介孔纳米粉体羟基磷灰石的微生物催化合成方法

摘要

本发明涉及一种介孔纳米粉体羟基磷灰石的微生物催化合成方法，在水中加入天然微生物表面活性剂及糖助剂，搅拌，培养形成发酵乳化液；再加入含钙无机盐溶液，搅拌后滴加含磷无机盐溶液，并使钙与磷的摩尔比为1.6－1.8，调节pH为9－12，搅拌、静置、离心，将离心得到的沉淀物水洗醇洗；或者将离心得到的分离液按前述步骤重复操作一次；将得到的沉淀物干燥，升温，保温后得到介孔纳米羟基磷灰石粉体。本发明的合成方法工艺简单、成本低、无污染，所制备的纳米复合粉体样品具有开放的生物骨架螺旋结构和蠕虫状狭缝孔道有序介孔结构，不需要除去模板，颗粒表面带正电荷，具有左旋光性能和较强的疏水性及生物细胞亲和性，无毒副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种介孔内米粉体羟基磷灰石(HAp)的微生物催化合成方法。

背景技术

近年来，关于纳米羟基磷灰石的制备方法的报导很多，主要有干法合成和湿法合成。而实验室合成方法中应用最广泛的是湿法合成，主要包括沉淀法、溶胶-凝胶法、水热反应法、模板法等。但是现有方法制备的颗粒团聚严重，活性低，制备工艺复杂且成本高，应用效果较差，难于推广应用。HAP超细粉体的合成方法已在国际上取得了一些进展，但多数方法还处于实验室阶段，如何选择不同的制备条件，控制HAp粉体的形态和粒径，进行大批量生产，以满足生物医学对羟基磷灰石超细粉体的需求，仍是一个需要大量科学工作者努力的方向。

纳米结构与功能关系的研究是纳米生物技术的基础和依托核心，以复杂介孔结构纳米微粒作为抗癌药物和基因转移载体，比表面积大、生物活性高、表面活性中心多，可以进行纳米组装复合，将抗癌药物、DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒的介孔之中或吸附在其表面，可以调节控制释药速度、增加生物膜的透过性、改变在体内的分布，提高生物利用度、难溶药物的溶解率、吸收率和药物疗效。研究表明，以微生物活体细胞为反应器，合成的介孔HAp/protein纳米复合粉体药物载体具有开放的生物骨架螺旋结构和蠕虫状狭缝孔道有序介孔结构，介孔孔径分布范围宽2-40nm，HAp的颗粒平均尺寸为5-20nm，蛋白质含量高达30.85％，不需要除去模板，颗粒表面带正电荷，能发射紫红荧光，具有左旋光性能和较强的疏水性，并具有良好的细胞亲和性、生物降解性和生物相容性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性，通过成分控制和结构设计及结晶度的控制调节，生物降解的速率可以控制，并可降解成人体细胞正常代谢物质，无毒副作用。应用微生物技术研究开发新型纳米无机载体材料，改造、替代传统化学制备技术，加快医用纳米生物材料产品的产业化是当代医用生物材料工业的一个重要发展方向。

