乳腺癌转移和预后分子分型基因群及其基因芯片制备和应用方法

摘要

本发明公开了三组可以对乳腺癌进行转移和预后分子分型的基因群；公开了由这些基因群的特异性cDNA或寡核苷酸以点阵形式点样于固相支持物表面制备的乳腺癌转移和预后分子分型的基因芯片；公开了基于乳腺癌患者的原发癌组织标本的cDNA或其扩增产物荧光标记后与乳腺癌转移和预后分子分型的基因芯片杂交得到的基因表达谱对患者进行转移和预后分子分型的非监督聚类图谱；公开了利用乳腺癌转移和预后分子分型的基因芯片和基因表达谱对乳腺癌患者转移和预后分子分型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及功能基因组学及基因芯片制备、杂交和分析技术。具体而言是在人功能基因组表达谱范围内筛选可用于乳腺癌转移和预后分子分型的基因群，并制备成基因芯片，应用于乳腺癌患者的转移和预后预测。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国近年来发病率逐年上升，且呈年轻化趋势，成为妇女健康的重大威胁。尽管临床诊断和治疗措施不断改进，但乳腺癌患者的死亡率仍得不到有效控制，复发和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。提高乳腺癌患者的生存率、改善预后的关键在于早期对乳腺癌患者的转移潜能及预后进行准确评估，从而指导临床进行及时、有效的治疗。

乳腺癌是全身性疾病，肿瘤细胞的淋巴道和血道播散导致的全身转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的关键所在。目前临床仍然采用肿瘤大小，临床分期、组织学分级、淋巴结受累状况及激素受体表达等作为常规预后因素，并用于指导术式和放疗的局部治疗范围的选择，以及化疗和激素治疗的全身控制方案的制定。但临床资料显示20-30％淋巴结阳性患者在15-30年内不会发生远处转移，而大约30％淋巴结阴性乳腺癌患者在术后5-10年内可能发生远处转移。转移有些发生在肿瘤进展的晚期，但也可能出现在肿瘤发生的早期。对于前者的患者群，目前临床常规的预后指标可以比较准确的预测患者的预后，而国内外各种治疗方案的制定策略也是针对于这部分患者；但对于后者的患者群，由于依据临床常规的预后指标不能预测患者的高转移潜能，因此使这部分患者往往失去综合治疗的有利时机，无转移生存期和总生存期大大缩短。

组织细胞转移表型的获得是以涉及转移生物学过程的基因型改变为基础，转移生物学过程的复杂性和乳腺癌组织细胞生长的异质性，决定了这种基因型并非是单基因或少数几个基因的异常改变，因此目前已知的转移预后相关基因c-erbB-2、p53等并不能实现对临床患者的预后预测。而功能基因组学的技术方法如消减杂交、mRNA差异显示、代表性差异分析、RNA指纹技术、抑制性削减杂交和基因表达序列分析等是在基因组表达谱范围内筛选新的转移相关基因的有效方法。基因芯片技术则以高通量平行筛选疾病相关基因的技术优势，为研究肿瘤发生发展中多基因改变的分子机制提供了有力的工具，特别在转移基因群的筛选和预后分子分型中具有特殊优势。

本发明利用人表达谱基因芯片，通过比较乳腺原发癌与淋巴结转移癌，以及淋巴结转移阴性与转移阳性患者的原发癌，筛选乳腺癌转移和预后预测基因群，用于乳腺癌患者预后的分子分型，筛选高危转移和亚临床转移患者，以期指导临床实施个体化治疗，延长患者无病生存期和总生存期。

发明内容

本发明利用人表达谱基因芯片筛选得到由79个基因组成的“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”，它们在多病例淋巴结转移阳性乳腺的原发癌与配对的淋巴结转移癌间有相同的差异表达趋势，不但可以区分乳腺原发癌和淋巴结转移癌，而且可以预测淋巴结阳性乳腺癌患者的预后；利用人表达谱基因芯片筛选得到由56个基因组成的“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”，它们是淋巴结转移阳性病例与转移阴性病例的乳腺原发癌间差异表达的基因群，能准确判断乳腺癌患者的腋窝淋巴结的转移状态；在原发癌与配对淋巴结转移癌筛选得到的79个差异表达基因和淋巴结转移阴性与转移阳性乳腺原发癌间的56个差异表达基因的基础上，筛选得到由32个基因组成的“淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群”，基于这一基因群可以筛选淋巴结阴性乳腺癌中的高危转移患者。以上三组基因群可以制备成“乳腺癌转移预报基因芯片”，用于通过乳腺癌患者原发癌或针吸活检组织样本进行转移和预后分子分型，即用“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”判断患者的腋窝淋巴结转移状态，淋巴结转移阳性者用“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”预测患者预后，淋巴结转移阴性者用“淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群”筛选高危转移患者。由此，为临床患者的转移预后预测和适时个体化治疗提供客观依据。

附图说明

图1是基于26例淋巴结转移阳性乳腺原发癌“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”的基因表达谱对病例的聚类结果。

图2是基于20例乳腺原发癌“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”的基因表达谱对病例的聚类结果。

图3是基于49例常规病理诊断转移阴性乳腺原发癌“淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群”的基因表达谱对病例的聚类结果。

图4是基于“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”分类9例验证病例的聚类结果。

图5是基于“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”对淋巴结转移阳性乳腺癌患者预后分子分型的Kaplan-Meier生存分析结果。

图6是基于“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”对29例验证样本聚类结果。

图7是基于包括“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”和“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”的134个基因对49例乳腺原发癌的k-mean聚类结果。

