新型蛋白酶、生产该蛋白酶的微生物及其利用

摘要

本发明的目的在于提供从酸性到碱性区域的宽pH范围内是稳定的、具有优异的血栓溶解作用的蛋白酶，生产该蛋白酶的蛋白酶生产菌以及该蛋白酶的制造方法。通过培养属于镰刀菌属的新型丝状菌(镰刀菌sp.BLB株)，在培养物中生成蓄积从酸性到碱性区域的宽pH范围内是稳定的、具有优异的血栓溶解作用的蛋白酶，并将其回收。

说明书

技术领域

本发明涉及发挥优异的血栓溶解作用的新型蛋白酶，生产该蛋白酶的蛋白酶生产菌，以及该蛋白酶的制造方法。进而，本发明涉及含有上述蛋白酶的血栓溶解剂或食品，以及利用上述蛋白酶生产菌来制造的发酵食品。

背景技术

蛋白酶是将蛋白质或肽中的肽键水解的一类酶，以前开发出来源于微生物或动植物的各种蛋白酶，在医药品或食品领域中被利用。例如，报告有根霉或根霉菌中含有的蛋白酶具有血栓溶解作用，作为血栓溶解剂是有用的(参照专利文献1)。

然而，对于医药品或食品领域中利用的蛋白酶来说，以往几乎不知道从酸性到碱性区域的宽pH范围内稳定的物质。在宽pH范围内稳定的蛋白酶，在食品或医药品等中的应用是有用的。其中，在宽pH范围内稳定且具有血栓溶解作用的的蛋白酶，作为用于治疗或预防血栓症的医药品或食品的有用性高，而盼望其的开发。

专利文献1：特开平3-277279号公报

发明内容

因此，本发明的目的在于提供：从酸性到碱性区域的宽pH范围内是稳定的、具有优异的血栓溶解作用的蛋白酶，生产该蛋白酶的蛋白酶生产菌，以及该蛋白酶的制造方法。进而，本发明的目的在于提供含有上述蛋白酶的血栓溶解剂或食品，以及利用上述蛋白酶生产菌来制造的发酵食品。

本发明人等为了解决上述课题，进行了锐意研究，结果发现，从使用木槿属植物的叶制成的根霉中分离出的属于镰刀菌属的丝状菌(镰刀菌sp.BLB株FERM BP-10493)，可生产从酸性到碱性区域的宽pH范围内是稳定的、具有优异的血栓溶解作用的新型蛋白酶。还发现上述蛋白酶能够作为食品或医药品的原料使用。进而，该微生物可以食用，利用该微生物使豆类或谷类发酵而得的发酵食品含有上述蛋白酶，作为治疗或预防血栓症用的食品或其他健康食品是有用的。本发明是基于这些认识，通过进一步反复改良而完成的。

即，本发明涉及以下所述的蛋白酶、蛋白酶生产菌、蛋白酶的制造方法、血栓溶解剂、食品及发酵食品。

第1项.具有下述性质的蛋白酶：

(1)作用/基质特异性：具有对纤维蛋白的分解活性，此外，具有对作为合成基质的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及Bz-L-Arg-pNA的分解活性；

(2)作用pH及最佳pH：至少在pH6.5～11.5下发挥作用，最佳pH为约8.5～9.5；

(3)pH稳定性：在4℃、20小时的处理条件下，至少在pH2.5～11.5的范围是稳定的；

(4)作用温度及最佳温度：至少在30～50℃发挥作用，最佳温度为约45～50℃；

(5)温度稳定性：在pH5、10分钟的处理条件下，至少到约55℃为止是稳定的；

(6)分子量：利用SDS-PAGE进行的推定分子量为约27000；

(7)抑制特性：不被0.01mg/ml的SBTI抑制，而被1mM的PMSF和0.1mM的DFP抑制。

第2项.如第1项所述的蛋白酶，其来源自属于镰刀菌属的微生物。

第3项.以下(a)、(b)或(c)的任意一种蛋白质：

(a)一种蛋白质，其由序列号1表示的氨基酸序列构成；

(b)一种蛋白质，其由在序列号1表示的氨基酸序列中，有1个或2个以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，且是具有第1项的(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶。

