蒸馏水加热溶解配制)形成海藻酸钠-酵母菌悬液。

b).配制2mol/L氯化钙溶液置于温度为20℃的水浴锅中恒温，用注射器(配有6#注射针头)将海藻酸钠-酵母菌悬液点滴滴入氯化钙溶液中造粒，并恒温维持1小时，使酵母充分固定化，静置10小时后制成凝胶粒子。

c).倾去上清液，用蒸馏水冲洗固定化酵母一次，然后重新置0.05mol/L的氯化钙溶液中平衡24小时后，备用。

d).在接入增殖培养基之前用0.85％生理盐水冲洗固定化酵母一次。将制备好的固定化酵母凝胶粒子接入到增殖培养基中，30℃活化24小时，进行固定化酵母的增殖培养。

e).将增殖培养后的共固定化酵母凝胶粒子以10％的接种量填充到玻璃柱式反应器，接入发酵培养基中，发酵生产燃料乙醇。

或

4).串连固定化发酵：将获得的两种酵母菌液体培养种子分别进行固定化和固定化种子增殖培养，再将增殖培养后的两种固定化酵母种子分别接入两个玻璃柱反应器中进行串连固定化发酵生产燃料乙醇。

a).将两种酵母菌液体种子按体积比为3∶1至1∶3的比例分别固定化。

b).将两种制备好的固定化酵母凝胶粒子分别接入增殖培养基中，30℃增殖培养24小时。

c).将两种增殖培养好的固定化酵母凝胶粒子分别装入两个玻璃反应柱中，乳清发酵培养基先进入固定化马克斯克鲁维酵母反应柱(图一A柱)，进满后停止进料，先发酵培养0至12小时后再继续进料，并顺流至固定化酿酒酵母反应柱(图一B柱)进行燃料乙醇发酵。

在上述生产燃料乙醇的方法中：

所用的酵母菌为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，TY-13)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，AY-5)，均为实验室保存菌株。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供的利用乳清生产燃料乙醇的方法，以马克斯克鲁维酵母菌株与酿酒酵母菌株为基础，通过液体培养、细胞固定化、增殖培养，结合混合发酵技术和固定化技术，可以使酵母菌利用乳清发酵生产燃料乙醇的周期缩短，提高底物利用率和发酵酒精度。

【附图说明】：

图1是串连固定化发酵装置示意图。

其中，1三角瓶，2蠕动泵，3玻璃柱，4进料口，5取样口，6溢流口，7出料口。玻璃柱式反应器A和B容积均为2000mL，H/D＝4.0。

【具体实施方式】：

实施例1：马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵乳清生产燃料乙醇

1、将马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母接种于液体培养基中，进行液体种子的培养。

2、将获得的两种酵母菌(马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母)液体种子按照体积比为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3和间隔时间(两种酵母加入时间间隔，先加入马克斯克鲁维酵母液体种子发酵培养0、1、2、3、6、12小时后加入酿酒酵母液体种子)分别接入发酵培养基中进行混合发酵生产燃料乙醇。

            表1混菌发酵与单一酵母发酵比较

  科目  酒精度(v/v％) 残糖(g/100mL) 发酵周期(小 时)  底物利用率  混菌发酵  单一酵母  4.6  3.8  0.23  0.58  88  96  97.70％  94.20％

注：单一酵母指克鲁维酵母，接种量为10％。

表2混合酵母发酵菌株比例

 菌株比例(马克斯克鲁 维酵母∶酿酒酵母)  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL) 发酵周期(小 时)  3∶1  2∶1  1∶1  1∶2  1∶3  4.3  4.4  4.5  4.2  4.0  0.355  0.285  0.241  0.410  0.480  88  88  88  88  88

表3混菌接种时间间隔(比例1∶1)

  培养时间(小时)  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  发酵周期(小时)  0  1  2  3  6  10  12  4.4  4.4  4.5  4.6  4.4  4.3  4.2  0.271  0.285  0.259  0.230  0.295  0.385  0.420  88  88  88  88  88  88  88

实验结果见表1、表2和表3，结果表明：在以两种酵母比例1∶1，先加入马克斯鲁维酵母培养3小时后加入酿酒酵母，进行混合发酵生产燃料乙醇时，酒精度为4.6％v/v，发酵周期88小时，残糖值为0.23g/100mL。与单一克马克斯鲁维酵母发酵比较，发酵周期缩短8小时，酒精产量提高21.05％。实施例2：马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母共固定化发酵乳清生产燃料乙醇

