一种苦马豆素降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ－1及其制备方法

摘要

本发明公开了一种苦马豆素降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ－1，该菌体呈球杆状，0.2～0.3μm×0.5～1.0μm，革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽孢，无运动性；菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，不透明；该菌株从埋藏过从甘肃、西藏、内蒙、青海等地生长的疯草的土壤中经人工分离、筛选而得，其于2007年7月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 207108。该菌株具有降解疯草主要毒素苦马豆素(Swainsonine，SW)的特性。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，具体涉及一种能够有效降解疯草主要毒素苦马豆素(Swainsonine，SW)的降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ-1，还涉及该降解菌制备和培养方法及其应用。

背景技术

疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm²，占全国草场面积的2.8％。。由于疯草具有很强的适应能力，在荒漠草原上生长旺盛，而且返青早，枯萎迟，放牧动物在其它植物缺少或长势不好的情况下，长期或大量采食，造成大批家畜中毒死亡，或母畜不孕、流产、胎儿畸形、公畜不育及畜产品质量下降，给草原畜牧业造成巨大的经济损失。

苦马豆素(Swainsonine，SW)是疯草(Locoweed)类植物体内含有的水溶性吲哚兹定生物碱，分子式为C₈H₁₅NO₃，化学名称为1，2，8-三羟基八氢吲哚里西啶(trihydroxyoctahydro-indolizidine)，是疯草类植物的主要有毒成分之一。苦马豆素能抑制溶酶体α-甘露糖苷酶活性，使细胞内低聚糖聚积，造成细胞空泡化，从而使细胞失去正常功能，甚至造成细胞死亡，还能抑制高尔基甘露糖苷酶II，影响糖蛋白的合成、处理和转移，这些导致细胞粘附、激素转运及细胞表面受体功能障碍。动物中毒的临床表现包括精神沉郁、感觉迟钝、神经过敏、四肢无力、恶病质、生殖机能受损等，慢性中毒常造成神经系统的持久的不可恢复的损害。

疯草虽然是毒草，其营养价值也很丰富，有些棘豆的粗蛋白含量高达20％，超过“饲料之王”的苜蓿。针对我国而言，将西部草原30％以上的生长茂盛的疯草变成可利用的优质牧草，可以增加近一倍的饲草资源，可对当地畜牧业的发展起到强大的促进作用。

近年来，国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制疯草蔓延的特效方法，致使疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。国内学者曾尝试用水浸法、酸水浸泡法和高温处理法等处理疯草，在去除疯草毒性的同时破坏了疯草的适口性和营养价值，并且费用高，不适宜推广。王凯等研制出“棘防E号”等系列解毒剂，能有效推迟疯草中毒症状出现的时间，童德文等将SW与大分子载体蛋白BSA连接合成SW-BSA，以SW-BSA免疫原接种动物，使动物获得免疫力并在采食疯草时得到保护，这两项研究已取得一定进展，为防除动物疯草中毒病带来希望。

目前，应用微生物降解有毒物质一直是国内外研究的热点，涉及的领域十分广泛，但在微生物降解植物毒素方面的研究较少，不过也取得了一定的成果，周斌从菜籽饼中分离到能够降解芥子甙的多种微生物70多株，经鉴定这些菌是白色球拟酵母(Torulopsis candida)、华根霉(Rhizopus chinensis)、总状毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)，通过发酵试验确定其脱毒率为80％。谭蓓英等从广西涠洲岛的黄牛瘤胃中，分离出4株厌氧细菌，经鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)(2株)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，上述菌株对含羞草素和二羟基吡啶类毒素具有降解活性，这些脱毒菌生活在瘤胃中，可以保护宿主动物免受银合欢的毒害。疯草毒素生物降解研究还未见报道，但这些研究方法可供借鉴，探索一条SW生物降解的途径，筛选出能够降解SW的微生物，并将降解该毒素的酶基因转入动物胃肠道正常菌群或动物机体上，不仅能从根本上解决动物疯草中毒问题，还能带来很好的经济效益和环境效益，对草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种苦马豆素降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ-1，它能有效的降解疯草主要毒素----苦马豆素，使之对动物毒性降低。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种苦马豆素(Swainsonine，SW)降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ-1(Acinetobacter calcoaceticus YLZZ-1)，于2007年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M207108，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

本发明的另一目的是提供醋酸钙不动杆菌YLZZ-1的制备方法，包括下列步骤：

1)采集草样：采自甘肃、西藏、内蒙、青海等生长地的疯草；

2)土样培养：将1kg疯草埋于土壤中，深度为10～20cm，3～6个月后取出草样周围的土壤，将采集的土样充分混合；

3)菌株的分离筛选：取10g充分混合的土样加入装有90mL无菌水和无菌玻璃珠的三角瓶内，置于摇床上，200r/min充分振荡10min，制备菌悬液，然后取10mL菌悬液加入100mL富集培养液中，并在30℃，180r/min，pH7.0条件下培养过夜，然后再以10％接种量接种于新鲜的含苦马豆素(SW)30mg/L的驯化培养基中培养，以后每隔4d移种一次，并逐渐增加苦马豆素(SW)含量分别为50，80，100，120，150，180，200mg/L，当SW浓度达到200mg/L时，再以10％接种量接种于新鲜的含苦马豆素(SW)200mg/L的无机盐培养基中培养7d，然后将培养液稀释平板法涂布苦马豆素(SW)无机盐固体培养基上，挑选菌落形态各异的单菌落菌株，纯化后保存于普通营养琼脂培养基斜面上，得到一株醋酸钙不动杆菌YLZZ-1。