第4项.基因，其编码第3项所述的蛋白质。

第5项.基因，其由以下(i)或(ii)的DNA构成：

(i)一种DNA，其由序列号2表示的碱基序列构成；

(ii)一种DNA，其在严格条件下与由序列号2表示的碱基序列构成的DNA和由与其相互补的碱基序列构成的DNA杂交，且编码作为具有1的(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶的蛋白质。

第6项.基因，其编码以下(a)、(b)或(c)的任意一种蛋白质：

(a)一种蛋白质，其由序列号1表示的氨基酸序列构成；

(b)一种蛋白质，其由在序列号1表示的氨基酸序列中，有1个或2个以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，且是具有第1项的(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶。

(c)一种蛋白质，其与序列号1表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且是具有第1项的(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶。

第7项.重组载体，其含有第4项～第6项中任一项所述的基因。

第8项.转化体，其含有第7项所述的重组载体。

第9项.蛋白酶的制造方法，其特征在于，培养第8项所述的蛋白酶生产菌，并从培养物中回收蛋白酶。

第10项.蛋白酶生产菌，其属于镰刀菌属，生产第1项所述的蛋白酶。

第11项.如第10项所述的蛋白酶生产菌，其特征在于，

(iii)具有由序列号3表示的碱基序列或与其有98％以上同源性的碱基序列构成的ITS-5.8SrDNA，或者

(iv)具有由序列号4表示的碱基序列或与其有98％以上同源性的碱基序列构成的28SrDNA。

第12项.如第10项所述的蛋白酶生产菌，其为镰刀菌sp.BLB(Fusarium sp.BLB)(FERM BP-10493)。

第13项.蛋白酶的制造方法，其特征在于，培养第10项～第12项中任一项所述的蛋白酶生产菌，并从培养物中回收蛋白酶。

第14项.血栓溶解剂，其含有第1项所述的蛋白酶或第3项所述的蛋白质。

第15项.血栓症的治疗或预防方法，其包括如下工序：对血栓症患者或者有必要预防血栓症的人，以治疗或预防血栓症的有效量给予第1项所述的蛋白酶或第3项所述的蛋白质。

第16项.如第1项所述的蛋白酶或第3项所述的蛋白质的用于制造血栓溶解剂的使用。

第17项.食品，其含有第1项所述的蛋白酶或第3项所述的蛋白质。

第18项.发酵食品，将第10项～第12项中任一项所述的蛋白酶生产菌接种于食品原料并使其发酵。

本发明的蛋白酶，由于具有优异的血栓溶解作用，从酸性到碱性区域的宽pH范围内是稳定的，所以其工业应用范围广，特别是，在食品或医药等领域中是有用的。

此外，使用本发明的蛋白酶生产菌制成的发酵食品，由于基于该蛋白酶的作用而能够发挥有用的生理活性，所以作为健康食品的价值高。

附图说明

图1：表示本发明的蛋白酶(来源于镰刀菌sp.BLB株)的作用温度和最佳温度的图。

图2：表示本发明的蛋白酶(来源于镰刀菌sp.BLB株)的pH稳定性的图。

图3：表示本发明的蛋白酶(来源于镰刀菌sp.BLB株)的作用温度和最佳温度的图。

图4：表示本发明的蛋白酶(来源于镰刀菌sp.BLB株)的热稳定性的图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

1.蛋白酶

以下，对本发明的蛋白酶的诸多酶学性质进行说明。

(蛋白酶活性测定法-纤维蛋白平板法)

将来源于牛血浆的纤维蛋白原(SIGMA公司制)溶解于pH7.2的0.1M磷酸缓冲液中，使得浓度达到0.5重量％。不溶物用滤纸(东洋滤纸，No.2)过滤。将该溶液以20ml分注于角2号培养皿(144×104×16mm)中，边搅拌边添加100μl的50U/ml凝血酶溶液。形成纤维蛋白并凝固后，在37℃下预孵育30分钟。向该纤维蛋白平板(人工血栓)滴加样品(蛋白酶溶液)30μl，在37℃测定4小时后的溶解面积(长径×短径)。将该面积与同样测定的尿激酶相比，从而可以将该面积换算成尿激酶国际单位。

(蛋白酶活性测定法-酪蛋白分解法)