模拟生物矿化也是近几年最前沿的研究领域，微生物催化绿色合成新技术是以微生物学和纳米技术相结合来绿色合成纳米生物材料的新兴交叉学科，Nature和Science等顶级国际期刊上近年来连续载文报道。微生物是地球生物中最具多样性和最具适应能力的生物形式，微生物活体细胞本身具有特殊精美的纳米网状结构和组装方式，由于微生物活体细胞的细胞壁、细胞间隙和细胞导管内有各种亲水介质存在，如细胞膜亲水表面、细胞壁纤维素多糖羟基体系及各种糖蛋白亲水基团，均可诱导许多人体所需或能够代谢的无机元素(如磷、钙、硅、铁、锌、镁、锰、钛、锶、硒、铜等)，在微生物活体细胞上进行生物矿化，自组装形成各种复杂纳米结构体，通过选择不同微生物细胞结构和培养条件能精确调控无机物的纳米结构形态，利用微生物细胞壁上关键酶的高效催化反应，可在常温常压下用无机物来复制刻录微生物细胞的精美纳米结构，生物对无机晶体的成核、形貌及结晶学定向等具有较好的控制。由于微生物细胞结构形貌的多样性、传代生长速度快、培养可控性、生产成本低，微生物细胞上有许多纳米微孔和生物性质的表面功能区域(亲脂性)，易进行基因突变、克隆重组及高效表达，并易与药物或基因结合，是合成有应用价值的无机介孔纳米粒药物载体有效的模板剂。微生物催化绿色合成新技术为发展高效、安全、无毒的新型纳米无机载体材料提供了新的途径，它不但可以提供大量廉价的纳米材料合成的模板剂，革新纳米材料合成的传统工艺，合成目前不能生产的，或用化学法生产较困难的，性能优异的新型纳米结构材料；而且反应条件温和易控制，工艺简单，多为常温、常压、低能耗、专一性强、选择性好、重复性好、效率高；生产成本低，产品质量高；无环境污染；投资较小易产业化。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供一种介孔纳米粉体羟基磷灰石(HAp)的微生物催化合成方法，以较低的成本制得高生物活性的介孔HAp纳米微粉。

本发明的介孔纳米粉体HAp的微生物催化合成方法步骤如下：

(1)在100-200m水中加入20-50g/L天然微生物表面活性剂及糖助剂30-60g/L，室温搅拌20-50分钟，然后在25-35℃培养0.5-1小时，形成发酵乳化液A；

(2)在步骤(1)得到的发酵乳化液A中加入0.3-0.6mol/L含钙无机盐溶液40-80ml，常温下搅拌0.5-1个小时后，得到溶液B；

(3)在步骤(2)得到的溶液B中按10-20滴/分钟的速度在室温下滴加0.3-0.6mol/L含磷无机盐溶液，并使钙磷的摩尔比为1.6-1.8，调节pH为9-12，搅拌0.5-1h，得到乳浊液C；

(4)将步骤(3)得到的乳浊液C静置15-20h，得到乳浊液D，以5000-10000转/分离心3-10分钟，得到的沉淀物水洗2-3次无水乙醇洗1-2次；或者将离心得到的分离液按步骤(2)-(4)操作；

(5)将步骤(4)得到的沉淀物在70-90℃干燥20-30h，再将其以≤10℃/分钟的速度升温到600-800℃，保温1-4h后，得到介孔纳米羟基磷灰石粉体。

所述的微生物表面活性剂是糖脂系、磷脂系、脂肪酸系表面活性剂中的一种或多种。

糖脂系微生物表面活性剂为鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂之一，槐糖脂是球丝酵母或假丝酵母在葡萄糖和正构烷烃或长链脂肪酸中培养时产生的。

磷脂系微生物表面活性剂为卵磷脂或磷脂酶，磷脂酶是由硫磺细菌发酵培养的。

脂肪酸系微生物表面活性剂为覆盖霉菌酸或青霉孢子酸。

所述含钙无机盐为硫酸钙、氯酸钙、硝酸钙、柠檬酸钙、氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙中的一种或多种。

所述含磷无机盐为磷酸二氢铵、磷酸、磷酸钠、偏磷酸钠、六偏磷酸钠中的一种或多种。

采用本发明方法，关键技术是在细胞培养、矿化时间、细胞破碎和除去微生物模板时，所形成的介孔结构的塌陷，反应物浓度越高，介孔壁越厚，反之亦然。除去生物模板的热处理升温速度应控制在≤10℃/min。另外，生物表面活性剂的种类和用量，对介孔结构的形成和孔的尺寸形状有重要的影响。

