在哺乳动物宿主细胞中高水平表达重组抗体

摘要

本发明涉及以高水平表达重组抗体的哺乳动物宿主细胞，该宿主细胞包含具有基因优化的编码抗体重链和轻链的核苷酸序列的双基因载体，并涉及所述双基因载体自身和提高哺乳动物宿主细胞中重组抗体产量的方法。

说明书

本发明涉及以高水平表达重组抗体的哺乳动物宿主细胞，其中所述宿主细胞包含 具有基因优化的编码抗体重链和轻链的核苷酸序列的双基因载体，并涉及所述双基 因载体自身和提高哺乳动物宿主细胞中重组抗体产量的方法。

抗体，也称为免疫球蛋白，是特异性识别称为抗原的外源分子的糖蛋白。当外源 抗原侵袭人类或其它动物时，免疫应答被触发从而由B-淋巴细胞产生抗体。通过这 种免疫应答，微生物、病毒和细菌毒素可能被变得无害。已知脊椎动物有5种在免 疫系统中有不同功能的免疫球蛋白类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。它们的基本 结构为两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。重链和轻链通过二硫桥和非共 价相互作用结合在一起。链本身包括可变区和恒定区。重链和轻链的可变区位于抗 体分子的N-末端部分，其氨基酸序列比恒定区更易发生变化。重链和轻链可变区各 含有三段超变序列或互补决定区(CDR)序列，它们一起形成独特的抗原识别位点。

可通过对抗体进行蛋白酶解来工程构建一些功能性抗原结合片段，例如通过木瓜 蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶学方法，产生例如Fab、F(ab’)₂或Fv片段。重 组DNA技术的发展导致可以设计出一些新的抗体和抗体片段。例如，这些蛋白质的 官能度已被改变从而产生新的并改进的功能。因此有可能减少医学应用中不需要的 免疫学特性。同时，在要求组织穿透和从血液中快速清除的应用中表达较小的重组 抗体片段可能优于表达完整抗体。

正在日益开发工程构建的抗体分子以及它们的片段作为疾病治疗和诊断的科学 和临床工具。

抗体特有的特异性识别并以高亲和力结合实际上任何抗原类型的能力使它们成 为了有吸引力的新型生物制药产品和科学研究的起点。也可考虑除研究和药物之外 的更多应用，如被消费者使用。其例子分别为，将抗体用于香波以防止头屑形成或 用于牙膏以防止龋齿及抵抗由龋齿造成的牙齿腐烂。其它可以想到的用途包括，例 如，用于生物传感器、废水处理、工业规模的分离过程或作为抗体酶，即将人工创 造的抗体用作酶。在设计融合蛋白时抗体片段结合能力的用途完全不同。例如，重 链恒定区基因的3’端与酶基因的5’端融合。例如，如果抗体对肿瘤抗原具有特异性， 则可利用该融合物将毒素或毒性酶递送到肿瘤细胞以选择性将其杀死。或者可将螯 合物(能够结合放射性同位素)化学偶联到重组抗肿瘤抗体或抗体片段，这样也可选择 性杀死肿瘤细胞。在人类药物中，这些方法有时被成为“魔术弹”。

然而，就这些目的而言需要大量抗体。一些表达系统可同原核和真核来源获得。 对表达系统的选择取决于多种因素，其中包括要表达的分子类型和各抗体的准确序 列。最广泛使用的重组蛋白(包括抗体)表达系统之一是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞哺乳 动物表达系统。它是少数几种能够简便且有效地高密度悬浮成批培养动物细胞的细 胞类型之一。CHO细胞允许非常高的产物产率且能相对抵抗代谢应激。通过在CHO 细胞中表达重组蛋白，有可能获得与人类细胞相似但不相同的糖基化模式。

最近，通过优化培养基组分、生物反应器设计和细胞培养参数，CHO细胞内重 组抗体的产量已经大大提高。因此已经做出了巨大改进以实现高密度生长、高特异 性生产及延长的培养细胞存活力。此外，通过采用主要为病毒来源的可能最强的启 动子和增强子元件，转录水平的产量增加已被大大优化。此外，对载体系统和宿主 细胞进行的比较研究显示，与使用各重链载体和轻链载体的混合物相比，采用其中 同时插入了重链和轻链基因转录单元的串联载体可导致高得多的抗体产量水平。

然而，尽管基因表达技术有所改进，但看来抗体表达水平还可提高达200倍。根 据Bentley等，Hybridoma，17(1998)，559-567，各抗体以特有的效率表达，该效率 由各种因素的组合决定，其中包括轻链合成水平以及重链和轻链的“相容性”。根据 Strutzenberger等，J.Biotechnol.，69(1999)，215-226，轻链表达率高有益于提高完整 抗体的分泌率。在基于CHO细胞的表达系统中，由于被侣伴蛋白截留，轻链表达减 少导致轻链的胞内浓度降低并使重链在内质网内累积。Borth等，J.Biotechnol.，8 (1999)，57-66，分析了轻链和重链mRNA的胞内含量及它们各自的多肽以及具有低、 中和高特异性产生率的三种亚克隆的特定分泌率。对于这三种亚克隆而言，发现轻 链的胞内含量与分泌率相关，而重链的胞内含量对所有三种亚克隆是相同的。作者 总结到，在内质网内的装配是抗体产量的主要速度限制因素之一。Smales等， Biotechnol.Bioeng.，88(4)(2004)，474-488，报道说，在GS-NSO细胞系内生产重组 单克隆抗体时，胞内轻链含量明显超过胞内重链含量。他们的结论是两者的胞内摩 尔比约为10∶1。

因此，完全有可能在通过抗体产生通路时有相当部分的轻链和重链未被正确装配 成四聚体免疫球蛋白。首先，单体蛋白质链存在装配问题；即使存在70％游离IgG 轻链时仍有相当量的单体IgG重链可被检测到。也可能有过量的轻链分泌入细胞培 养基中与功能性完全装配的单克隆抗体(mAb)一起存在。这种质量作用化学定律不能 简单地应用于细胞。选择性提高重链表达水平的努力证明不成功。Gass等，Trends Immunol.25(1)(2004)，17-24，提出，在天然的分泌抗体的B细胞-浆细胞中存在过 量轻链时方可达到最高mAb效价。

可能的解释也是由于靶向蛋白体而导致的重链的无效装配和/或提前选择性降解； 已知质量控制和降解时限与在糖类部分上添加葡萄糖标记有关。蛋白质结构域的装 配可由亲和相互作用、形成二硫键以使结构域非常接近和/或需要将暴露的疏水碎片 埋没在各结构域表面所驱动；据信，在装配和折叠的最初阶段，这种碎片被侣伴蛋 白屏蔽。现在熟知的是，分泌性糖蛋白在蛋白质合成后立即在细胞的细胞内部内质 网(ER)区室内折叠并装配成较高等级的复合物。ER是单独的区室，其中含有特定的 辅助装配因子并具有质量控制机制(Ellgaard等，Quality control in the secretory pathway(分泌途径中的质量控制)，Science.1999-12-3；286：1882-8；Helenius等， Intracellular functions of N-linked glycans(N-连接的聚糖的胞内功能)，Science. 2001-3-23；291：2364-9)。一旦成功装配，则在通过细胞的分泌途径时不再发生进一 步的装配，事实上，一些细胞类型如CHO细胞分泌两种类型的未装配的链，而其它 细胞类型如NSO细胞仅选择性保留IgG重链类型的非装配链，且很可能将它们靶向 降解途径。