使用100mM的硼酸缓冲液(pH10)，以最终浓度为1重量％的方式调制ハマルステン氏酪蛋白溶液，在调制好的ハマルステン氏酪蛋白溶液1.5ml中添加样品(蛋白酶溶液)0.5ml，在37℃反应10分钟。添加0.44M三氯乙酸溶液2ml来停止反应，放置20分钟后，过滤沉淀物。在该滤液1ml中依次加入0.44M碳酸钠水溶液5ml和酚试剂(每100ml含有钨酸钠二水合物9.1g、钼酸钠二水合物2.3g、磷酸4.5ml、盐酸9.1ml、硫酸锂13.6g)1ml，放置20分钟后，测定吸光波长660nm处的吸光度。在上述的测定中，酶单位如下定义：将在1分钟内把相对于1μg酪氨酸的酸可溶性蛋白质分解物游离的酶量定义为1个单位。

(蛋白酶活性测定法-合成基质法)

在200mM的各种缓冲液500μl中，添加50mM的合成基质5μl和样品(蛋白酶溶液)455μl，在37℃进行10分钟反应，测定吸光波长405nm处的吸光度。在上述的测定中，酶单位如下定义：将在1分钟内把1纳摩尔的对硝基苯胺游离的酶量定义为1个单位。

(1)作用和基质特异性

对纤维蛋白具有强的分解活性。

以对于作为合成基质的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA的分解活性设为100，将对于各种合成基质的分解活性(相对活性(％))示于表1中。对于作为合成基质的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及Bz-L-Arg-pNA具有分解活性。特别是，对H-D-Ile-Pro-Arg-pNA和H-D-Val-Leu-Lys-pNA具有强的分解活性。另一方面，对于作为合成基质的Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA和Gle-Phe-pNA不具有分解活性。

[表1]

基质相对活性(％)H-D-Ile-Pro-Arg-pNA100H-D-Val-Leu-Lys-pNA21Bz-L-Arg-pNA2.8Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA0Suc-Al a-Al a-Pro-Phe-pNA0Gle-Phe-pNA0

(2)作用pH和最佳pH

用各种缓冲液(pH2-3甘氨酸-盐酸缓冲液、pH3.5-6醋酸缓冲液、pH6-8磷酸缓冲液、pH8-9TRIS-盐酸缓冲液、pH9-12甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，测定Bz-L-Arg-pNA的分解活性，将其结果示于图1。如图1所示，至少在pH6.5～11.5下发挥作用，最佳pH为约8.5～9.5。在此，“发挥作用”是指以最佳pH(pH9.5)的活性为100％时的相对活性显示为30％以上。

(3)pH稳定性

在50mM的各种缓冲液(pH2-3甘氨酸-盐酸缓冲液、pH3.5-6醋酸缓冲液、pH6-8磷酸缓冲液、pH8-9TRIS-盐酸缓冲液、pH9-12甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)中添加本蛋白酶，在4℃放置20小时。对于所述处理后的蛋白酶，使用作为合成基质的Bz-L-Arg-pNA，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.5)测定残存活性(图2)。如图2所示，在4℃、20小时的处理条件下，至少在pH2.5～11.5的范围内是稳定的。在此，“是稳定的”是指残存活性为90％以上。

(4)作用温度及最佳温度

使用作为合成基质的Bz-L-Arg-pNA，用100mM的醋酸缓冲液pH5.0测定30～60℃中的分解活性，将结果示于图3。如图3所示，至少在30～50℃下发挥作用，最佳温度为约45～50℃。在此，“发挥作用”是指以最佳温度(50℃)的活性为100％时的相对活性显示为30％以上。

(5)温度稳定性

在50mM的醋酸缓冲液pH5.0中添加本蛋白酶，在20～80℃放置10分钟。对于所述处理后的蛋白酶，使用作为合成基质的Bz-L-Arg-pNA，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9.5测定残存活性(图4)。如图4所示，在pH5、10分钟的处理条件下，至少到约55℃为止是稳定的。在此，“是稳定的”是指残存活性显示为90％以上。

(6)分子量

用SDS-PAGE(Laemmli的方法)测定得到的推定分子量为约27000。

(7)抑制特性

使用50mM的醋酸缓冲液pH5，使其与各种蛋白酶抑制剂共存，在37℃下放置1小时后，用作为合成基质的Bz-L-Arg-pNA测定活性。算出以不存在抑制剂的条件下的活性为100时的相对活性(％)，将结果示于表2。由表2可知，本蛋白酶被1mM的PMSF和0.1mM的DFP抑制。另一方面，本蛋白酶不被0.01mg/ml的SBTI抑制。而且，本蛋白酶也不被表2中示出的其他蛋白酶抑制剂抑制。