与现有技术相比，本发明方法的优良效果就在于使用廉价的天然微生物表面活性剂，利用微生物的纳米多层泡囊结构、细胞壁上关键酶的催化作用和矿化沉积过程，在温和的条件下合成介孔HAp纳米微粉，颗粒为蛋白质的螺旋结构，有序蠕虫状狭缝孔道的孔径分布为2-40nm，HAp的颗粒平均尺寸为5-20nm，结晶度为3％左右，晶格畸变量为6.8×10^-4(nm)，BET高于100m²/g，700℃煅烧2-4小时后仍就可以得到粒径为25-100nm范围的HAp颗粒，结晶度为12％左右，晶格畸变量为4.3×10^-4(nm)，无论是低温还是高温制备的HAp颗粒上都有结构孔，但700℃煅烧后有序介孔塌陷，使孔径变大。微生物绿色催化合成方法制备的介孔纳米粉体羟基磷灰石具有开放的生物骨架结构，对人体无有害成分，颗粒表面带正电，具有左旋光性能和较强的疏水性及生物亲和性，并能发射紫红荧光，活性高，制备工艺简单，无需排除有机摸板，成本低，无污染，成本约为其他方法的50％以下。

附图说明

图1是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的X射线衍射图谱。

图2是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的孔径分布曲线和吸附平衡等温曲线。

图3是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的高分辨电子显微镜照片(a)、晶格条纹像(b)和HAp/protein纳米复合颗粒的形成示意图(c)。

图4是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的原子力显微镜照片。

图5是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的透射电子显微镜照片和电子衍射照片。

图6是实施例2中得到的介孔HAp纳米粉体样品的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：将150ml的25g/L的糖脂系生物表面活性剂槐糖脂球丝酵母水溶液在室温下加糖助剂6g，室温搅拌20分钟，25℃乳化培养50分钟，得到发酵乳化液A，然后，将50ml的0.5mol/L的CaCl₂溶液加到乳化液A中，继续磁力搅拌30分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟10滴速度缓慢滴加0.5mol/L磷酸溶液，并使Ca/P(摩尔比)＝1.67，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝10，继续磁力搅拌0.5h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置20h，以5000转/分高速离心5分钟，水洗两次醇洗一次，除去Cl^-、Na⁺和H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中70℃烘干20h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，其颗粒尺寸为18-37nm，其介孔尺寸为2-50nm，BET大于100m²/g。以3℃/min的升温速度，在600℃热处理3h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为36-70nm，孔尺寸为12-90nm，BET为66m²/g。

实施例2：将150ml的50g/L的糖脂系生物表面活性剂鼠李糖脂水溶液在室温下加糖助剂4.5g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将1.65gCa(OH)₂粉体加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟20滴速度缓慢滴加0.3mol/L磷酸二氢铵溶液，并使Ca/P(摩尔比)＝1.67，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置15h，以5000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，除去OH^-和NH₄⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，其颗粒尺寸为10-17nm，其介孔尺寸为2-40nm，BET大于100m²/g。以5℃/min的升温速度，在700℃热处理2h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为16-40nm，介孔孔尺寸为8-40nm，BET高于86m²/g。

图1是实施例2中80℃烘干24小时后和煅烧到700℃后，样品的X射线衍射图谱，纵坐标为衍射强度，横坐标为衍射角，样品煅烧前后的广角衍射峰与均与标准的羟基磷灰石HAp(JCPDSNo.09-432)一致，并且衍射峰都有不同程度的宽化现象，表明煅烧前后的样品都有纳米尺寸效应，由(002)晶面计算的没有煅烧样品的结晶度为3％，晶粒尺寸为10.9nm，晶格畸变量为6.8×10^-4nm；700℃煅烧后样品的结晶度为12％，晶粒尺寸为17.2nm，晶格畸变量为4.3×10^-4nm；煅烧前样品的小角衍射图在2θ＝1.31°出现了强衍射峰，表明样品含有有序介孔结构，其有序孔径为6.74nm，但煅烧后的样品没有出现小角衍射峰，表明有序介孔结构在煅烧过程中已经塌陷。

图2是实施例2中80℃烘干24小时后和700℃煅烧2小时后，样品的孔径分布曲线和吸附平衡等温曲线。煅烧前样品呈现IV型吸附平衡等温线和H4迟滞环，表明样品具有形状和尺寸均匀的狭缝状介孔孔道(见原子力显微镜图4)，BJH孔径分布在2-40nm范围。煅烧后样品呈现II型吸附平衡等温线，没有出现迟滞环，表明样品在煅烧过程中有序介孔孔道结构已经塌陷，介孔孔体积明显降低，BJH介孔孔径分布在8-40nm范围，由于蛋白质摸板的排除而出现了大孔结构(＞50nm)。