图8是转移组和非转移组Kaplan-Meier生存分析结果。

具体实施方式

通过以下实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

表1是淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群。

表2是乳腺癌淋巴结转移诊断基因群。

表3是淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群。

实施例1、淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群筛选和应用

材料方法

1.病例选择及标本处理

所有标本均取自2002年1月至2003年12月天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科收治的行乳腺根治术的淋巴结转移阳性乳腺癌患者，病理类型为浸润性导管癌，有2个以上转移阳性淋巴结。每一病例分别取乳腺原发癌和淋巴结转移癌样本，经组织切片HE染色证实淋巴结转移癌中癌细胞占75％以上，组织样本经液氮速冻后-80℃保存。以26例淋巴结阳性乳腺癌病例作为训练病例(training cases)，平均随访43个月，其中11例发生远处转移；另外9例淋巴结阳性乳腺癌病例作为验证病例(testingcases)，平均随访43个月，其中5例发生远处转移。病例资料见表4。

表426例训练样本和9例验证样本病例资料

临床资料    训练病例(26例)    验证病例(9例)临床分期(UICC肿瘤分期)IIIIIIIV    4    7    12    3    1    3    5    0肿瘤大小(cm)≤22-5＞5    7    13    6    3    4    2淋巴结阳性数1-34-9≥10    10    3    13    5    3    1组织学分级IIIIII    1    16    9    0    5    4ER阳性阴性    14    12    5    443个月内远处转移阳性阴性    11    15    5    4

2.样本的荧光标记

细胞RNA提取及纯化：采用Trizol Reagent(Invitrogen公司，美国)提取样本组织细胞总RNA，方法按照试剂说明。用无RNA酶水溶解RNA，紫外分光光度法检测RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，RNeasymidi kit(Qiagen公司，美国)纯化。

双链cDNA合成：取10μg纯化的细胞总RNA，以T7-Oligo(dT)15

(5′-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3，V为G、C和A，上海博亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit(大连宝生物有限公司，中国)合成双链cDNA，QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化合成的双链cDNA。

以cDNA为模板体外转录合成cRNA：用T7 RiboMAX Express LargeScale RNA Production System(Promega公司，美国)进行体外转录，转录产物用RNeasy midi kit(Qiagen公司，美国)纯化。

以cRNA为模板体外反转录：使用SuperScript^TM II反应体系和9mer随机引物进行反转录。反转录产物用QIAquick PCR Purification Kit纯化。

随机引物标记：使用随机引物标记试剂盒(大连宝生物有限公司，中国)，以cRNA的体外反转录产物为模板，进行随机引物标记。Cy3标记乳腺原发癌样本，Cy5标记转移癌样本。标记产物用QIAquick PCRPurification Kit纯化。标记产物离心浓缩抽干并溶于16.8μl去离子水中，准备用于芯片杂交。

3.基因芯片杂交

人表达谱基因芯片为北京博奥生物芯片有限公司制备的人Oligo芯片。芯片上所有基因取自Qiagen公司的人类基因70mer Oligo库，点样在一张75mm×25mm、经过化学修饰的载玻片上，含约23232个基因点，包括21329个人功能基因，以12个看家基因作为阳性对照，12个人工合成的与人基因没有同源性的70mer Oligo DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标。整个点阵分成48个亚阵，每个亚阵有22行，22列。点间距为185μm，点的直径约为140μm。基因芯片经60℃水合，250mJ紫外交联，0.5％SDS及无水乙醇清洗后用于杂交。将原发癌与转移癌样本的荧光标记产物溶于30μL杂交液(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)中，与基因芯片在42℃杂交过夜。基因芯片在含0.2％SDS的2×SSC中42℃洗5min，在0.2×SSC中室温洗5min，离心甩干玻片。

4.杂交芯片的扫描及生物信息学分析

杂交芯片的扫描及数据初步提取：杂交后荧光标记的基因芯片用ScanArray Express双通道激光扫描仪(Packard Bioscience公司，美国)扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon公司，美国)对芯片图像进行分析，荧光强度采用Lowess方法进行标准化^[1]。Cy3和Cy5的荧光强度值同时小于100的基因为无效基因，Cy3或Cy5之一的荧光强度值大于100的为有效表达基因，从其中筛选差异表达基因。

共同差异表达基因筛选：计算Lowess方法标准化后Cy5与Cy3的比值为ratio值，ratio值大于1.5或小于0.67为1.5倍差异表达基因。筛选26例中14例以上有1.5倍共同差异表达、Cy3与Cy5荧光强度值之差大于500、且配对t检验P＜0.05的基因为共同差异表达基因。

样本聚类：采用Cluster软件和Treeview软件基于表1中的差异表达基因对乳腺原发癌进行平均聚类分析。

5.统计学分析

采用Kaplan-Meier法和COX比例风险回归对基于差异基因分组的患者的43个月的随访结果进行生存期分析。

结果判断

1.差异表达基因筛选

有79个基因在26例训练病例中的14例，存在原发癌与转移癌达1.5倍以上共同差异表达趋势(上调或下调)，且配对t检验P＜0.05，见表1。其中包括58个基因在转移癌中较原发癌上调和21个在转移癌中较原发癌基因下调。这些基因涉及细胞粘附运动、细胞外基质成分、细胞生长代谢、信号传导、转录调节等与肿瘤转移相关的生物学过程。

2.基于原发癌差异基因表达的预后分型

用79个差异表达基因对26例训练病例的原发癌进行平均聚类分析，结果可以将患者分两组(18例和8例)，43个月内发生远处转移的病例分别为9/18和2/8，统计学分析P＜0.05，分别称为转移“高危组”和“低危组”两个亚组，见图1。由此认为由79个差异基因组成的基因群可以预测淋巴结阳性乳腺癌患者的预后。

为了验证该基因群对预后分型的准确性，在26例训练病例中加入9例验证病例重新聚类。结果验证病例中，5例有远处转移病例均被分类到“高危组”；4例无远处转移病例中，3例分类到“低危组”，1例分类到“高危组”，见图4。Kaplan-Meier生存分析表明“低危组”43个月无转移生存期高于“高危组”，差异有显著性(P＝0.026)，见图5。