[表2]

抑制剂浓度相对活性(％)SBTI0.01mg/ml100SSI0.01mg/ml100ε-ACA1mM100PMSF1mM59TPCK0.1mM97DFP0.1mM212，2′联吡啶1mM97菲绕啉1mM100EDTA1mM100E-640.1mM97抑糜蛋白酶素0.01mg/ml100胃蛋白酶抑制剂A0.1mM100SPI0.1mM100

本说明书中关于蛋白酶抑制剂的各缩写标记的意思如下。SBTI：大豆胰蛋白酶抑制剂、SSI：链霉菌属枯草杆菌蛋白酶抑制剂、ε-ACA：ε-氨基己酸、PMSF：苯甲基磺酰氟、TPCK：N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯甲酮、DFP：二异丙基氟磷酸酯、EDTA：乙二胺四乙酸、E-64：t-环氧琥珀酰-L-亮氨酰胺(4-胍基)丁烷、SPI：链霉菌属胃蛋白酶抑制剂。

由以上的酶学性质，本发明的蛋白酶虽然被认为是胰蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶的一种，但不被SBTI抑制，而且由于基质特异性及较广的pH稳定性等，与以往的丝氨酸蛋白酶相比是明显不同的新型蛋白酶。

本发明的蛋白酶由于在宽pH区域内是稳定的，所以能够在多个领域中应用。例如，除了后述的作为血栓溶解剂、食品的应用之外，还可以在难分解性蛋白质的分解、食用肉的软化、氨基酸的制造、能够在医药或食品中应用的生理活性肽的制造、面包的制造、发酵食品(例如奶酪等)的制造等中利用。

进而，从氨基酸序列的观点出发，本发明提供以下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)一种蛋白质，其由序列号1表示的氨基酸序列构成；

(b)一种蛋白质，其由在序列号1表示的氨基酸序列中，有1个或2个以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，且是具有上述(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶；

(c)一种蛋白质，其与序列号1表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且是具有上述(1)和(7)栏中所述特性的蛋白酶。

序列号1表示的氨基酸序列，相当于序列号2表示的碱基序列的开放阅读框架(ORF)所编码的氨基酸序列。

对于上述(b)的蛋白质，“1个或2个以上”的范围没有特别限定，是指例如1～50个，优选1～25个，更优选1～12个，进一步优选1～9个，特别优选1～5个。

在特定的氨基酸序列中，使1个或2个以上的氨基酸取代、缺失或添加的技术是公知的。

对于上述(c)的蛋白质，作为与序列号1表示的氨基酸序列的同源性，理想的是80％以上，优选90％以上，特别优选95％以上。

氨基酸序列的同源性，可以用通过市售或电通信回路(因特网)而能够利用的解析工具来算出。具体而言，使用BLAST(J.Mol.Biol.，215，403，1990)的解析软件来计算。

此外，对于上述(b)和(c)的蛋白质，蛋白酶活性除了上述(1)及(7)栏所述的特性之外，优选满足上述(2)～(5)所述特性的至少任意之一，特别优选满足上述(2)～(5)所述的所有特性。

2.蛋白酶生产菌

进而，作为生产上述蛋白酶的微生物(蛋白酶生产菌)，本发明提供属于镰刀菌属的微生物。作为该蛋白酶生产菌，只要是属于镰刀菌属、并能够生产具有上述性质的蛋白酶的菌，任何菌都可以。作为所述生产菌之一例，可举出从使用木槿属植物的叶制成的根霉中分离出的镰刀菌sp.BLB株。该镰刀菌sp.BLB株具有产生由序列号1表示的氨基酸序列构成的蛋白质的能力。应说明的是，确认该镰刀菌sp.BLB株没有产生真菌毒素的能力。以下，示出镰刀菌sp.BLB株的菌学性质和遗传学性质。