图3是实施例2中80℃烘干24小时后介孔HAp/protein纳米复合粉体样品的高分辨电子显微镜照片(a)、晶格条纹像(b)和HAp/protein纳米复合颗粒的形成示意图(c)。图3(a)呈现出蛋白质的二级左螺旋纳米骨架结构，并且在颗粒上呈现出HAp(211)晶面的晶格条纹像，(211)晶面的晶面间距为0.281nm，其旋转角为70°(见图3b)，这表明HAp沉积在了蛋白质的表面上并复制了蛋白质的二级左螺旋纳米结构(见图3c)。

图4是实施例2中80℃烘干24小时后介孔HAp/protein纳米复合粉体样品的原子力显微镜照片，图中显示出样品的表面纳米结构呈现开放生物骨架螺旋结构和蠕虫状狭缝孔道有序介孔结构，这也进一步证明了HAp对蛋白质的二级纳米结构进行了复制刻录。

图5是实施例2中80℃烘干24小时后和700℃煅烧2小时后，样品的透射电子显微镜照片和电子衍射照片(图中左上角)，煅烧前样品平均颗粒尺寸为16.8nm，较大的颗粒上可见到结构孔，其电子衍射图呈现纳米级晶粒的衍射环。700℃煅烧后样品的晶粒长大，平均晶粒尺寸变为31.2nm，但其电子衍射图仍然呈现纳米级晶粒的衍射环。

图6是实施例2中80℃烘干24小时后和700℃煅烧2小时后，样品的紫外吸收光谱图。在图6a中纯的微生物表面活性剂的蛋白质含量为45.99(wt％)，波长在260nm为DNA的特征吸收峰，在280nm为蛋白质的特征吸收峰。在图6b中80℃烘干24小时后介孔HAp/protein纳米复合粉体的蛋白质含量为30.85(wt％)，波长在260nm为DNA的特征吸收峰，在280nm为蛋白质的特征吸收峰，并且在200-250nm波长范围内出现了HAp的两个吸收峰。在700℃煅烧2小时后的样品的紫外吸收光谱图(图6c)中，DNA和蛋白质的特征吸收峰都消失，蛋白质含量为00.00(wt％)，表明微生物摸板已经完全被排除掉，得到纯介孔HAp纳米粉体。

实施例3：将150ml的20g/L的糖脂系生物表面活性剂海藻糖脂水溶液在室温下加糖助剂9g搅拌、室温搅拌30分钟，20℃乳化培养1小时，得到乳化液A，再将40ml的0.6mol/L的Ca(NO₃)₂溶液加到乳化液A中，继续磁力搅拌1小时，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟15滴速度缓慢滴加0.6mol/L磷酸钠溶液，并使Ca/P(摩尔比)＝1.8，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝12，继续磁力搅拌45分钟，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置18h，高速离心分离(5000转/分，10分钟)，水洗两次醇洗一次，除去NO₃^-和Na⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中90℃烘干30h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，其颗粒尺寸为25-37nm，其介孔尺寸为2-50nm，BET大于90m²/g。。以9℃/min的升温速度，在800℃热处理1.5h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为56-79nm，孔尺寸为6-80nm，BET高达76m²/g。

实施例4：将150ml的25g/L的糖脂系生物表面活性剂卵磷脂在室温下加糖助剂6g，室温搅拌20分钟，25℃乳化培养50分钟，得到发酵乳化液A，然后，将60ml的0.3mol/L的CaSO₄溶液加到乳化液A中，继续磁力搅拌30分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟10滴速度缓慢滴加0.3mol/L偏磷酸钠溶液，并使Ca/P(摩尔比)＝1.67，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝10，继续磁力搅拌0.5h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置20h，8000转份离心5分钟，水洗两次醇洗一次，除去SO₄^-、Na⁺和H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中70℃烘干20h后。升温速度为10℃/min，热处理温度为750℃。煅烧前介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，其颗粒尺寸为18-37nm，其介孔尺寸为2-50nm，BET大于100m²/g。煅烧后介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为46-90nm，孔尺寸为22-90nm，BET高达77m²/g。