之前的研究将特定重组单克隆抗体产量的变化与由于细胞环境(Lambert和 Merten，Biotechnol.Bioeng.，54(2)(1997)，165-180)或培养时间(Downham等， Biotechnol.Bioeng.，51(6)(1996)，691-696)变化而致细胞分泌途径蛋白质丰余度相关 联。因此，ER侣伴蛋白和折叠酶的过表达已经被用来设计真核细胞分泌重组抗体的 速率。例如，WO 03/057897披露了一种表达重组蛋白的方法，该方法包括共表达侣 伴蛋白和小的热激蛋白。据说那些其它的蛋白质能促进成功折叠和装配，因此提高 了正确折叠的、最具活性的产物蛋白的比例。

然而，各侣伴蛋白和折叠酶的过表达不会增加哺乳动物细胞中单克隆抗体的产 量。例如，已知BIP在哺乳动物细胞中过表达会减少其相关蛋白质的分泌(Domer和 Kaufman，Biologicals，22(2)(1994)，103-112)，而PDI在CHO细胞中过表达会降低 富含二硫键的融合蛋白的分泌((Davis等，Biotechnol.Prog.，16(5)(2000)，736-743)。 因此，一些辅助因子的共表达可降低蛋白质产物的总表达率，因此要求小心地最佳 化这种辅助因子各自的共表达速率。不同产物蛋白在不同程度上取决于仅部分个别 重叠侣伴蛋白的功能，迄今已经知道许多这种侣伴蛋白，例如GroEL、GroES、DnaK、 DnaJ、GrpE、ClpB、IbpA、Ibp。因此似乎不需要或不可能以一种产物蛋白产生率同 时共表达它们中的所有。

构成本发明基础的技术问题是避免现有技术的缺点及提供提高哺乳动物宿主细 胞中抗体产量的新的方法和过程，该方法和过程允许以高水平产生具有Fc受体活性 并由至少两条不同多肽链构成的标准的完整四聚IgG抗体。

本发明解决该技术问题的方法是：提供一种哺乳动物表达载体，其至少包含含有 编码第一多肽链的第一合成核苷酸序列的第一转录单元和含有编码第二多肽链的第 二合成核苷酸序列的第二转录单元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列基于天然 产生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽链可形成含有所述第一和第二多肽链中 每一条的至少一个或多个拷贝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列的密码子 组成都适应于给定的哺乳动物宿主种类基因的密码子偏倚，该给定的种类不同于最 初衍生出天然产生的核苷酸序列的哺乳动物种类。

因此，本发明提供了一种哺乳动物表达载体，其具有适应于给定的哺乳动物宿主 细胞的密码子偏倚的核苷酸序列，即基因优化的核苷酸序列。本发明的发明人检测 了本发明的双基因载体，其包含在哺乳动物CHO细胞表达系统中基因优化的轻链和 重链基因，其中所述轻链和重链的氨基酸序列未通过基因优化加以改变。奇怪且出 乎意料的是，发现使用重链和轻链基因都被基因优化的载体能将抗体产量的中间水 平从37.8μg/ml显著提高到51.3μg/ml。相反，与未优化的轻链一起表达基因优化的 重链不足以提高抗体表达水平。因此，与含有一种基因优化的基因和一种非优化基 因的对照载体或其中重链和轻链基因都未经基因优化的对照基因相比，通过使用本 发明的包含优化基因的重链和轻链基因的哺乳动物双基因表达载体能够显著提高分 泌抗体的总产率。通过具有基因优化的重链和轻链基因的载体获得的抗体产量水平 的显著提升归功于基因优化的重链和轻链基因。

本发明的发明人获得的其它结果提示，优化完整的编码基因序列而非仅其某些部 分是有益的。例如，如果仅轻链和重链基因的N-末端被基因优化则抗体的总产量不 会增加或仅轻微增加。

由本发明的发明人获得的结果完全不同于现有技术中描述的现象。由现有技术可 知，胞内轻链含量与抗体的分泌比率相关，这说明与重链相比轻链必需过量表达以 获得高水平的抗体产量，而如果不是这样则重链将被侣伴蛋白保留而在内质网内累 积。相反，本发明人的结果却暗示，在哺乳动物表达系统中，轻链表达和重链表达 必需平衡以实现高水平产生分泌的抗体。不希望局限于任何特定理论，据信，为实 现以高水平产生抗体，仅提高胞内轻链含量是不够的。似乎高的胞内重链含量也是 必需的。

本发明人的其它结果显示，抗体产量的主要限速因子之一不仅仅是在内质网内装 配，还包括转录及对mRNA稳定性的调节。由于发明人使用的基因优化不能改变重 链和轻链的氨基酸序列，因此较高的抗体产量不可能归功于改变的链装配或改变的 ER-相关的错误折叠或未折叠多肽链的降解。利用重链和轻链基因都经基因优化的本 发明的双基因载体获得了提高的抗体产量还说明，由于除去了如内部TAT-盒、χ-位 点、重复序列、隐蔽剪接位点等导致重复基因翻译效率提高的顺式作用序列基序， 转录效率和mRNA稳定性被优化。

因此，本发明解决所述技术问题的方法是：提供一种哺乳动物表达载体，其至少 包含含有编码第一多肽链的第一合成核苷酸序列的第一转录单元和含有编码第二多 肽链的第二合成核苷酸序列的第二转录单元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列 基于天然产生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽链可形成含有所述第一和第二 多肽链中每一条的至少一个或多个拷贝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列 的密码子组成经改进而能以较高效率翻译它们的mRNA。

在本发明文中，“含有所述第一和第二多肽链中每一条的至少一个或多个拷贝的 分子”是一种多亚基分子，尤其是分泌性多亚基分子。该分子可由两种不同多肽链中 每一种的一个或多个拷贝构成。该分子可包含两种以上不同的多肽链。在优选的实 施方式中，该分子是分泌性抗体。然而，该分泌的分子也可以是另一种由不同多肽 链或亚基构成的蛋白。这种多亚基蛋白的例子包括但不限于：多亚基酶、受体分子 和离子通道。

在本发明文中，“哺乳动物表达载体”优选为分离和纯化的DNA分子，将其转染 入适当的哺乳动物宿主细胞中可提供该在宿主细胞内高水平表达两种多肽链。

本发明的哺乳动物表达载体包含至少两个单独的转录单元。具有两个单独转录单 元的表达载体也称为双基因载体。因此其例子为两基因载体，其中第一转录单元的 第一合成核苷酸序列或第一基因编码抗体的重链或其片段，第二转录单元的第二合 成核苷酸序列编码抗体轻链。另一个例子是双基因载体，其中两条合成核苷酸序列 编码蛋白质(如酶)的两个不同亚基。

然而，还可能本发明的表达载体包含两个以上单独是转录单元，例如三个、四个 或者更多单独的转录单元，各转录单元包含编码不同多肽链的不同的合成核苷酸序 列。因此其例子为具有四个单独转录单元的载体，各转录单元含有编码由四个不同 亚基构成的酶的一个亚基的不同的合成核苷酸序列。

在本发明文中，术语“基因优化”指一种技术，通过该技术可在天然核苷酸序列如 感兴趣的基因内引入多个改变，从而产生新的合成的核苷酸序列。在本发明文中，“合 成的核苷酸序列”因此指通过基因优化从天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列。天然核 苷酸序列可以是基因组序列或是从基因组序列得到并缺乏内含子序列的cDNA。

基因优化的目的是提高基因的翻译效率和确保其在靶生物或这种靶生物的组织 或细胞内最优表达，从而使所述靶生物不同于最初衍生出其核苷酸序列的生物。根 据不同物种中不同简并转运RNA的丰度不同，各生物具有其优选使用的密码子。在 给定的生物或物种中具有最高表达水平的蛋白质具有高密码子偏倚(即倾向于在基因 中利用相同氨基酸密码子的程度)。