(i)菌学性质

接种于细菌用土豆葡萄糖琼脂培养基(Bacto Potato DextroseAgar；BECTON DICKINSON公司制)、细菌用燕麦琼脂培养基(BactoOatmeal Agar；BECTON DICKINSON公司制)和含有细菌用麦芽提取物的琼脂培养基[含有2重量％的细菌用麦芽提取物(Bacto MaltExtract；BECTON DICKINSON公司制)+1.5重量％的琼脂]的各板，在25℃进行最长6周的培养，显示下述特性。

(a)生长

所有板中在25℃的生长都快，在培养10天以内显示出覆盖直径85mm板全部表面的生长。

(b)菌丝

菌丝为从天鹅绒状(veltinous)到羊毛状(Floccose)，表面色调从最初就显示白色，看不到背面着色。观察不到分生孢子附生所致的菌落表面的变化。

(c)可溶性色素

看不到可溶性色素(soluble pigment)的产生。

(d)分生孢子

形成小分生孢子(microconidia)和大分生孢子(macroconidia)。小分生孢子为瓶梗型(phialidic)，是Acremonium属样的分生孢子柄(cinidiophere)的结构。分生孢子柄几乎为单生，大量形成较长的柄(stipe)。小分生孢子为1～2个细胞，具有粘性，从柄顶端形成块状(slimy)，形状为纺锤状(fusiform)，表面是平滑的(smooth)。大分生孢子在空气中菌丝基部形成，为2～4个细胞，形成新月状(luniform)，表面是平滑的，具有足细胞(foot cell)。大量形成大分生孢子的宽幅为中厚、长度为中等程度的大分生孢子。

(ii)遗传学性质

将镰刀菌sp.BLB株的染色体DNA所含的ITS-5.8SrDNA区域(internal transcription spacer区域和5.8S核糖体RNA基因)(以下称为ITS-5.8SrDNA)的碱基序列示于序列表的序列号3。此外，将镰刀菌sp.BLB株的染色体DNA所含的28S核糖体RNA基因(以下称为28SrDNA)的碱基序列示于序列表的序列号4。这些ITS-5.8SrDNA和28SrDNA的碱基序列的确定可如下进行：从镰刀菌sp.BLB株中提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，进行PCR，将ITS-5.8SrDNA和28SrDNA区域扩增，根据常规方法确定其全长的碱基序列。应说明的是，ITS-5.8SrDNA通过PCR进行的扩增中，使用引物ITS5和ITS4(White，T.J.，T.Bruns，S.Lee，and J.W.Tayer.(1990)Amplificationand direct sequencing of fungal ribosomal RNA gene for phylogenetics.In Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.，and White，T.J.(eds)PCR protocols，a guide to mothods and applications，Academic Press，Inc.，New York，pp.315-322)，而且，28SrDNA通过PCR进行的扩增中，使用引物NL1和NL2(O’Donnell，K.(1993)Fusarium and its nearrelatives.In Reynolds，D.R.and Tayor，J.W.(Eds)The FungalHolomorph：Mitotic，Meiotic and Pleomorphic Speciation in FungalSystematics，CAB International Wallingford，UK，pp.225-233)。

对于镰刀菌sp.BLB株的ITS-5.8SrDNA和28SrDNA的碱基序列，进行对GenBank数据库的BLAST检索，确认镰刀菌sp.BLB株是属于镰刀菌属的种名不祥的菌株。

该镰刀菌sp.BLB株在平成17年1月20日，在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1-1-1中央6(邮编305-8566))，作为保藏编号FERM P-20370而保藏。而且，该菌株现在被移交到国际保藏，其保藏编号为FERM BP-10493。

除了上述镰刀菌sp.BLB株之外，作为该蛋白酶生产菌的具体例子，可列举具有由序列号3表示的碱基序列或与其有98％以上同源性的碱基序列构成的ITS-5.8SrDNA的丝状菌；以及具有由序列号4表示的碱基序列或与其有98％以上同源性的碱基序列构成的28SrDNA的丝状菌。