所述的富集培养液的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH₂PO₄1g，蒸馏水1L，pH为7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

所述的驯化培养基是在富集培养液中加入过滤除菌的苦马豆素(SW)溶液，使驯化培养基中SW的浓度为0～200mg/L。

所述的无机盐培养基的组分及配比为：NH₄NO₃1.0g，MgSO₄0.15g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄1.5g，蒸馏水100mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，灭菌后加入过滤除菌的苦马豆素(SW)溶液，使无机盐培养基中SW的浓度为0～200mg/L。

所述的无机盐固体培养基是在无机盐培养基中加入琼脂，使琼脂在其中的浓度为20g/L。

所述的普通营养琼脂培养基的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl    5g，KH₂PO₄1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

醋酸钙不动杆菌YLZZ-1菌株具有下述性质：

1、形态与生理生化特征

YLZZ-1菌株的菌体呈球杆状，0.2～0.3μm×0.5～1.0μm，革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽孢，无运动性；菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，不透明；葡萄糖发酵产少量酸，不产气，厌氧条件下不生长，不产生吲哚，M.R试验阴性，V.P试验阳性，不水解淀粉，不还原硝酸盐，不能利用柠檬酸盐，利用丙二酸盐，不产生H₂S，液化明胶，接触酶阳性，氧化酶阴性，尿素酶阳性，在5％NaCl中生长，但较缓慢，7％NaCl中不生长。具体生理生化特征见表1。

表1.YLZZ-1菌株的生理生化特征

实验项目    结果  实验项目    结果碳水化合物产酸  硝酸盐还原    -葡萄糖    +  柠檬酸盐利用    -乳糖    +  丙二酸盐利用    +蔗糖    -  产H₂S    -需氧    +  明胶液化    +厌氧    -  接触酶    +吲哚产生    -  氧化酶    -M.R试验    -  脲酶    +V-P试验    +  5％NaCl生长    +淀粉水解    -  7％NaCl生长    -

注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性。

YLZZ-1菌株16S rDNA序列见序列表SEQID NO.1，其GenBank登录号为EU022688(序列未公开)。

经16S rDNA序列同源性分析(见实施例2)，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《伯杰细菌学手册(第八版)》，最终确定YLZZ-1菌株为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。

该SW降解菌经形态、生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析，该菌能以苦马豆素为惟一碳源，可降解苦马豆素，为彻底解决疯草的毒害奠定基础。

附图说明

图1是YLZZ-1菌株在显微镜镜下的形态

图2是YLZZ-1菌株的单个菌落形态

图3是YLZZ-1降解苦马豆素(SW)的对照组气相色谱图

图4是YLZZ-1降解苦马豆素(SW)的试验组中期气相色谱图

图5是YLZZ-1降解苦马豆素(SW)的试验组后期气相色谱图

图6是YLZZ-1降解苦马豆素(SW)的降解曲线；

图7利用DNAStar软件构建系统进化树。

具体实施方式

实施例1：苦马豆素(SW)降解菌(YLZZ-1菌株)的分离筛选

1)采集草样：采自甘肃、西藏、内蒙、青海等生长地的疯草；

2)土样培养：  将1kg疯草埋于土壤中，深度为10～20cm，3～6个月后取出草样周围的土壤，将采集的土样充分混合；

3)菌株的分离筛选：取10g充分混合的土样加入装有90mL无菌水和无菌玻璃珠的三角瓶内，置于摇床上，200r/min充分振荡10min，制备菌悬液，然后取10mL菌悬液加入100mL富集培养液中，并在30℃，180r/min，pH7.0条件下培养过夜，然后再以10％接种量接种于新鲜的含苦马豆素(SW)30mg/L的驯化培养基中培养，以后每隔4d移种一次，并逐渐增加苦马豆素(SW)含量分别为50，80，100，120，150，180，200mg/L，当苦马豆素(SW)浓度达200mg/L时，再以10％接种量接种于新鲜的含苦马豆素(SW)200mg/L的无机盐培养基中培养7d，然后将培养液稀释平板法涂布苦马豆素(SW)无机盐固体培养基上，挑选菌落形态各异的单菌落菌株，纯化后保存于普通营养琼脂培养基斜面上，得到一株醋酸钙不动杆菌YLZZ-1。

所述的富集培养液的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH₂PO₄1g，蒸馏水1L，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

所述的普通营养琼脂培养基的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH₂PO₄1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