因此，基因优化包括用靶生物优选使用的同义密码子替代至少一个天然核苷酸序 列中存在的密码子。与对应于被替代的密码子的同工-tRNA相比，同义密码子对应 于在靶细胞或生物中具有较高丰度的同工-tRNA。

在本发明的一个优选实施方式中，第一和第二核苷酸序列的密码子组成适应于特 定靶哺乳动物宿主细胞基因的密码子偏倚。最优选的第一和第二核苷酸序列的密码 子组成适应于CHO或NSO细胞基因的密码子偏倚。在另一实施方式中，第一和第 二核苷酸序列的密码子组成适应于智人(Homo sapiens)基因的密码子偏倚。

真核基因表达是一种复杂机制，可在转录、转录后、翻译和翻译后水平对其进行 调节。在酵母上进行的实验显示，80％的蛋白质组是在指数生长期间表达的，而85％ 的核糖体参与翻译，说明mRNA不得不与核糖体竞争。本发明人对产生嵌合抗体的 NSO细胞系进行的研究进一步揭示，重组mRNA约占总mRNA的20％。这说明要 求核糖体超出细胞来源，因此核糖体短缺可能会阻碍细胞维持和生长。

对mRNA稳定性的调节是基因表达调节的一个重要组成部分。个体mRNA的结 构特征会影响翻译过程。在高级真核生物中，已知例如前导序列的长度、二级结构 存在于起始密码子的上游或下游以及多聚(A)尾的长度会影响mRNA的翻译效率。前 导序列内的稳定的二级结构会阻止40S核糖体亚基扫描检索起始密码子从而抑制翻 译。已知存在的共有顺式作用序列和序列基序参与决定mRNA的稳定性。核酸内元 件的协同相互作用也在转录后水平上参与限制细胞基因的表达。这种抑制序列(INS) 在mRNA内具有活性。此外，一些病毒和细胞mRNA也是调控元件，即前导序列中 的内部核糖体进入位点(IRES)元件通过不依赖于加帽的机制发挥作用以促进40S核 糖体亚基在内部结合mRNA。

根据本发明，基因优化因此还包括提高合成的核苷酸序列转录效率及赋予mRNA 提高的稳定性和/或提高mRNA翻译效率的改变。

因此，在本发明的一个优选实施方式中，基因优化包括与天然核苷酸序列相比改 变一条或两条合成的核苷酸序列中的GC含量或GC分布。因此，本发明涉及一种哺 乳动物表达载体，其中所述两条合成核苷酸序列的GC含量和/或GC分布不同于其 相应的天然核苷酸序列。“不同的”GC含量是指，根据靶哺乳动物宿主细胞，合成的 核苷酸序列的GC含量可高于或低于天然产生的核苷酸序列。尤其优选相比其相应的 天然核苷酸序列，所述一条或两条合成的核苷酸序列5’UTR的GC含量被降低。还 优选相比其相应的天然核苷酸序列，所述一条或两条合成的核苷酸序列3’UTR的 GC含量被降低。

在本发明另一个优选的实施方式中，所述两条合成的核苷酸序列之一或两者的 AT含量和/或AT分布不同于其相应的天然核苷酸序列。尤其优选相比其相应的天然 核苷酸序列，所述一条或两条合成的核苷酸序列3’UTR的AT含量被降低。

在本发明的再一个优选的实施方式中，相比其相应的天然核苷酸序列，所述一条 或两条合成的核苷酸序列3’UTR和/或5’UTR的长度被改变。尤其优选3’UTR的长 度增加。还优选5’的UTR的长度被调至约60bp。

在另一个优选实施方式中，与其相应的天然核苷酸序列相比，所述两条合成的核 苷酸序列之一或两者含有较少顺式作用序列基序。“较少顺式作用序列基序”是指，与 合成的核苷酸序列相比，天然产生的核苷酸序列含有的顺式作用序列基序至少多1 个。优选地，所述合成的核苷酸序列含有天然产生的核苷酸序列中存在的所有顺式 作用序列基序的95％以下、90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、 40％以下、30％以下、20％以下、或者升至10％以下。最优选的，所述合成的核苷酸 序列根本不含顺式作用序列基序。优选基因优化尤其包括改变5’UTR和3’UTR中 存在的顺式作用序列基序。

根据本发明，“顺式作用序列基序”或“顺式作用序列元件”包括但不限于：内部 TATA盒，χ-位点，核糖体进入位点如IRES位点、富含AT或富含GC的序列串， ARE、INS或CRS序列元件，可影响RNA稳定性的重复序列，隐蔽剪接供体和受体 位点等。因此，与天然产生的核苷酸序列相比，所述两条合成的核苷酸序列优选含 有较少的内部TATA盒、χ-位点和/或核糖体进入位点。与天然产生的核苷酸序列相 比，这两条合成的核苷酸序列也可含有较少ARE、INS和/或CRS序列元件。此外， 与天然产生的核苷酸序列相比，这两条合成的核苷酸序列可含有较少重复序列，因 此，与天然产生的核苷酸序列相比，它们的RNA将形成较少二级结构。同时，与天 然产生的核苷酸序列相比，这两条合成的核苷酸序列可含有较少隐蔽剪接供体和受 体位点。

在本发明的一个实施方式中，基因优化仅包括改变顺式作用序列基序的特定类 型，如改变和/或删除天然产生的核苷酸序列中存在的ARE元件。在另一实施方式中， 基因优化包括改变和/或删除两种或更多类型的天然产生的核苷酸序列中存在的顺式 作用序列基序，例如，删除TATA盒、ARE序列元件和隐蔽剪接供体和受体位点。 再在另一个实施方式中，基因优化包括改变和/或删除所有可能类型的顺式作用序列 基序。第一和第二合成核苷酸序列的基因优化可包括改变和/或删除不同的顺式作用 序列基序。

在另一个优选实施方式中，基因优化包括能除去另路起始位点如uCDS和uAUG 的改变。因此，本发明还涉及一种哺乳动物表达载体，其中所述两条合成的核苷酸 序列之一或两者相比其相应的天然核苷酸序列含有较少另路起始位点。

在本发明的一个实施方式中，编码多肽链的完整核苷酸序列是基因优化的。在进 一步的实施方式中，仅核苷酸序列的某些区域是基因优化的。这种实施方式的一个 例子是基因优化核苷酸序列的N-末端。根据本发明，第一和第二合成核苷酸序列当 然可能是不同基因优化的结果。例如，可能两条合成的核苷酸序列之一的整个序列 被基因优化，而另一条合成的序列仅部分序列被基因优化。然而也可能合成的核苷 酸序列中的不同特征被改变。例如，在一条合成的核苷酸序列中仅GC含量被改变， 而在另一条合成的核苷酸序列仅某些顺式作用元件被除去。

在特别优选的本发明的实施方式中，基因优化不改变氨基酸序列，即与由天然产 生的核苷酸序列编码的相应多肽链相比，由合成的核苷酸序列编码的第一和第二多 肽链具有相同的氨基酸序列。

然而，根据本发明，基因优化当然可能导致由合成的核苷酸序列编码的一条或两 条多肽链的氨基酸序列改变；即与由天然产生的核苷酸序列编码的相应多肽链相比， 由第一合成核苷酸序列编码的第一多肽或由第二合成核苷酸序列编码的的第二多肽 或者这两者具有不同的氨基酸序列。一个优选的例子是，与由天然产生的核苷酸序 列编码的相应多肽链相比，多肽链具有较少的糖基化位点或改变的糖基化位点。