3.蛋白酶的制造方法

本发明的蛋白酶的制造方法，可以通过培养上述蛋白酶生产菌，并从培养物中提取蛋白酶来实施。

作为本发明的制造方法中使用的培养基，只要是该微生物良好生长并生产蛋白酶的适当培养基就没有特别限定，可以使用适当的碳源、氮源、无机盐、含有其他营养源的合成培养基或天然培养基。例如，作为培养基的碳源，可列举葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘油、糊精、寡糖、淀粉、糖蜜、玉米浆、麦芽提取物、有机物等。此外，作为氮源，可列举玉米浆、酵母提取物、各种胨、大豆粉、肉提取物、麦糠提取物、酪蛋白、氨基酸和尿素等有机氮源，硝酸盐、铵盐等无机氮源等。作为无机盐类，可列举钠盐、钾盐、镁盐、铁盐及其他金属盐等。进而，作为其他营养源，可列举维生素类、氨基酸类、核酸类等。

培养，可以是固体培养或液体培养的任意一种，可按照一般的微生物培养来进行。优选的是液体培养。液体培养可以通过通气搅拌培养或振荡培养等来进行。此外，液体培养时，对于培养方式，可以是分批培养、流加培养、连续培养的任意方式。培养条件(温度、pH等)可以根据培养的蛋白酶生产菌的生长特性来适当设定。作为培养温度之一例，可列举20～35℃、优选25～30℃。此外，作为pH条件之一例，可列举pH4～8、优选pH5～7。作为培养时间，随培养方法、培养基的种类和量、温度以及pH条件等而不同，不能一概地规定，通常可以设为24～120小时、优选60～90小时左右。

如此培养得到的菌体和培养上清中蓄积蛋白酶。为了从菌体内溶出蛋白酶，可以根据常规方法进行。具体而言，可例示下述方法：直接将培养液，或通过离心分离或过滤等将菌体分离后将其供给如下处理，即用超声波、弗氏压碎器或高压均质器等的机械破碎处理，用环己烷、甲苯或乙酸乙酯等进行的处理，或用溶菌酶进行的溶菌处理，从而使蛋白酶溶出到菌体外。可根据需要将这样得到的蛋白酶溶出液和含有蛋白酶的培养上清精制到目的纯度和浓度。为了精制蛋白酶，可举出单独或以任意顺序适当组合来进行如下处理，并回收蛋白酶活性部分的方法，所述处理为：例如溶剂提取、各种树脂(例如离子交换、吸附、分子筛等)处理、膜(例如膜滤器、超滤、精密过滤、反渗透等)处理、活性碳处理、超临界流体提取处理、蒸馏处理、晶析或其他处理。

此外，除了上述的制造方法之外，如后所述，可以通过培养导入有编码该蛋白酶氨基酸序列的基因的转化体来制造本发明的蛋白酶。

4.编码上述蛋白酶的基因、重组载体及转化体基因

本发明还提供编码上述蛋白酶的基因。

具体而言，作为本基因，例示有编码上述(a)、(b)或(c)的任意一种蛋白质的基因。如上所述，在特定的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1个或2个以上的氨基酸的技术是公知的，编码上述(b)的蛋白质的基因的制造也可以使用市售的试剂盒等、根据公知的方法来实施。

此外，作为其他方式，作为编码上述蛋白酶的基因，具体而言，是由以下(i)或(ii)的DNA构成的聚核苷酸：

(i)一种DNA，其由序列号2表示的碱基序列构成；

(ii)一种DNA，其在严格条件下与由序列号2表示的碱基序列构成的DNA和由与其相互补的碱基序列构成的DNA杂交，且编码具有对纤维蛋白、H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及Bz-L-Arg-pNA的分解活性，对Bz-L-Arg-pNA的分解活性不被0.01mg/ml的SBTI抑制的蛋白质。

在此，在上述(ii)的DNA中，所谓的严格条件，是指例如在65℃下、在5×SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成是150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)中进行杂交，进而在含有0.1％的SDS的0.5×SSC溶液中于65℃进行清洗的条件。在严格条件下的杂交的各操作可通过“MolecularCloning(Third Edition)”(J.Sambrook & D.W.Russell，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中记载的方法等用以往公知的方法来进行。通常，温度越高，盐浓度越低，严格条件越高。

在严格条件下进行杂交的DNA，通常与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定以上的同源性，该同源性可列举例如70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、特别优选95％以上。碱基序列的同源性可用能通过市售或电通信回路(因特网)而能够利用的解析工具来算出。具体而言，使用BLAST(J.Mol.Biol.，215，403，1990)的解析软件来计算。