实施例5：将150ml的50g/L的糖脂系生物表面活性剂磷脂酶在室温下加糖助剂4.5g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将70ml的0.4mol/L的柠檬酸钙溶液加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟20滴速度缓慢滴加0.4mol/L六偏磷酸钠溶液24ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.6，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝9，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，静置15h，以10000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，除去Na⁺、柠檬酸根离子以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，升温速度为10℃/min，热处理温度为750℃。煅烧前介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，其颗粒尺寸为18-35nm，其介孔尺寸为2-60nm，BET大于100m²/g。煅烧后介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为29-65nm，孔尺寸为26-85nm，BET高达89m²/g。

实施例6：将100ml的50g/L的糖脂系生物表面活性剂霉菌酸水溶液在室温下加糖助剂3g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将80ml的0.4mol/L的CaO溶液加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟20滴速度缓慢滴加0.4mol/L磷酸二氢铵和磷酸钠溶液24ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.8，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝9，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置15h，以5000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，除去Na⁺、OH^-和NH₄⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，以5℃/min的升温速度，在700℃热处理2h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为26-40nm，介孔孔尺寸为18-70nm，BET高于76m²/g。

实施例7：将200ml的50g/L的糖脂系生物表面活性剂青霉孢子酸水溶液在室温下加糖助剂6g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将1.76g的CaCO₃粉体加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以20滴/分速度滴加0.4mol/L磷酸二氢铵、磷酸和磷酸钠的混合溶液24ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.66，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝9，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置15h，以6000转/分的速度离心5分钟，水洗3次醇洗2次，除去CO₃^-、Na⁺、OH^-和NH₄⁺以及H₂O。将分离液中加入1.76g的CaCO₃粉体，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以20滴/分速度滴加0.4mol/L磷酸二氢铵、磷酸和磷酸钠的混合溶液24ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.6，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝9，磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，静置15h，以5000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，再次除去OH^-和NH₄⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，以5℃/min的升温速度，在700℃热处理2h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为36-50nm，介孔孔尺寸为18-60nm，BET高于69m²/g。

实施例8：将200ml的50g/L的表面活性剂霉菌酸和卵磷脂的水溶液在室温下加糖助剂6g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将30ml的0.4mol/L的CaCl₂溶液和1.08g的Ca(OH)₂粉体加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟20滴速度缓慢滴加0.4mol/L六偏磷酸钠溶液34ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.6，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，然后静置15h，以5000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，除去OH^-、Cl^-、Na⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，以5℃/min的升温速度，在700℃热处理2h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为16-50nm，介孔孔尺寸为9-70nm，BET高于73m²/g。

实施例9：将150ml的50g/L的表面活性剂鼠李糖脂、磷脂和霉菌酸水溶液在室温下加糖助剂5.5g，室温搅拌50分钟，35℃乳化培养30分钟，得到发酵乳化液A，然后将20ml的0.4mol/L的CaO和20ml的0.4mol/L的CaSO₄溶液及1.08g的Ca(OH)₂粉体加到乳化液A中，继续磁力搅拌50分钟，让Ca²⁺能充分的吸附在微生物细胞的纳米泡囊结构中。以每分钟20滴速度缓慢滴加0.4mol/L磷酸二氢铵、六偏磷酸钠和磷酸钠的混合溶液44ml，并使Ca/P(摩尔比)＝1.6，用5mol/L的NaOH溶液调节pH＝9，继续磁力搅拌1h，让细胞结构部分矿化沉积，静置15h，以5000转/分的速度离心3分钟，水洗3次醇洗2次，除去OH^-、Na⁺、SO₄^-和NH₄⁺以及H₂O。最后将沉淀物在干燥箱中80℃烘干24h后，得到介孔HAp/protein纳米复合粉体样品，以5℃/min的升温速度，在700℃热处理2h，得到介孔HAp纳米粉体样品，其颗粒尺寸为19-59nm，介孔孔尺寸为6-610nm，BET高于74m²/g。