一个优选的本发明的实施方式涉及一种哺乳动物表达载体，其中第一合成核苷酸 序列编码抗体的轻链或其片段，第二合成核苷酸序列编码抗体的重链或其片段。优 选地，第一和第二多肽链表达后可形成抗体或免疫球蛋白或其片段。在另一个优选 实施方式中，第一和/或第二合成核苷酸序列与效应蛋白的基因融合。此时，第一和 第二多肽链在表达后可形成融合蛋白，其中的效应蛋白与抗体或免疫球蛋白或其片 段偶联。

本发明所述的免疫球蛋白可具有Fc-受体活性或补体活化活性或同时具有这两种 活性。由于本领域已经将补体活化明确定义为诱导补体级联(可能通过不同途径)，因 此Fc-受体活性在本发明文中可被理解为激活细胞Fc受体，细胞Fc受体可引发细胞 反应，例如在天然产生的IgG或IgA引发的吞细胞活性或细胞毒活性的情况下或者 例如在天然IgE类免疫球蛋白引发细胞受体而释放肥大细胞颗粒的情况下。类似的， 在天然抗体中，IgM和IgG类抗体都可引发补体活化。不言而喻，任何此类效应活 性在天然产生的抗体亚类和它们已知的同种异型中是可变的，并因此在本发明的抗 体中是可变的。然而，在本发明文中，可通过功能域交换工程改造Fc-受体活化或补 体活化效应器结构域，成为任何给定的免疫球蛋白结构，从而在这样产生的免疫球 蛋白中有效转移或加入各自的效应器性能。

免疫球蛋白除了能特异性结合给定的抗原，它可以是天然产生的免疫球蛋白，或 者可以是构建的、人工类型的免疫球蛋白。这包括种-嵌合抗体或CDR接枝抗体、通 过基因改组或定点工程产生的抗体、用PEG或放射性同位素螯合部分化学修饰的抗 体、或是具有上述活性的免疫球蛋白与任何其它蛋白质部分如另一种酶活性结构域 结合形成的融合蛋白。由给定的免疫球蛋白提供的每种活性的程度是可变的。免疫 球蛋白重链的恒定部分区域可产生两种类型的效应功能；例如，不同的人IgG亚类 改变其相对效率以活化或放大补体级联步骤。通常，人IgG1和IgG3最有效地固定 补体，IgG2的功效较差，而IgG4不活化补体。检测上述活性之一的测定模式是免疫 学家及其它人所熟知的；合适的方法可在以下标准免疫化学实验室手册中找到，如 Harlow等的《抗体实验室手册》(Antibodies-a laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988。例如，在天然产生的免疫球蛋白中，轻链具有单个恒定区结 构域，而重链具有若干恒定区结构域。一所有的人亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 通过恒定链部分介导细胞毒效应功能(ADCC：抗体介导的细胞毒性)，这种功能是由 抗体与杀伤细胞/细胞毒T-淋巴细胞相互作用带来的；由于通常认为IgG4不能介导 这种效应，因此非常值得注意。然而，已经发现人IgG4本身也能够介导ADCC，尽 管其程度受到试验(如⁵¹Cr-释放试验)中所采用的效应细胞来源的强烈调节或取决于 所采用的效应细胞，这至少是由于人类独特的天然多态性所致。这种现象已由 Greenwood J，Clark M，Waldmann H.在《参与人IgG抗体效应功能的结构基序》 (Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions)Eur J Immunol 1993；5：1098-1104中展示。

天然产生的抗体或免疫球蛋白类型IgG和IgA天然具有3个恒定区结构域，称为 CH1、CH₂和CH3，而IgM和IgE类型具有4个恒定区结构域。相反，例如WO02/056910 描述了不含CH1结构域的用于人类治疗的人工抗体；这种抗体也包含在本发明所述 的免疫球蛋白当中。

优选地，免疫球蛋白或Ig分子包含至少一个绞链结构域、CH2和CH3结构域或 其功能变体。那些结构域形成例如天然IgG中必需的Fc部分。关于免疫球蛋白这些 结构元件的详细描述和定义可见：Amzel等，Three-dimensional structure of immunoglobulins(免疫球蛋白的三维结构)，Ann.Rev.Biochem.48，961-997(1979)； Davies等，Structural basis of antibody function(抗体功能的结构基础)，Ann.Rev. Immunol.1，87-117(1983)；Hunkapiller等，Diversity of immunoglobulins gene superfamily(免疫球蛋白基因超家族的多样性)，Adv.Immunol.44，1-63(1989)。所述 结构域可以是天然产生的结构域、人为产生的这种结构域的嵌合形式或是这种结构 域的嵌合装配体或是例如通过定点诱变构建的形式。过去通常使用嵌合的、CDR接 枝的小鼠人嵌合抗体；同样，可变区结构域或CH1/CL结构域部分中的潜在糖基化 位点通常通过定点诱变被除去。当然，除了互补决定区所固有的天然可变性，本发 明所述免疫球蛋白任何部分的构建程度通常会受到需要的限制以避免在工程抗体中 形成过于强的免疫原性基序。除此之外，绞链部分上游的抗原结合部分通常形成例 如IgG类型抗体的Fv部分(包含V_H和V_L结构域)，本发明的唯一要求是，这种部分 由两个不同的多肽链(分泌时)构成并具有一些抗原结合特性。本发明所述的免疫球蛋 白可能通过以‘珠串’方式排列在抗原结合Fv部分中的多个可变区而具有升高的抗 原结合价。

在一个特别优选的本发明的实施方式中，第一合成核苷酸序列编码包含SEQ ID No.3所示序列的抗体轻链，而第二合成核苷酸序列编码包含SEQ ID No.1所示序列 的抗体重链。由SEQ ID No.3编码的轻链的氨基酸序列示于SEQ ID No.4。由SEQ ID No.1编码的重链的氨基酸序列示于SEQ ID No.2。

除了编码多肽链的合成的核苷酸序列，所示哺乳动物表达载体还包含从编码序列 有效转录mRNA以及将mRNA有效翻译入宿主细胞系所必需的的调控DNA序列。 当该调控序列操作性连接于合成的核苷酸序列时，它们将在哺乳动物细胞环境内介 导这种核苷酸序列转录的启动并促进从相应的mRNA有效合成蛋白质。在本发明的 一个优选实施方式中，在两个转录单元的每一个中，编码两条不同多肽链的合成的 核苷酸序列受相同调控单元的控制。

优选地，本发明的哺乳动物表达载体还含有至少一个在动物细胞中可选择的表达 标记。因此，在优选的实施方式中，本发明的哺乳动物表达载体包含编码可选标记 的第三转录单元。可采用任何通常使用的选择标记，如胸苷激酶(tk)、二氢叶酸还原 酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。在优选的实施方式中，采用可表达的GS选择标 记(Bebbington等，1992，High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker(采用谷氨酰 胺合成酶基因作为可扩增的可选标记从骨髓瘤细胞高水平表达重组抗体)， Bio/Technology 10：169-175；Cockett等，1990，High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary(CHO)细胞s using glutamine synthetase gene amplification(采用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高水 平表达组织金属蛋白酶抑制剂)，Bio/Technology 8：662-667)。GS系统是仅有的两种 对于产生治疗性蛋白质特别重要的系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比， GS系统在发育期间提供长时期优势，这是由于从最初的转染子通常可产生高生产性 细胞系从而在存在升高浓度的选择剂时不需要多轮选择便可实现基因扩增(Brown 等，1992，Process development for the production of recombinant antibody using the glutamine synthetase(GS)system(采用谷氨酰胺合成酶(GS)系统生产重组抗体的工艺 过程开发)，Cytotechnology 9：231-236)。