本研究同时采用Kaplan-Meier方法分析了组织学分级、肿瘤大小、雌激素受体(ER)状态、临床分期和阳性淋巴结数与乳腺癌预后的关系，结果组织学分级(P＝0.002)、肿瘤大小(P＝0.018)和ER(P＝0.008)与乳腺癌预后相关，而临床分期(P＝0.059)和阳性淋巴结数(P＝0.138)与乳腺癌预后无关。随后，79个差异基因组成的基因表达谱、组织学分级、肿瘤大小和ER状态被引入Cox’s风险比例回归模型中，结果通过基因表达谱分类的“高危组”淋巴结阳性乳腺癌患者43个月内发生远处转移的危险度较“低危组”高4.65倍(95％CI 1.02-21.13，P＝0.047)，优于组织学分级(OR＝3.015，95％CI 1.01-9.02)和ER(OR＝2.95，95％CI0.97-9.01)，而肿瘤大小被从回归方程中剔除。

技术优势

腋窝淋巴结状态是临床乳腺癌患者预后预测及制定治疗方案的重要依据。淋巴结转移阳性患者的预后较差，生存期显著低于无淋巴结转移者。根据现行的乳腺癌系统治疗原则，所有淋巴结阳性患者都需要接受乳房(或肿物)切除、腋窝淋巴结清扫、和/或胸大肌、胸小肌切除、辅助化疗和术后放疗(临床T3或T4期；N2或N3期；锁上、锁下或内乳淋巴结浸润；4个以上阳性淋巴结的患者)。但是。临床资料显示，有20-30％淋巴结阳性患者在15-30年内不会发生远处转移，这些患者不能为常规病理学方法识别而接受不必要的过度治疗，患者并不能从辅助治疗中获益，反而遭受其潜在的副作用。

基因芯片技术可以实现在基因表达谱范围内对疾病相关基因进行比较研究，特别是对肿瘤发生、发展中涉及复杂生物学过程的多基因异常改变的研究具有特殊的优势。利用基因表达谱芯片筛选乳腺癌转移相关基因和进行预后分型的研究已有报道。Van’t Veer等^[2]使用包含25,000个基因的cDNA芯片对78例淋巴结阴性55岁以下乳腺癌患者的基因表达谱进行分析，并根据每个差异表达基因与随访预后的相关性对其中78例肿瘤进行监督系统聚类(supervised hierarchical clustering)分析，筛选到一组包含70个基因的基因群，基于原发癌该基因群的表达谱可以对患者预后进行准确的分类，其中，“预后不良组”(poor prognosis)5年内发生远处转移的概率是“预后良好组”(good prognosis)的28倍。Wang等^[3]也筛选到一个由76个基因组成的基因群可以预测5年内淋巴结转移阴性乳腺癌患者的预后。这些研究表明乳腺原发癌的基因表达谱可以预测患者预后。也有一些研究^[4-7]比较乳腺原发癌和配对转移癌的基因表达谱差异，但由于样本量小或随访时间短，未能对这些差异基因的预后预测能力进行分析。

本研究将淋巴结转移癌作为乳腺原发癌的高转移亚克隆，采用表达谱基因芯片筛选在多病例中乳腺原发癌与配对的淋巴结转移癌有共同差异表达趋势的基因。筛选得到一组包括79个基因的基因群，基于该基因群不但可以区分淋巴结转移癌和原发癌，而且可以将乳腺原发癌聚类为“高危组”和“低危组”两个亚组，“高危组”患者43个月内发生远处转移的风险高于“低危组”4.65倍(95％CI 1.02-21.13)，表明基于乳腺原发癌和淋巴结转移癌间的差异基因群的基因表达谱可以预测淋巴结阳性乳腺癌患者的预后，且是独立的预后预测指标。根据本组预后分子分型的结果，大约30％淋巴结阳性患者将不发生远处转移，因此，手术前可以针吸活检患者的原发癌组织，通过检测预测基因群的表达谱可以预测患者预后，从而指导临床缩小手术切除范围，降低放、化疗的过度治疗。

本组研究筛选得到的在乳腺原发癌和淋巴结转移癌中差异表达的基因群，不仅可以区分乳腺原发癌和淋巴结转移癌，同时还可以对淋巴结阳性乳腺癌患者的预后进行预测，指导临床实施个体化治疗。

实施例2、乳腺癌淋巴结转移诊断基因群筛选和应用

材料和方法

1.病例选择和标本处理

本组49例乳腺癌原发癌组织均取自2002年1月至2003年12月天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科收治的行乳腺根治术的乳腺癌患者，经病理组织切片的HE染色证实为浸润性导管癌(WHO分类)，平均随访时间43个月。随机选取10例淋巴结阴性乳腺癌患者和10例淋巴结阳性乳腺癌患者作为训练病例，19例淋巴结阴性患者和10例淋巴结阳性患者作为验证病例，病例资料见表5。另外，取32例乳腺肿瘤患者的正常乳腺组织提取RNA后等量混合作为对照样本。所有组织样本均经液氮速冻后于-80℃保存备用。

表520例训练样本和29例验证样本病例资料

临床资料    训练病例(20例)    验证病例(29例)临床分期(UICC肿瘤分期)IIIIIIIV    5    13    2    0    4    18    6    1肿瘤大小(cm)≤22-5    10    10    12    17淋巴结状态阴性阳性    10    10    19    10组织学分级IIIIII    2    16    2    4    19    6ER阳性阴性    17    3    15    1443个月内远处转移阳性阴性失访    1    17    2    9    19    1

2.组织样本标记

总RNA提取、双链cDNA合成、体外转录合成cRNA、cRNA的反转录、cDNA的荧光标记和基因芯片杂交的方法同实施例1。各实验样本标记Cy5，正常对照样本标记Cy3。

3.基因芯片杂交

每一Cy5标记的49例乳腺癌样本与Cy3标记的由32例正常乳腺组织混合而成的正常对照样本在同一芯片上杂交，方法同实施例1。

4.生物信息学分析

数据初步提取：杂交的基因芯片扫描后得到的荧光强度值采用Lowess方法进行标准化^[1]，计算各实验样本与对照样本的比值。Cy3或Cy5之一的荧光强度值大于100的为有效表达基因。