所述的无机盐培养基的组分及配比为：NH₄NO₃1.0g，MgSO₄0.15g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄1.5g，蒸馏水100mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，灭菌后加入过滤除菌的苦马豆素(SW)溶液，使无机盐培养基中SW的浓度为200mg/L。

所述的无机盐固体培养基是在无机盐培养基中加入琼脂，使琼脂在其中的浓度为20g/L。

所述的驯化培养基：根据需要，向灭菌后的富集培养液中加入过滤除菌的SW溶液，使其浓度为50，80，100，120，150，180，200mg/L。

实施例2 YLZZ-1菌株的16S rDNA序列的同源分析

将YLZZ-1菌株的16S rDNA序列(序列表SEQ ID NO.1)通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，利用DNAStar软件构建系统进化树，见图7。由图7得出，YLZZ-1菌株的遗传进化距离与不动杆菌属最近，它与醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)同处于一个最小的分支，与已知菌株Acinetobacter calcoaceticus strain CAI-13(DQ257421)的同源性达到100％，说明该菌在分子系统发育分类学上属于醋酸钙不动杆菌。

试验例1：使用降解菌(YLZZ-1菌株)降解苦马豆素(SW)

采用气相色谱法测定该菌对SW的降解率。以5％的接种量将降解菌接种到含有50mg/L SW的无机盐培养基中，30℃，180r/min摇动培养，以不接菌的SW无机盐培养基为对照，每隔2h取样，用气相色谱法测定苦马豆素的含量(图3，图4，图5)，结果见表2，计算降解率，绘制降解曲线(图6)。

表2.不同培养时间SW的降解率(％)

    菌株    时间(h)    0    2  4  6  8   10   12   14YLZZ-1菌株    0    10.09  17.24  22.63  68.07   80.39   97.23   100对照    0    0  0.01  0.01  0.01   0.02   0.01   0.02

总结：YLZZ-1菌株在14h内基本上将50mg/L的苦马豆素降解完全，而对照组苦马豆素无降解。该菌最适生长条件为：pH为6～8，温度为25℃～35℃。

序列表1

<110>西北农林科技大学

<120>一种苦马豆素降解菌醋酸钙不动杆菌YLZZ-1及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>1436

<212>DNA

<213>ACINETOBACTER CALCOACETICUS YLZZ-1

<400>1

AATGCAAGTC GAGCGGAGAG AGGTAGCTTG CTACTGATCT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA  60

ATGCTTAGGA ATCTGCCTAT TAGTGGGGGA CAACATTTCG AAAGGAATGC TAATACCGCA  120

TACGTCCTAC GGGAGAAAGC AGGGGATCTT CGGACCTTGC GCTAATAGAT GAGCCTAAGT  180

CGGATTAGCT AGTTGGTGGG GTAAAGGCCT ACCAAGGCGA CGATCTGTAG CGGGTCTGAG  240

AGGATGATCC GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG  300

GGGAATATTG GACAATGGGC GCAAGCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGTGT GAAGAAGGCC  360

TTATGGTTGT AAAGCACTTT AAGCGAGGAG GAGGCTACTT TAGTTAATAC CTAGAGATAG  420

TGGACGTTAC TCGCAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG  480

AGGGTGCAAG CGTTAATCGG ATTTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGCGG CTAATTAAGT  540

CAAATGTGAA ATCCCCGAGC TTAACTTGGG AATTGCATTC GATACTGGTT AGCTAGAGTG  600

TGGGAGAGGA TGGTAGAATT CCAGGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATC TGGAGGAATA  660

CCGATGGCGA AGGCAGCCAT CTGGCCTAAC ACTGACGCTG AGGTGCGAAA GCATGGGGAG  720

CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAT GCCGTAAACG ATGTCTACTA GCCGTTGGGG  780

CCTTTGAGGC TTTAGTGGCG CAGCTAACGC GATAAGTAGA CCGCCTGGGG AGTACGGTCG  840

CAAGACTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA  900

ATTCGATGCA ACGCGAAGAA CCTTACCTGG CCTTGACATA GTAAGAACTT TCCAGAGATG  960

GATTGGTGCC TTCGGGAACT TACATACAGG TGCTGCATGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT  1020

GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTTT CCTTATTTGC CAGCGAGTAA  1080

TGTCGGGAAC TTTAAGGATA CTGCCAGTGA CAAACTGGAG GAAGGCGGGG ACGACGTCAA  1140

GTCATCATGG CCCTTACGGC CAGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGTCGGT ACAAAGGGTT  1200

GCTACCTAGC GATAGGATGC TAATCTCAAA AAGCCGATCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC  1260

AACTCGACTC CATGAAGTCG GAATCGCTAG TAATCGCGGA TCAGAATGCC GCGGTGAATA  1320

CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCATGGG AGTTTGTTGC ACCAGAAGTA  1380

GCTAGCCTAA CTGCAAAGAG GGCGGTTACC ACGGTGTGGC CGATGACTGG GGGAAG      1436