尤其当仅用于瞬时/游离表达时，本发明的表达载体还可含有复制起点，如EB病 毒(EBV)或SV40病毒起点以便在真核宿主细胞中维持自发复制/游离型复制，但也可 缺乏可选标记。本发明的表达载体可以是，例如但不限于，线性DNA片段、包含核 靶向序列的DNA片段或者可以是经特殊优化以便与转染剂相互作用的DNA片段， 可在细菌中穿梭和生产的动物病毒或合适的质粒。

本发明还通过以下方法解决了该技术问题：提供一种含有本发明所述哺乳动物表 达载体的宿主细胞。因此，本发明的再一方面涉及一种优选含有本发明所述哺乳动 物表达载体的脊椎动物宿主细胞。

在本发明的一个实施方式中，本发明所述的宿主细胞可以是任何脊椎动物脊椎动 物宿主细胞系，与原代细胞系不同，该细胞系可在细胞培养物中稳定增殖。可能的 细胞系是，例如，COS细胞、NSO细胞、CHO细胞、HT1080细胞、PER-C6细胞、 BHK细胞、Sf-9细胞、293或293-EBNA细胞。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的脊椎动物宿主细胞是哺乳动物细 胞，最优选人类细胞，例如HT1080细胞、293、293-EBNA或HBK-I1细胞(ATCC-CRL 12569；也可见US6,136,599)。更优选地，本发明所述的人类细胞选自HT1080细 胞或Per-C6细胞(Crucell B.V.，Netherlands；WO 97/00326，也可见EP-1161548)。最 优选地，所述细胞是HT1080细胞。例如，HT1080细胞可从美国模式培养物保藏所 (Manassas/VA，U.S.A.)获得，其ATCC编号为CCL-121。已发现当与谷氨酰胺合成 酶选择标记系统组合使用时HT1080细胞能够提高产物的糖基化(WO 03/064630)。

在特别优选的实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或 细胞系(Puck等，1958，J.Exp.Med.108：945-955)，尤其是适应于在无血清悬浮培 养基(即除了携带微载体的培养基)中生长的CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)、CHO pro3-、CHO DG44、CHO P12、dhfr-CHO细胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS 77， 1980，4216-4220)，DUXB11(Simonsen等，PNAS 80，1983，2495-2499)或CHO细 胞。

再在本发明的另一个实施方式中，所述宿主细胞是淋巴细胞，更优选哺乳动物淋 巴细胞，其中包括例如杂交瘤、骨髓瘤和三重杂交瘤(trioma)细胞系。例子包括例如 非分泌型杂交瘤如SP2/0和非分泌型骨髓瘤细胞如来自小鼠的NSO细胞系ECACC No.85110503(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell cultures)，应用微 生物学中心(Centre for Applied microbiology)，索尔兹伯里/威尔特郡SP4 OJG，英国) 或来自大鼠的YB2/3.0Ag20(描述于GB2070313)。骨髓瘤细胞如NSO细胞实际为 B-淋巴细胞类型，叫做浆细胞瘤细胞系，但在本领域通常也叫做‘骨髓瘤’(Barnes 等，Cytotechnology 32：109-123，2000)。

其它优选的哺乳动物宿主细胞的例子包括但不限于：MRC5人成纤维细胞、983M 人黑色素瘤细胞、MDCK狗肾细胞、分离自Sprague-Dawley大鼠的RF培养的大鼠 肺纤维母细胞、B16BL6鼠黑色素瘤细胞、P815鼠肥大细胞瘤细胞和MT1A2鼠乳腺 腺癌细胞。

为了将表达载体引入本发明的哺乳动物宿主细胞中，如果对给定的宿主细胞类型 合适，可采用任何转染技术，例如本领域熟知的技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡萄糖转染、脂转染。应该注意，可用本发明载体转染的哺乳动物宿主细胞 应是可瞬时或稳定转染的细胞系。因此，本发明的哺乳动物表达载体可维持于游离 体形式或可稳定地整合进哺乳动物宿主细胞的基因组中。

瞬时转染的特征是对含有选择标记的载体不施加任何选择压力。来源于瞬时转染 的细胞群或一批细胞包括插入了外来DNA并表达的细胞和没有插入外来DNA的细 胞的混合细胞群。在转染后通常持续20-50小时的瞬时表达实验中，转染的载体维持 为游离型元件尚未整合入基因组中。即转染的DNA经常没有整合入宿主细胞基因组 中。宿主细胞倾向于丢失转染的DNA培养瞬时转染细胞群时细胞群中的转染细胞过 度生长。因此在紧接转染后的时间内表达最强而随时间推移减弱。优选理解本发明 的瞬时转染子是能在转染后在没有选择压力的细胞培养中维持表达90个小时的细 胞。

在本发明的一个优选实施方式中，用本发明的哺乳动物表达载体稳定转染哺乳动 物宿主细胞，如CHO宿主细胞。稳定转染指新引入的外来DNA(例如载体DNA)， 通常通过随机非同源重组而掺入基因组DNA中。可通过选择扩增地载体序列已整合 入宿主细胞DNA中的细胞系来提高载体DNA的拷贝数和伴随的基因产物数量。因 此，这种稳定整合有可能在接触基因扩增进一步选择压力时在CHO细胞中加倍产生 微小染色体。而且，就载体序列而言，稳定转染会导致丢失与重组基因产物表达不 直接相关的载体序列部分，如细菌拷贝数目控制区在基因组整合时可产生过剩。因 此，转染的宿主细胞基因组中已整合了至少一部分或不同部分的表达载体。

本发明解决上述技术问题的方法还包括：提供一种提高分泌的分子产量水平的方 法，所述分子包含第一和第二多肽链各自的多个拷贝，该方法包括以下步骤：

a)用编码至少第一和第二多肽链的本发明的表达载体转染哺乳动物宿主细胞，

b)在适当条件下培养该宿主细胞以使细胞增殖和表达并在细胞内将两条多肽链 装配成含有第一和第二多肽链各自的多个拷贝的分子并分泌形成的分子，和

c)收获形成的分子。

这种提高分泌的分子、尤其是分泌的抗体产量水平的方法基于使用本发明的哺乳 动物双基因表达载体，该表达载体包含两种不同的编码不同多肽链即抗体的重链和 轻链的基因优化的基因，其在表达后形成所需分子。与仅含有一种基因优化的基因 的对照载体或两种基因均未经基因优化的对照载体相比，通过使用本发明的载体有 可能显著提高分泌分子的总产率。因此，本发明的方法可有利的导致分泌分子的产 量水平有相当程度的提高。

优选地，在本发明的方法中，两条不同多肽链以几乎1∶1的比例表达。如果所需 分子是由重链和轻链的多个拷贝构成的抗体这将特别有利。然而，也可能将两条多 肽链的表达调节成其它比例。这可通过对编码多肽链的两条不同的合成的核苷酸序 列采用不同的基因优化策略或通过将两条合成的核苷酸序列一不同启动子操作性相 连来实现。

本发明的方法可用来提高任何有至少两条不同多肽链构成的分泌分子的产率。优 选地，所分泌的分子是分泌性抗体。然而，所分泌的分子也可以是任何由不同多肽 链或亚基构成的蛋白质。这种多亚基蛋白的例子包括但不限于含有若干不同亚基的 酶、受体分子和离子通道。