差异表达基因筛选：筛选在80％病例中表达、淋巴结转移阳性与转移阴性组间t检验P＜0.05且与淋巴结状态的相关系数大于0.55的基因作为淋巴结转移阳性组与淋巴结转移阴性组间的差异表达基因。

样本聚类：采用Cluster软件和Treeview软件基于差异基因的表达谱对训练病例和验证病例进行平均聚类。

结果判断

1.淋巴结转移阳性与转移阴性乳腺原发癌的差异表达基因

本组筛选得到56个在淋巴结转移阳性和转移阴性乳腺癌原发癌间差异表达的基因。其中43个在淋巴结转移阳性乳腺癌中较转移阴性乳腺癌表达上调，13个基因在淋巴结转移阳性乳腺癌中较转移阴性乳腺癌表达表达下调。这些基因涉及细胞粘附运动、细胞生长代谢、信号传导等与乳腺癌转移相关的生物学过程，见表2。

2.差异基因预测淋巴结转移状态

基于乳腺原发癌的56个差异基因的表达谱对20例训练病例进行平均聚类分析，结果将淋巴结阳性和阴性患者完全分开，即分为淋巴结转移阴性和淋巴结转移阳性两组，见图2。

为了验证56个基因的基因群对淋巴结转移的预测能力，将29例验证病例原发癌的差异基因表达谱加入训练病例中，结果10例淋巴结阳性验证病例全部分类正确，而19例淋巴结阴性病例中的18例分类正确，仅1例错分到淋巴结阳性组中，而该病例在2年内发生脑转移。见图6。

技术优势

乳腺癌患者的腋窝淋巴结转移状态是临床预后预测和治疗方案制定的重要参考指标。在预后判断上，淋巴结转移阳性患者的预后较转移阴性患者差，且淋巴结转移阳性数与患者预后反向相关。在治疗上，随着乳腺癌早期诊断率的不断提高，手术范围由大趋小，因此，对于临床早期(I、II期)乳腺癌患者，保乳手术已逐渐成为首选术式。前哨淋巴结(sentinellymph nodes，SLN)活检后的病理诊断成为判断早期乳腺癌淋巴结转移状态是决定接受保乳手术者是否实施腋淋巴结清扫(axillary lymph nodesdissection，ALND)的依据。但常规病理诊断往往不能检出＜2mm的微转移灶，而前哨淋巴结微转移阳性者发生局部淋巴结复发和远处转移的概率显著高于无微转移者；同时，5.5～19.2％的跳跃性转移(skip metastases)也是SLN诊断的技术盲点，影响淋巴结转移患者的正确检出，而得不到根治性治疗^[8]。

本组研究采用基因芯片技术筛选得到由56个基因组成的基因群，可以准确分类淋巴结转移阳性和转移阴性的原发癌，仅有1例(C31-3)淋巴结阴性患者被错分到淋巴结转移阳性组。但临床资料表明，该病例患者在术后2年内发生脑转移。由此推测其在手术时可能已存在淋巴和/或血行的微转移。基于该乳腺原发癌组织的该基因群的表达谱可以准确判断患者的腋窝淋巴结转移状态，因此，将该组基因群命名为“淋巴结转移诊断基因群”。

该基因群经大样本临床病例验证后，有望用于通过针吸获得乳腺原发癌样本对淋巴结状态进行预测，指导临床实施个体化局部治疗和全身化疗，既可避免淋巴结阴性患者ALND的过度治疗，又可避免存在淋巴结微转移或高危转移的患者由于术式选择和综合治疗的姑息治疗引起的复发和转移。

实施例3、淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群筛选及其应用

乳腺癌具有组织细胞异质性的生物学特性，肿瘤细胞发生、进展直至转移的过程，既有在原发部位克隆性生长的量变的积累，也随时伴发选择性生长的高转移潜能细胞获得了逃逸和播散的能力，在腋窝淋巴结和远处脏器形成继发的转移癌。因此，转移癌有些是发生在肿瘤进展的晚期的所谓“异质性转移”，但也可能是出现在肿瘤发生早期的所谓“同质性转移”。本研究第一部分筛选得到79个基因在多病例乳腺原发癌和配对淋巴结转移癌间有共同差异趋势，这些基因表达改变是异质性转移的生物学基础，由于同质性转移的原发癌与配对的转移癌具有相同的基因的特征，而不能被筛选出来；本研究第二部分筛选得到的56个基因是在淋巴结转移阳性患者和转移阴性患者乳腺原发癌间有共同差异趋势，这些基因表达的差异是不同病例的原发癌具有不同转移能力的同质性转移的生物学基础。由于两种转移模式同时存在，因此认为两组基因的组合更能全面反映肿瘤细胞转移生物学基础，可能会更好地对患者进行分子分型和转移预后预测。本组研究将实施例1和实施例2的差异基因合并和优化用于乳腺原发癌分子分型和转移预后预测。

数据来源

1.候选基因群：包括实施例1筛选得到的在原发癌与配对转移癌之间差异表达的基因79个和实施例2筛选得到的在淋巴结转移阴性和转移阳性原发癌之间差异表达的基因56个，其中NEFL为两组基因中重合的基因，共计134个基因。

2.验证病例及候选基因表达：第二部分中全部49例乳腺癌病例及其基因芯片杂交结果中候选基因群基因表达量的全部数据作为该组研究的验证病例和这些病例原发癌的候选基因的相对表达量。

结果判定

基于49例乳腺原发癌的134个候选基因群的基因表达谱对病例进行k-mean聚类，聚类参数设为基因4类，样本4类。k-mean聚类结果发现A组基因群(见表3)在不同淋巴结状态及不同预后病例的原发癌间表达量有显著改变。结果见图7。