1、将培养好的克鲁维酵母和酿酒酵母种子液以体积比3∶1至1∶3混合后，再与3.0％海藻酸钠混合均匀(海藻酸钠溶液用蒸馏水加热溶解配制)形成海藻酸钠-酵母菌悬液。

2、配制2.0mol/L氯化钙溶液30mL置于温度为20℃的水浴锅中恒温，用注射器(配有6#注射针头)将海藻酸钠-酵母菌悬液点滴滴入氯化钙溶液中造粒，并恒温维持1小时，使酵母充分固定化。倾去上清液，用蒸馏水冲洗固定化酵母一次，然后重新置0.05mol/L的氯化钙溶液中平衡24小时后，备用。在接入增殖培养基之前用0.85％生理盐水冲洗固定化酵母一次。

3、将制备好的共固定化酵母凝胶粒子接入增殖培养基中，30℃活化24小时。

4、将增殖后共固定化的马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母，以10％的接种量接入发酵培养基中进行燃料乙醇发酵，发酵温度为30℃。

实验结果见表4、表5和表6，结果表明：马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母比例为1∶1进行共固定化发酵生产燃料乙醇时，酒精度达到4.8％v/v，发酵周期60小时，残糖0.21g/100mL，固定化酵母可连续重复使用8个批次。共固定化混菌发酵与单一固定化克鲁维酵母发酵比较，发酵周期缩短12小时，酒精产量提高6.7％。

          表4共固定化混菌发酵与单一固定化酵母发酵比较

  科目  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  发酵周期  底物利用率  共固定化混菌发酵  单一固定化酵母  4.8  4.3  0.21  0.44  60  72  97.90％  95.60％

注：单一固定化酵母是固定化克鲁维酵母，接种量为10％。

                    表5共固定化酵母发酵菌株比例

 菌株比例(马克斯克鲁 维酵母∶酿酒酵母) 酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  发酵周期(小  时)  3∶1  2∶1  1∶1  1∶2  1∶3  4.4  4.5  4.8  4.2  4.0  0.265  0.260  0.210  0.425  0.510  60  60  60  60  60

            表6共固定化混菌发酵稳定性试验(菌株比例1∶1)

  代数(每代60小时)  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  颗粒情况  1  2  4  8  9  10  4.8  4.8  4.7  4.5  3.8  3.2  0.210  0.224  0.255  0.365  0.580  0.980  颗粒完好，弹性好  颗粒完好，弹性好  颗粒完好，弹性好  颗粒较好，弹性较好  颗粒有破损，弹性较差  较多颗粒破损，无弹性

实施例3：固定化马克斯克鲁维酵母与固定化酿酒酵母串连发酵乳清生产燃料乙醇

1、将两种酵母菌液体种子按体积比为3∶1至1∶3的比例分别固定化。

2、将两种制备好的固定化酵母凝胶粒子分别接入增殖培养基中，30℃增殖培养24小时。

3、将两种增殖培养好的固定化酵母凝胶粒子分别装入两个玻璃反应柱中，乳清发酵培养基先进入固定化马克斯克鲁维酵母反应柱(图一A柱)，进满后停止进料，先发酵培养0至12小时后再继续进料，并顺流至固定化酿酒酵母反应柱(图一B柱)进行燃料乙醇发酵。

柱A与柱B固定化酵母不同比例的实验结果见表7，柱A单独发酵培养不同时间的实验结果见表8，结果表明：柱A(马克斯克鲁维酵母)与柱B(酿酒酵母)固定化酵母最适比例为1∶1，柱A单独发酵培养的最适时间为3小时，在此条件下，平均停留时间48小时，酒精度达5.0％(V/V)，残糖值为0.18g/100mL。

                   表7固定化酵母串连发酵菌株比例

 菌株比例(马克斯克鲁 维酵母∶酿酒酵母)  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  平均停留时  间(小时)  3∶1  2∶1  1∶1  1∶2  1∶3  4.5  4.7  4.8  4.5  4.3  0.300  0.290  0.220  0.315  0.425  48  48  48  48  48

                表8柱A单独发酵培养时间(菌株比例为1∶1)

  培养时间(小时)  酒精度(v/v％)  残糖(g/100mL)  平均停留时间(小  时)  0  1  2  3  6  10  12  4.7  4.7  4.8  5.0  4.2  3.8  3.8  0.290  0.280  0.255  0.180  0.405  0.680  0.680  48  48  48  48  60  72  72