哺乳动物细胞系的合适培养基和培养方法是本领域熟知的，例如可见US 5,633,162中的描述。用于实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需 要的标准细胞培养基的例子包括但不限于：Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培养基(Morre，G，The journal of the American Medical Association，199，第519 页起，1967)、L-15培养基(Leibovitz，A等，Amer.J.of Hygiene，78，1第173页起， 1963)、Dulbecco改进的Eagle培养基、Eagle极限必需培养基(MEM)、Ham F12培养 基(Ham，R等，Proc.Natl.Acad.Sc.53，第288页起，1965)或缺少白蛋白、运铁蛋 白和卵磷脂的Iscoves改进的DMEM(Iscoves等，J.Exp.med.1，第923页起，1978)。 例如，Ham F10或F12培养基是专门为CHO细胞培养设计的。特别适合于CHO细 胞培养的其它培养基见EP-481791中所述。已知此类培养基中可增添胎牛血清(FBS， 也称为胎小牛血清FCS)，后者提供了天然来源的丰富激素和生长因子。目前哺乳动 物细胞的培养是常规操作，在科学教科书和手册中有全面的描述，细节可参见R.Ian Fresney，Culture of Animal cells(动物细胞的培养)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.， 2000。

在本发明的一个优选实施方式中，所采用的细胞培养基不含胎小牛血清(FCS或 FBS)，因此称为“无血清”。为了获得最佳的生长，无血清培养基中的细胞通常需要 在无血清培养基中含有胰岛素和运铁蛋白。运铁蛋白可以至少部分可用非肽螯合剂 或铁运载体如环庚三烯酚酮(如WO 94/02592所述)或递增水平的易于与抗氧化剂如 维生素C结合的有机铁源取代。大多数细胞系需要一种或多种合成的生长因子(包括 重组多肽)，包括例如表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生 长因子I和II(IGFI、IDFII)等。可能是必需的其它类型因子包括：前列腺素、运输和 结合蛋白(如血浆铜蓝蛋白、高和低密度载脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括 类固醇激素)和脂肪酸。最好在发现具有生长刺激作用的物质存在下以检测新多肽因 子的逐步方式进行多肽因子的检测。那些生长因子是合成或重组的生长因子。动物 细胞培养的检测有许多方法，以下描述了其中一个例子。最初步骤是获得细胞存活 条件和/或从添加血清的培养基转移出后缓慢生长3-6天。在大多数细胞类型中，这 是接种细胞密度函数的至少一部分。一旦找到最优的激素/生长因子/多肽添加物，存 活所需的接种细胞密度将减小。

在另一优选实施方式中，所述细胞培养基不含蛋白质，即不含胎牛血清和各蛋白 质生长因子添加物或其它蛋白质如重组运铁蛋白。

在另一实施方式中，本发明的方法包括例如在工业化补料分批生物反应器中高密 度培养动物宿主细胞。然后进行常规的下游加工。接着，采用高密度生长培养基。 这种高密度生长培养基要添加营养物(如所有氨基酸)、上述范围内的能源(如葡萄糖)、 无机盐、维生素、微量元素(定义为通常以微摩尔终密度存在的无机化合物)、缓冲液、 四种核苷或其对应核苷酸、抗氧化剂(如谷胱甘肽(还原))、维生素C和其它组分，如 重要的膜脂(如胆固醇或卵磷脂)或脂质前体(如胆碱或肌醇)。高密度培养基富含大多 数或所有这些化合物，如GB2251249与RPMI 1640比较得到的那样，除了基于调节 培养基等渗摩尔渗透压的无机盐以外，可含有比比以上提到的标准培养基更高含量 (强化)的这些化合物。优选强化本发明的高密度培养基加入所有的氨基酸(除色氨酸 外)超过75毫克/升培养基。高密度培养基一般的氨基酸需求优选谷氨酰胺和/或天冬 酰胺超过1克/升，更优选地2克/升高密度培养基。本发明内容中，高密度细胞培养 定义为在恒定的或不断增加的培养基体积中，从一个细胞开始连续培养或以较低的 活细胞密度接种细胞培养基并连续培养动物细胞群使活细胞的瞬时密度至少或超过 10⁵细胞/毫升，优选地至少或超过10⁶细胞/毫升。

本发明方法的另一优选实施方式包括补料分批培养。补料分批培养是一种培养体 系，在如GB2251249所述的细胞培养基中，除另外进料控制葡萄糖浓度外至少补料 加入谷氨酰胺，和任选的一种或多种其它氨基酸(优选甘氨酸)，以维持它们在培养基 中的浓度。更优选在如EP229809-A所述在细胞培养基中补加谷氨酰胺和任选的一 种或多种其它氨基酸以及一种或多种能源如葡萄糖。补料通常在培养开始后25-60 小时时开始；例如，当细胞密度达到大约10⁶细胞/毫升时开始补料。本领域熟知培 养动物细胞的谷氨酰胺代谢(McKeehan等，1984，动物细胞中的谷氨酰胺代谢 (Glutaminolysis in animal cells)，Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells(培养细胞的 碳水化合物代谢)，M.J.Morgan，Plenum Press出版，纽约，第11-150页)可变为生 长阶段重要的能量来源。谷氨酰胺和/或天冬氨酸进料总量(以天冬氨酸取代谷氨酰 胺，参见Kurano，N.等，1990，J.Biotechnology 15，113-128)范围通常为0.5-10克/ 升，优选1-2克/升培养基体积；其它可用作进料的氨基酸为10-300毫克总进料/升培 养基体积，具体说，甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸进料量 常比其它氨基酸高至少为150-200毫克。加入补料可以是喷射加入或用泵连续加入补 料，优选将所述补料用泵连续加入生物反应器。不言而喻，在生物反应器分批补料 培养过程中应通过添加碱或缓冲液来小心控制pH使其在给定细胞系最佳生理pH左 右。当用葡萄糖作为能源时，葡萄糖进料总量通常为1-10克，优选3-6克/升培养基。 除加入氨基酸外，进料优选加入范围5-20毫克/升培养基的低含量胆碱。更优选如 US6,048,728所述，胆碱补料必需与乙醇胺一起添加，特别是与谷氨酰胺一起补料。 不言而喻，由于过量谷氨酰胺的累积加上内源产生谷氨酰胺会导致氨的产生伴发毒 性，与非GS标记系统相比，采用用GS标记系统需要的谷氨酰胺应较少。对于GS 系统，培养基或补料中的谷氨酰胺大部分可用其等效物和/或前体替代，即用天冬氨 酸和/或谷氨酸盐替代。

收获方法，即从细胞、细胞培养物或细胞培养基中分离和/或纯化给定蛋白质的方 法是为本领域熟知的。例如，可通过用盐或有机溶剂进行分级沉淀、离子交换层析、 凝胶层析、HPLC、亲和层析等，分离和/或纯化生物材料中的蛋白质。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。

图中：

图1：含有重链基因组序列的载体pcB72.3的图。

图2：含有重链cDNA的载体pcB72.3HC cDNA的图。

图3：含有在hCMV-MIE启动子控制之下编码重链的基因优化基因的载体pcB72.3 Geneart HC的图，以及含有编码重链的基因优化基因和编码轻链的基因优化基因的 载体pcB72.3Geneart HC/LC的图，其中各基因处于hCMV-MIE启动子控制之下。

图4：抗体在转染的CHO-K1SV细胞中的相对表达水平。比较了含有编码重链的 基因组DNA的载体pcB72.3和含有编码重链的cDNA的载体pcB72.3HC cDNA。