进一步基于A组的32个基因的原发癌表达谱对49例病例进行平均聚类分析。结果淋巴结转移阳性病例和平均随访43个月发生远处转移的病例均分布在右侧“转移组”，见图3。“转移组”中肿瘤分期高(P＝0.003)、组织学分级差(P＝0.006)、淋巴结转移阳性(P＝0.012)和43个月内发生远处转移(P＝0.033)的病例多于“非转移组”，差异均有显著性(P＜0.05)，而两组间肿瘤大小和雌激素受体状态无统计学差异(P＞0.05)，见表6。Kaplan-Meier生存分析结果表明，“转移组”与“无转移组”无瘤生存期差异具有显著性，P＝0.02，见图8。

表6基于转移预测基因群的分子分组与临床因素的关系

临床资料    非转移组    转移组  P临床分期(UICC肿瘤分期)I+IIIII+IV    22    0    18    9  0.003肿瘤大小(cm)≤22-5    10    12    12    15  0.944淋巴结状态阴性阳性    22    0    20    7  0.012组织学分级I+IIIII    22    0    19    8  0.006ER阳性阴性    5    17    12    15  0.11243个月内远处转移阴性阳性失访    21    1    2    18    9    1  0.033

本组研究联合第一部分和第二部分筛选得到的差异基因对乳腺原发癌进行分类，K-mean聚类结果提示，其中32个基因可以将远处转移和淋巴结转移的病例聚类在一起，组成“转移组”，只有一例淋巴结转移阴性而远处转移阳性病例分类在“非转移组”，因此该基因群可以作为“乳腺癌转移预测基因群”。另外，根据该基因群对病例的聚类，在“转移组”中有部分淋巴结转移阴性病例，预示这些病例已经存在或即将发生淋巴结或血行转移，是转移的高危患者。

现行的淋巴结阴性乳腺癌患者行辅助治疗的适应征大都以St.Gallen标准(肿瘤直径≥2cm，ER阴性，组织学分级2-3级，年龄＜35岁)^[16]和NIH标准(肿瘤直径≥1cm，ER阴性，组织学分级2-3级，年龄＜35岁)^[17]作为指导原则。根据这些原则，90％以上的淋巴结阴性的年轻乳腺癌患者应接受系统的辅助治疗。但这些患者中70-80％不发展为远处转移，所以这些患者不仅不能从治疗中获益，反而遭受潜在的副作用。基于乳腺原发癌的“乳腺癌转移预测基因群”的基因表达谱可以筛选常规诊断为淋巴结和血行转移阴性患者中的高危转移者和非转移者，为个体化治疗提供了客观依据。

综上所述，本发明共筛选得到三组可用于乳腺癌分子分型的基因群：由79个基因组成的“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”，由56个基因组成的“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”，由32个基因组成的“淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群”。这三组基因群可以分别以及合并制备成“乳腺癌转移预报基因芯片”，用于乳腺癌患者原发肿瘤针吸组织样本的分子分型，用“乳腺癌淋巴结转移诊断基因群”判断患者的腋窝淋巴结转移状态，淋巴结转移阳性者用“淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群”预测患者预后，淋巴结阴性者用“淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群”筛选高危转转移患者，由此，为临床转移预后预测和实现个体化治疗提供客观依据。本发明是从中国人乳腺癌病例标本中筛选得到适于中国人乳腺癌转移和预后预测的基因群。

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表1淋巴结阳性乳腺癌预后预测基因群

基因名  称  GB.accession    序列号基因描述  基因描述SPON1 AB018305Spondin 1，(f-spondin)extracellular matrix protein  Spondin1，(f-spondin)细胞外基质蛋白BIRC3 AF070674Baculoviral IAP repeat-containing 3  杆状病毒IAP包含重复序列3SFRP2 AF311912Secreted frizzled-related protein 2  分泌性卷曲相关蛋白2PDK4 AF334710Homo sapiens pyruvate dehydrogenase kinase 4 mRNA，3′untranslated region，partial sequence  人类丙酮酸脱氢酶激酶4mRNA，3′端非翻译区部分序列 AF343666Homo sapiens translocation associated fusion proteinIRTA1/IGA1(IRTA1/IGHA1)mRNA，complete cds  人类易位相关融合蛋白IRTA1/IGA1(IRTA1/IGHA1)mRNA  全序列RIS1 AF438313Ras-induced senescence 1  Ras诱导的衰老因子1 AK022342Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis，clone MAMMA1001744  人类cDNAFLJ12280，MAMMA1001744克隆PIGR AK026320Homo sapiens cDNA：FLJ22667 fis，clone HSI08385  人类cDNAFLJ22667，HSI08385克隆 AL359052Homo sapiens mRNA full length insert cDNA cloneEUROIMAGE 1968422  插入人类mRNA全长的cDNA克隆EUROIMAGE1968422RUNX2 AW469546ESTs  ESTsHTRA3 AY040094Serine protease HTRA3  丝氨酸蛋白酶HTRA3CTHRC1 BC014245Homo sapiens，Similar to RIKEN cDNA 1110014B07 gene，clone MGC：20766 IMAGE：4586039，mRNA，complete c  人类，与RIKEN cDNA1110014B07基因相似，MGC20766  克隆，mRNA全序列SNAI2 BC014890Slug homolog，zinc finger protein(chicken)  Slug同源的锌指蛋白(鸡)RAFTLI D42043KIAA0084 protein  KIAA0084蛋白

NFCGR3A J04162 Fc fragment of IgG，low affinity IIIb，receptor for(CD16)IgG的Fc段，低亲和区IIIb，CD16的受体TRA@ M12959 T cell receptor alpha locusT细胞受体α区COL1A2 NM_000089 Collagen，type I，alpha 2I型胶原α2COL3A1 NM_000090 Collagen，type III，alpha 1(Ehlers-Danlos syndrome type IV，autosomal dominant)III型胶原α1(埃勒斯-当洛综合征IV型，常染色体显性遗传)COL5A1 NM_000093 Collagen，type V，alpha 1V型胶原α1FBN1 NM_000138 Fibrillin 1(Marfan syndrome)原纤维蛋白(马凡氏综合症)COL5A2 NM_000393 Collagen，type V，alpha 2V型胶原α2CTSK NM_000396 Cathepsin K(pycnodysostosis)组织蛋白酶K(致密性成骨不全症)HBB NM_000518 Hemoglobin，beta血红蛋白βKRT14 NM_000526 Keratin 14(epidermolysis bullosa simplex，Dowling-Meara， Koebner)角蛋白14(单纯性大疱性表皮松解症)C7 NM_000587 Complement component 7补体成分7SELL NM_000655 Selectin L(lymphocyte adhesion molecule 1)L选择素(淋巴细胞粘附分子1)CALU NM_001219 CalumeninCalumeninCD48 NM_001778 CD48 antigen(B-cell membrane protein)CD48抗原(B细胞膜蛋白)COL6A1 NM_001848 Collagen，type VI，alpha 1VI型胶原α1COL11A1 NM_001854 Collagen，type XI，alpha 1XI型胶原α1CR2 NM_001877 Complement component(3d/Epstein Barr virus)receptor 2补体成分(3d/EB病毒)受体2FOXO1A NM_002015 Forkhead box O1A(rhabdomyosarcoma)Forkhead盒01A(横纹肌肉瘤)

FMO1 NM_002021Flavin containing monooxygenase 1黄素单氧化酶1FN1 NM_002026Fibronectin 1纤维粘连蛋白GRP NM_002091Gastrin-releasing peptide胃泌素释放肽KRT15 NM_002275Keratin 15角蛋白15LGALS1 NM_002305Lectin，galactoside-binding，soluble，1(galectin 1)凝集素，半乳糖结合，可溶，1(半乳糖凝素)LTB NM_002341Lymphotoxin beta(TNF superfamily，member 3)淋巴细胞毒素β(TNF超家族，成员3)LUM NM_002345LumicanLumicanMMP7 NM_002423Matrix metalloproteinase 7(matrilysin，uterine)基质金属蛋白酶7(基质溶解因子，子宫)GPNMB NM_002510Glycoprotein(transmembrane)nmb糖蛋白nmb(跨膜)PCOLCE NM_002593Procollagen C-endopeptidase enhancer前胶原C端肽链内切酶增强子PRG1 NM_002727Proteoglycan 1，secretory granule蛋白聚糖1，分泌颗粒PRSS11 NM_002775Protease，serine，11(IGF binding)丝氨酸蛋白酶11(IGF结合)PTPRC NM_002838Protein tyrosine phosphatase，receptor type，C蛋白酪氨酸磷酸酶，受体，CRGS1 NM_002922Regulator of G-protein signalling 1G蛋白信号调节因子1TGFB3 NM_003239Transforming growth factor，beta 3转化生长因子β3CDC45L NM_003504CDC45 cell division cycle 45-like(S.cerevisiae)CDC45细胞分裂周期素45样因子CILP NM_003613Cartilage intermediate layer protein，nucleotidepyrophosphohydrolase软骨中间层蛋白，核酸焦磷酸水解酶DUSP2 NM_004418Dual specificity phosphatase 2双特异性磷酸酶2ECM1 NM_004425Extracellular matrix protein 1细胞外基质蛋白1MMP2 NM_004530Matrix metalloproteinase 2(gelatinase A，72kD gelatinase，72kDtype IV collagenase)基质金属蛋白酶2(明胶酶A，72kD明胶酶，IV型胶原酶)

SPOCK NM_004598 Sparc/osteonectin，cwcv and kazal-like domains proteoglycan(testican)Sparc/骨连素，cwcv和kazal样蛋白聚糖域(睾丸)ITGBL1 NM_004791 Integrin，beta-like 1(with EGF-like repeat domains)整合素，β样因子1(含EGF样重复序列)EBI2 NM_004951 Epstein-Barr virus induced gene 2(lymphocyte-specific G protein-coupled receptor)EB病毒诱导的基因2(淋巴细胞特异性G蛋白偶连受体)ABCC1 NM_004996 ATP-bindingcassette，sub-family C(CFTR/MRP)，member 1ATP结合盒，亚家族C(CFTR/MRP)，成员1MRC2 NM_006039 Endocytic receptor(macrophage mannose receptor family)包吞受体(巨噬细胞甘露糖受体家族)NEFL NM_006158 Neurofilament，light polypeptide(68kD)神经微丝，轻链多肽(68kD)PDE6H NM_006205 Phosphodiesterase 6H，cGMP-specific，cone，gamma磷酸二酯酶6H，cGMP特异性，γPDGFRL NM_006207 Platelet-derived growth factor receptor-like血小板源性生长因子受体样因子CCL19 NM_006274 Small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)，member 19小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员19TNFAIP3 NM_006290 Tumor necrosis factor，alpha-induced protein 3肿瘤坏死因子α诱导蛋白TXNIP NM_006472 Thioredoxin interacting protein硫氧还蛋白作用蛋白OSF-2 NM_006475 Osteoblast specific factor 2(fasciclin I-like)特异性成骨细胞因子2(成束蛋白I样)CORO1A NM_007074 Coronin，actin binding protein，1A冠蛋白，肌动蛋白结合蛋白，1ATNFAIP6 NM_007115 Tumor necrosis factor，alpha-induced protein 6肿瘤坏死因子α诱导蛋白6STEAP NM_012449 Six transmembrane epithelial antigen of the prostate前列腺6次跨膜的上皮抗原CKTSF1B1 NM_013372 Cysteine knot superfamily 1，BMP antagonist 1半胱氨酸超家族1，BMP拮抗剂1