图5：抗体在转染的CHO-K1SV细胞中的相对表达水平。比较了含有编码重链的 cDNA的载体pcB72.3HC cDNA、含有编码重链的基因优化基因的载体pcB72.3HC 和含有编码重链的基因优化基因及编码轻链的基因优化基因的载体pcB72.3HC/LC。

图6：该图显示了基因优化的恒定区对转染的CHO-K1SV细胞中抗体产量的影 响。载体pConG1GA含有具有优化恒定区和非优化可变区的IgG1基因序列。载体 pConG2GA含有具有优化恒定区和非优化可变区的IgG2基因序列。载体pConG4GA 含有具有优化恒定区和非优化可变区的IgG4基因序列。载体G1cDNA含有非优化的 IgG1基因序列，载体G2cDNA含有非优化的IgG2基因序列，载体pcB72.3HC cDNA 含有非优化的IgG4序列。具有基因优化的恒定区和基因优化可变区的载体pcB72.3 GAHC/LC被用作对照。pcB72.3(7)和pConG4GA(8)的数据获得单独的实验，这就解 释了在pcB72.3(1)和pcB72.3(7)之间观察到的对照值的差异。

序列表中：

SEQ ID No.1显示了编码优化cB72.3重链的核酸序列。

SEQ ID No.2显示了由SEQ ID No.1的核酸序列编码的优化cB72.3重链的氨基 酸序列。

SEQ ID No.3显示了编码优化cB72.3轻链的核酸序列。

SEQ ID No.4显示了由SEQ ID No.3的核酸序列编码的优化cB72.3轻链的氨基 酸序列。

应理解本发明说明书对给出的优选实施方式进行的解释和参考内容同样适合本 发明的所有其它优选实施方式。

本发明通过以下实施例作更详细说明。

实施例

材料和方法

采用的细胞

CHO细胞系CHOKlSV是细胞系CHO-K1的变体，已适应悬浮生长和无蛋白培 养基。

CHOK1SV细胞的增殖：

CHOK1SV细胞通常在装有添加了6mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基 (Invitrogen)的摇瓶中悬浮增殖。接种密度为2×10⁵细胞/毫升，每4天细胞分裂一次。 瓶中充入5％CO₂气体，36.5℃(在35.5℃-37.0℃之间)轨道式摇床140rpm培养。

瞬时转染：

用悬浮生长的细胞进行瞬时转染。对细胞计数并以每孔2.5×10⁵活细胞将细胞分 布到24孔板的孔中，孔中含有添加了10％血清和6mM L-谷氨酰胺的DMEM-基培养 基，于36.5℃培育过夜。第二天用1mL新鲜的培养基(如上所述)替换用过的培养基 并在37℃培育细胞3小时。

每次转染时将5μg各SGV(HC和LC-SGV的混合物)或5μg DGV重悬于100μL 转染培养基(OptiMEM，Invitrogen)。阳性对照的细胞也用载体pcB72.3转染，该载体 编码作为模型抗体的IgG₄/κ抗体的重链和轻链基因。还使用了阴性对照(仅水)。

每次转染时用100μL转染培养基稀释5μL脂转染胺-2000试剂(Invitrogen)，混 合并室温静置5分钟。将DNA与稀释的脂转染胺试剂合并、混合并再于室温静置 20分钟。然后将这200μL混合物加入含有细胞的24孔板的孔中，并在37℃培育细 胞4或10天。收集培养物上清液并通过离心澄清，然后通过装配ELISA(assembly ELISA)检测抗体的存在情况。

稳定转染：

如前所述，用于转染的细胞以细胞悬浮液培养。离心培养的细胞后用无血清培养 基洗涤一次，然后重悬浮浓度为1.43×10⁷细胞/毫升。将0.7ml体积的细胞悬液和40μg 质粒DNA加入电穿孔小杯中。然后将小杯放入电穿孔装置中施加250V和400μF的 单脉冲。转染后，用添加有10％dFCS的非选择性DMEM基础培养基将细胞以约2500 个宿主细胞/孔(5×10⁴/ml)分配入96孔板。在含有10％CO₂的空气中于36.5℃(在35.5 ℃-37.0℃之间)培养该平板。

转染后当天，每孔(150微升/孔)中加入添加有10％dFCS的DMEM基础培养基 /66μM L-甲硫氨酸磺酰亚胺(L-methionine sulphoximine)，至L-甲硫氨酸磺酰亚胺最终 浓度达到50μM。监测96孔板确定未转染细胞死亡和转染细胞集落出现的时间。转 染细胞集落大约在转染后3到4周变得明显。检查所有的细胞系，进一步增殖单个 集落孔中的细胞。

评估静态培养细胞系的产率

培养96孔转染平板约3周后形成细胞集落。显微镜检得到的集落以验证具有进 行试验的合适大小(覆盖孔底面积60％以上)的和每孔只有一个的集落。

将合适的集落转移到含有1mL选择性培养基(DMEM基础培养基/10％dFCS/ 25μM L-甲硫氨酸磺酰亚胺)的24孔板的孔中。在含有10％CO₂的空气中36.5℃(在 35.5℃-37.0℃之间)培养这些细胞14天。收集各孔上清液用蛋白AHLPC方法分析存 在的抗体浓度。

装配ELISA：

用夹心ELISA(测量装配的人IgG)测定样品的抗体浓度。其包括将样品和标准品 捕获到包被有抗人Fc抗体的96孔板上。用连接辣根过氧化物酶的抗人轻链抗体和 产色的酶底物TMB显示结合的抗体。与标准品比较，显色程度与样品中存在的抗体 浓度成比例。

蛋白AHPLC：

在Agilent 1100HPLC上进行蛋白A亲层析法测定IgG。IgG产物选择性地结合 于Poros蛋白A免疫检测柱。从柱子上洗去不结合的物质，留下的结合抗体通过降 低溶剂pH释放。检测洗脱液280nm吸光度值，用通用的抗体标准品(用Chemstation 软件)并对消光系数的差异进行修正来定量产物。

载体构建

a)重链cDNA

采用脂转染胺-2000(Invitrogen)按照制造商的说明将pcB72.3表达载体(示于图1) 瞬时转染入CHOK1SV细胞以得到pcB72.3的HC cDNA。第二天提取转染细胞的总 RNA作为cDNA合成的模板。采用特异性引物扩增cDNA在的cB72.3HC序列。由 于该序列衍生自mRNA因此缺乏内含子序列。然后将该序列克隆入载体pEE6.4，并 与载体pConK+VL组合产生pcB72.3HC cDNA载体(示于图2)。

b)经基因优化的基因

对编码HC cB72.3和LC cB72.3的cDNA序列进行基因优化。对序列进行优化以 除去所有潜在的副作用序列并优化密码子利用。然后采用基因装配法合成最佳序列。 装配后，然后将分别描述于SEQ ID No.1和3的HC和LC编码序列通过Hind III和 EcoR I位点克隆入载体pEE6.4(用于HC)和载体pEE12.4(用于LC)。然后通过克隆 Not I和Pvu I限制性酶位点将HC和LC表达盒合并以产生DGV。如此产生的载体 pcB72.3Geneart HC和pcB72.3Geneart HC/LC示于图3。

c)制备DNA进行转染

对于cDNA和Geneart载体，用Qiagen Maxiprep试剂盒产生一批DNA。对于所 有转染，用Pvu I消化以将载体DNA线性化。取样品跑琼脂糖凝胶以便检测消化的 质粒从而证实是否完全线性化。用苯酚∶氯仿萃取纯化DNA并等分成每份40μg。加 入0.1体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2体积份冰冷的100％乙醇以沉淀每份中的DNA， 并储存于-20±5℃直至使用。