HSPC022 NM_014029  HSPC022 proteinHSPC022蛋白KLF2 NM_016270  Kruppel-like factor 2(lung)Krupple样因子2(肺)ASPN NM_017680  Asporin(LRR class 1)Asporin(LRR 1类)MS4A1 NM_021950  Membrane-spanning 4-domains，subfamily A，member 2(Fc  fragment of IgE，high affinity I，receptor跨膜4区，亚家族A，成员2，(IgE的Fc段，高亲和区1，受体)TCL1A NM_021966  T-cell leukemia/lymphoma 1 AT细胞白血病/淋巴瘤1AFREB NM_032738  Hypothetical protein MGC4595假想蛋白MGC4595OGN NM_033014  Osteoglycin(osteoinductive factor，mimecan)骨诱导因子ZFP36L2 U07802  Zinc finger protein 36，C3H type-like 2锌指蛋白36，C3H样因子2CSPG2 U16306  Chondroitin sulfate proteoglycan 2(versican)磷酸软骨素蛋白聚糖2(多功能聚糖)TRB@ X00437  T cell receptor beta locusT细胞受体β区CCL8 Y16645  Small inducible cytokine subfamily A(Cys-Cys)，member 8  (monocyte chemotactic protein 2)小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员8(单核细胞趋化蛋白2)

表2乳腺癌淋巴结转移诊断基因群

基因名称GB.accession序列号基因描述基因描述LARPAB018274KIAA0731 proteinKIAA0731蛋白PLCL2AB029015Phospholipase C，epsilon 2磷脂酶C，ε2KIAA1671AB051458KIAA1671 proteinKIAA1671蛋白MGC26885AF070574Homo sapiens clone 24819 mRNA sequence人类24819克隆mRNA序列LOC168850AF218032Homo sapiens clone PP902 unknown mRNA人类PP902克隆未知mRNAGK003AF226046GK003 proteinGK0003蛋白DIAPH1AK023345Homo sapiens cDNA FLJ13283fis，clone OVARC1001113，highly similar to Homo sapiens diaphanous 1(HDI人类FLJ13283cDNA，OVARC1001113克隆，与人类HDI高度同源YWHAGAK024230Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenaseactivation protein，gamma polypeptide酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，γ多肽AK024276Homo sapiens clone TA40 untranslated mRNA，completesequence人类TA40克隆非翻译mRNA，全序列AK024356Homo sapiens cDNA FLJ14294 fis，clone PLACE1008181人类FLJ14294cDNA，PLACE1008181克隆HSPC163AK024569HSPC163 protein HAPC163蛋白AK025316Homo sapiens cDNA：FLJ21663 fis，clone COL08885人类FLJ21663cDNA，COL08885克隆AK025902Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp586H0324(from cloneDKFZp586H0324)人类mRNA，DKFZp586H0324cDNA(源于DKFZp586H0324克隆)

 AK027107 Homo sapiens cDNA：FLJ23454 fis，clone HSI06959人类FLJ23454cDNA，HSI06959克隆FILIP1 AK027705 KIAA1275 proteinKIAA1275蛋白NID67 AK027847 Putative small membrane protein NID67假想小膜蛋白 AK055231 Homo sapiens cDNA FLJ30669 fis，clone FCBBF1000684人类FLJ30669cDNA，FCBBF1000684克隆 AK056651 Homo sapiens cDNA FLJ32089 fis，clone OCBBF2000712人类FLJ32089cDNA，OCBBF2000712克隆ATP8A2 AL390129 ATPase，aminophospholipid transporter-like，Class I，type 8A， member2ATP酶，氨基磷酸酯转移因子样基因，I类，8A型，成员2 BC003697 Homo sapiens，clone MGC：5564，mRNA，complete cds人类MGC5564克隆，mRNA全序列ROXAN BC004857 Homo sapiens，clone IMAGE：3690478，mRNA，partial cds人类IMAGE3690478克隆，mRNA部分序列H63 BC012124 Homo sapiens，clone MGC：20188 IMAGE：4564707，mRNA， complete cds人类MGC20188，IMAGE4564707克隆，mRNA全序列GLI4 BC014165 Homo sapiens，Similar to zinc finger protein 16(KOX 9)， clone MGC：20886 IMAGE：4549240，mRNA，comple人类，类似于锌指蛋白16(KOX9)，MGC：20886IMAGE：4549240克隆，mRNA全序列EPHX1 NM_000120 Epoxide hydrolase 1，microsomal(xenobiotic)环氧化物水解酶1，微粒体(异生素)ALB NM_000477 Albumin白蛋白ATP2B1 NM_001682 ATPase，Ca++transporting，plasma membrane 1ATP酶，Ca++转运，质膜1CDC25A NM_001789 Cell division cycle 25A细胞分裂周期25AFCN1 NM_002003 Ficolin(collagen/fibrinogen domain containing)1Ficolin(包括胶原/纤维蛋白原区域)1BECN1 NM_003766 Beclin 1(coiled-coil，myosin-like BCL2 interacting protein)Beclin1(卷曲-螺旋，肌球蛋白样BCL2作用蛋白)CNK NM_004073 Cytokine-inducible kinase细胞因子诱导的激酶FCGRT NM_004107 Fc fragment of IgG，receptor，transporter，alphaIgG的Fc段，受体，转运体，αPOU4F2 NM_004575 POU domain，class 4，transcription factor 2POU区域，4类，转录因子2

MAGEA9 NM_005365 Melanoma antigen，family A，9黑色素瘤抗原，家族A，9SOS1 NM_005633 Son of sevenless homolog 1(Drosophila)sevenless基因类似物(果蝇)ALKBH NM_006020 Alkylation repair；alkB homolog烷化修复，alkB类似物DNCLI2 NM_006141 Dynein，cytoplasmic，light intermediate polypeptide 2动力蛋白，胞质，轻链中间多肽2NEFL NM_006158 Neurofilament，light polypeptide(68kD)神经微丝，轻链多肽(68kD)DYRK2 NM_006482 Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 2双特异性酪氨酸-Y-磷酸化调节激酶2DIAPH2 NM_006729 Diaphanous homolog 2(Drosophila)Diaphanous类似物(果蝇)ZNF161 NM_007146 Zinc finger protein 161锌指蛋白161IKBKE NM_014002 IKK-related kinase epsilon；inducible IkappaB kinaseIKK相关激酶ε，可诱导的NF-kB激酶GCAT NM_014291 Glycine C-acetyltransferase(2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase)甘氨酸C-乙酰转移酶(2-氨基-3-酮基丁酸辅酶A连接酶)KIAA0133 NM_014777 KIAA0133 gene productKIAA0133基因产物CDC42 NM_015858 Cell division cycle 42(GTP binding protein，25kD)细胞分裂周期42(GTP结合蛋白，25kD)LOC51685 NM_016171 Prothymosin a14前胸腺素a14ZNF325 NM_016265 GIOT-3 for gonadotropin inducible transcription repressor-3绒毛膜促性腺激素诱导的转录抑制因子3的GIOT-3ALEX1 NM_016608 ALEX1 proteinALEX1蛋白BM-005 NM_016620 Hypothetical protein假想蛋白FLJ11126 NM_018332 Hypothetical protein FLJ11126假想蛋白FLJ11126AD24 NM_022451 Hypothetical protein FLJ12820假想蛋白FLJ12820MGC11279 NM_024326 Hypothetical protein MGC11279假想蛋白MGC11279EMILIN3 NM_024756 EMILlN-like protein EndoGlyx-1EMILIN样蛋白EndoGlyx-1

DKFZP586C1924 NM_032273Hypothetical protein DKFZp586C1924假想蛋白DKFZp586C1924PPP1R15B NM_032833Protein phosphatase 1，regulatory(inhibitor)subunit 15B蛋白磷酸酶1，调节(抑制)亚单位15BCYP51P1 U36926Cytochrome P450，subfamily 51 pseudogene 1细胞色素P450，亚家族51假基因1PAPOLA X76770Poly(A)polymerase alphaPoly(A)多聚酶α

表3淋巴结阴性乳腺癌转移预测基因群

基因名称 GB.accession 序列号基因描述基因描述LARP AB018274KIAA0731 proteinKIAA0731蛋白PLCL2 AB029015Phospholipase C，epsilon 2磷脂酶C，ε2MGC26885 AF070574Homo sapiens clone 24819 mRNA sequence人类24819克隆mRNA序列LOC168850 AF218032Homo sapiens clone PP902 unknown mRNA人类PP902克隆未知mRNADIAPH1 AK023345Homo sapiens cDNA FLJ13283 fis，clone OVARC1001113，highly similar to Homo sapiens diaphanous 1(HDI人类FLJ13283cDNA，OVARC1001113克隆，与人类HDI高度同源YWHAG AK024230Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenaseactivation protein，gamma polypeptide酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，γ多肽 AK024356Homo sapiens cDNA FLJ14294 fis，clone PLACE1008181人类FLJ14294cDNA，PLACE1008181克隆 AK025316Homo sapiens cDNA：FLJ21663 fis，clone COL08885人类FLJ21663cDNA，COL08885克隆 AK027107Homo sapiens cDNA：FLJ23454 fis，clone HSI06959人类FLJ23454cDNA，HSI06959克隆 AK055231Homo sapiens cDNA FLJ30669 fis，clone FCBBF1000684人类FLJ30669cDNA，FCBBF1000684克隆 AK056651Homo sapiens cDNA FLJ32089 fis，clone OCBBF2000712人类FLJ32089cDNA，OCBBF2000712克隆 BC003697Homo sapiens，clone MGC：5564，mRNA，complete cds人类MGC5564克隆，mRNA全序列H63 BC012124Homo sapiens，clone MGC：20188 IMAGE：4564707，mRNA，complete cds人类MGC20188，IMAGE4564707克隆，mRNA全序列GLI4 BC0_14165Homo sapiens，Similar to zinc finger protein 16(KOX9)，clone MGC：20886 IMAGE：4549240，mRNA，comple人类，类似于锌指蛋白16(KOX 9)，MGC：20886IMAGE：4549240克隆，mRNA全序列EPHX1 NM_000120Epoxide hydrolase 1，microsomal(xenobiotic)环氧化物水解酶1，微粒体(异生素)

ATP2B1 NM_001682 ATPase，Ca++transporting，plasma membrane 1ATP酶，Ca++转运，质膜1CDC25A NM_001789 Cell division cycle 25A细胞分裂周期25ABECN1 NM_003766 Beclin 1(coiled-coil，myosin-like BCL2 interacting protein)Beclin1(卷曲-螺旋，肌球蛋白样BCL2作用蛋白)FCGRT NM_004107 Fc fragment of IgG，receptor，transporter，alphaIgG的Fc段，受体，转运体，αMAGEA9 NM_005365 Melanoma antigen，family A，9黑色素瘤抗原，家族A，9DNCLI2 NM_006141 Dynein，cytoplasmic，light intermediate polypeptide 2动力蛋白，胞质，轻链中间多肽2ZNF161 NM_007146 Zinc finger protein 161锌指蛋白161GCAT NM_014291 Glycine C-acetyltransferase(2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase)甘氨酸C-乙酰转移酶(2-氨基-3-酮基丁酸辅酶A连接酶)LOC51685 NM_016171 Prothymosin a14前胸腺素a14ZNF325 NM_016265 GIOT-3 for gonadotropin inducible transcription repressor-3绒毛膜促性腺激素诱导的转录抑制因子3的GIOT-3BM-005 NM_016620 Hypothetical protein假想蛋白FLJ11126 NM_018332 Hypothetical protein FLJ11126假想蛋白FLJ11126AD24 NM_022451 Hypothetical protein FLJ12820假想蛋白FLJ12820MGC11279 NM_024326 Hypothetical protein MGC11279假想蛋白MGC11279CYP51P1 U36926 Cytochrome P450，subfamily 51 pseudogene 1细胞色素P450，亚家族51假基因1PAPOLA X76770 Poly(A)polymerase alphaPoly(A)多聚酶αCR2 NM_001877 Complement component(3d/Epstein Barr virus)receptor 2补体成分(3d/EB病毒)受体2