培养物的转染、选择和过度生长

采用标准电穿孔法用载体构建物转染CHOK1SV细胞。将细胞接种到96孔板上。 第二天加入50μM选择培养基。

转染4周后筛选平板中产生的集落。每次转染时将约100个合适大小的集落转移 到24孔板内含25μM MSX的培养基中。使细胞过度生长2周，之后收集各孔内的 细胞培养培养基并通过蛋白A HPLC评价存在的cB72.3抗体的水平。

结果和讨论

基因组和cDNA重链序列的对比

评估了稳定转染中从pcB72.3HC编码序列中除去内含子的作用。使每个转染子 组的104个集落在24孔板内过度生长并确定所得各细胞系的抗体浓度。结果总结于 图4和表1。从数据可见，pcB72.3HC编码序列中存在内含子对产生的抗体的水平 没有影响。证明启动子序列中的内含子是使基因表达最大化所必需的，因此可能该 内含子单独促进了有效的基因表达。

这是通过两种可能的机制实现的。其一是当存在内含子时启动子本身更加有效， 或者是该启动子衍生的内含子剪切后产生的mRNA更加稳定。由该数据可见，对内 含子如那些存在于HC编码序列中的内含子进行额外剪切不会提高基因表达。

表1：基因组和cDNA数据的统计分析比较

对经基因优化的基因序列的分析

评估了稳定转染中DNA序列优化的作用。使每个转染子组的104个集落在24 孔板内过度生长并确定所得各细胞系的抗体浓度。由于基因优化序列为cDNA形式 而非标准基因组形式，因此将数据与对照的cDNA形式进行比较。结果总结于图5 和表2。

基因优化显示，同时对两条链进行优化使抗体浓度中值提高35％(p＝0.006)。然 而，仅对HC优化未导致抗体表达显著增加。这些数据说明，对LC进行优化也是提 高抗体表达所必需的。其原因可能是LC序列不是最佳的，而优化能使LC的表达水 平与HC齐平。例如，从LC序列中除去HC序列中不存在的RNA不稳定性基序。

表2：基因优化数据的统计分析

基因优化恒定区对抗体产量的影响

分别产生含有IgG1、IgG2和IgG4重链和轻链基因的载体，其中，重链和轻链基 因的恒定区被基因优化，而重链和轻链基因的可变区未被优化。因此产生了含有具 有优化恒定区和非优化可变区的IgG1基因序列的载体pConG1GA，含有具有优化恒 定区和非优化可变区的IgG2基因序列的载体pConG2GA，和含有具有优化恒定区和 非优化可变区的IgG4基因序列的载体pConG4GA。

用标准方法检测所得载体的抗体产量并与非优化的cDNA载体尤其是含有非优 化IgG1重链和轻链基因的载体G1cDNA、含有非优化IgG2重链和轻链基因的载体 G2cDNA和含有非优化IgG4序列的载体pcB72.3HCcDNA的进行比较。同时将完全 优化的载体pcB72.3GAHC/LC，一种具有基因优化的恒定区和基因优化可变区的载 体，用作第一个实验的对照。结果总结于图6。将载体pConG1GA和G1cDNA进行 比较显示，IgG1优化恒定区使表达提高。同时，直接比较载体pConG2GA和G2cDNA 显示，IgG2优化恒定区使表达提高。相反，比较载体pConG4GA和pcB72.3HCcDNA 可知，IgG4优化不能使表达提高。因此，这些结果显示，使用基因优化的恒定区能 提高平均抗体表达。

注意，从单独实验获得的IgG4数据解释了在两组转染中观察到的对照值之间的 差异。

序列表

<110>英国龙沙生物医药股份有限公司(Lonza Biologics plc.)

<120>在哺乳动物宿主细胞中高水平表达重组抗体

<130>LBP1009PCT00

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa    60

gcttgccgcc accatggagt ggagctgggt gttcctgttc ttcctgagcg tgaccaccgg    120

cgtgcacagc caggtgcagc tgcagcagag cgacgccgag ctggtgaagc ctggcgccag    180

cgtgaagatc agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gatcacgcca tccactgggc    240

caagcagaag cccgagcagg gcctggagtg gatcggctac atcagccccg gcaacgacga    300

catcaagtac aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag    360

caccgcctac atgcagctga acagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcaa    420

gcggagctac tacggccact ggggccaggg caccaccctg acagtgagca gcgccagcac    480

caagggccca agcgtgttcc ccctggcccc ctgcagcaga agcaccagcg agagcacagc    540

cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag    600

cggagccctg acaagcggag tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta    660

ctccctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcaccaaga cctacacctg    720

caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa agtggacaag cgcgtggaga gcaagtacgg    780

ccctccctgc cccagctgcc ctgcccccga gttcctgggc ggacccagcg tgtttctgtt    840

cccccccaag cccaaggata ccctgatgat cagccggacc cctgaagtga cctgcgtggt    900

ggtggatgtg agccaggagg accccgaagt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga    960

agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt    1020

gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaagt    1080

gagcaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc    1140

aagagagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag gagatgacca agaaccaggt    1200

gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag    1260

caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgatggcag    1320

cttcttcctg tacagccggc tgaccgtgga taagagcaga tggcaggagg gcaacgtgtt    1380

cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaaga gcctgagcct    1440

gtccctgggc aagtgagaat tccgagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt    1500

<210>2

<211>460

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1               5               10                      15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys

            20              25                      30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45

Thr Asp His Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn

65                  70                  75                  80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

                85                  90                  95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Phe Cys Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr

        115                 120                 125

Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

    130                 135                 140

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

145                 150                 155                 160

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

                165                 170                 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

            180                 185                 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

        195                 200                 205

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

    210                 215                 220

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

225                 230                 235                 240

Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

                245                 250                 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

            260                 265                 270

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

        275                 280                 285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

    290                 295                 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

305                 310                 315                 320

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

                325                 330                 335

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

            340                 345                 350

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

        355                 360                 365

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

    370                 375                 380

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

                405                 410                 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

            420                 425                 430

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

        435                 440                 445

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

    450                 455             460

<210>3

<211>800

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa    60

gcttgccgcc accatgagcg tgcccaccca ggtgctgggc ctgctgctgc tgtggctgac    120

cgatgccaga tgcgacatcc agatgaccca gagccccgcc agcctgagcg tgtctgtggg    180

cgagaccgtg accatcacct gcagagccag cgagaacatc tacagcaacc tggcctggta    240

tcagcagaag cagggcaaga gcccccagct gctggtgtac gccgccacca acctggccga    300

cggcgtgccc agcagattca gcggcagcgg ctccggcacc cagtacagcc tgaagatcaa    360

cagcctgcag agcgaggatt tcggcagcta ctactgccag cacttctggg gcacccccta    420

cacctttggc ggcggaacca ggctggagat caagcggacc gtggccgccc ccagcgtgtt    480

catcttcccc cccagcgatg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgtctgct    540

gaacaacttc taccctcgag aggccaaagt gcagtggaaa gtggacaacg ccctgcagtc    600

cggcaacagc caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag    660

cagcaccctg accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaagtgtacg cctgcgaagt    720

gacccaccag ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgctgaga    780

attccgagct ccagcttttg                                                800

<210>4

<211>234

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1               5                   10                  15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

            20                  25                  30

Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

        35                  40                  45

Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

    50                  55                  60

Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65                  70                  75                  80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn

                85                  90                  95

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

            100                 105                 110

Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

        115                 120                 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

    130                 135                 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145                 150                 155                 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

                165                 170                 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

            180                 185                 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

        195                 200                 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

    210                 215                 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230