本基因可如下获得：将由上述蛋白酶生产菌根据常规方法调制的全mRNA作为模板，使用设计成能够扩增本基因全长的引物，通过RT-PCR法来获得。此外，本基因还可如下获得：将来源于上述蛋白酶生产菌的cDNA文库作为模板，使用设计成能够扩增本基因全长的引物，通过PCR法来获得。

利用PCR法进行的本基因的扩增，通过在含有成为模板的cDNA、PCR缓冲液、引物对(正向引物和反向引物)、dNTP混合物(脱氧核糖核苷三磷酸的混合物)和DNA聚合酶的反应液中，重复温度升降的循环来实施。正向引物和反向引物，是基于例如位于本基因的5’末端或其周边及3’末端或其周边的任意的约10～40bp的核苷酸序列来设计的，根据常规方法合成。具体而言，作为该PCR中使用的引物对，可例示TempeRTFored1引物(5’-CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT-3’)和TempeRTRevese1引物(5’-AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3’)的引物对。PCR缓冲液，可以根据使用的DNA聚合酶等进行适当选择，可以使用市售品。dNTP混合物和DNA聚合酶可以使用市售品。PCR的反应可依照惯用的步骤或DNA聚合酶的说明书来进行，可以根据需要，适当改变反应温度、反应时间、反应循环、反应组成等来实施。作为PCR的条件，可列举例如以在98℃20秒(改性)、在55℃20秒(复性)、在68℃60秒(伸长)构成的反应工序为1个循环，将其进行30次循环的条件。

重组载体

上述基因被导入适当的载体中来使用。能够在本发明中使用的载体，可以是独立复制的载体(例如质粒等)，还可以是导入宿主细胞时编入宿主细胞的基因组中、与所编入的染色体一起被复制的载体。作为该载体，具体而言，可列举来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、病毒(例如杆状病毒、乳多泡病毒、SV40、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、假性狂犬病病毒和反转录病毒等)等的载体；来源于质粒及噬菌体的遗传学要素的载体(例如粘粒和噬菌粒等)。

该载体优选为表达载体。表达载体中，本基因可功能性地连结转录所必需的要素(例如启动子等)。

含有上述基因的重组载体，可以将上述基因的序列与承担复制和控制相关信息的序列(例如启动子、核糖体结合部位、终止子、信号序列、增强子等)、选择标记基因的序列等作为构成要素，通过公知的方法将它们组合来制作。

上述基因，可以通过公知的方法插入到载体DNA中。例如，可以使用适当的限制性内切酶将DNA和载体DNA在特定部位切断，混合后通过连接酶再结合。此外，在上述基因上连接适当的连接体，即使将其插入到适于目的载体的多克隆位点上，也能够得到重组载体。

转化体

对于大肠杆菌、杆菌属细菌等细菌，酵母，昆虫细胞，动物细胞等公知的宿主细胞，用公知的方法导入编入有上述基因的重组载体，从而可得到导入有上述基因的转化体。基因导入方法没有特别限制，优选的是在染色体中的整合法。将上述重组载体向宿主细胞的导入，可根据宿主细胞的种类，适当选择公知的方法来进行。作为将重组载体导入宿主细胞的方法，具体而言，可列举磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介质转染、微注射、阳离子脂质介质转染、电穿孔等。

通过培养导入有上述基因的转化体，从培养物中回收本发明的蛋白酶，可以制造本发明的蛋白酶。

培养，可以使用适于宿主的培养基进行继代培养或分批培养。培养，可以以在转化体内外产生的蛋白酶的量为指标，一直进行到可获得适量的本发明的蛋白酶。

对于蛋白酶的回收方法，可以用与上述“2.蛋白酶的制造方法”栏中记载的方法相同的方法来实施。

5.血栓溶解剂和食品

上述蛋白酶的血栓溶解作用优异，通过作为血栓溶解剂的有效成分使用，在治疗和预防血栓症方面是有用的。例如，可以直接使用上述蛋白酶，或将上述蛋白酶微囊化，将其作为血栓溶解剂直接静脉注射来使用。此外，可以根据常规方法将上述蛋白酶制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液体制剂等形态，将其作为血栓溶解剂来口服使用。

对于该血栓溶解剂的给药量，根据给药对象的性别及年龄、血栓症的症状程度、该制剂的形态及给药方法等的不同而异，例如通常，上述蛋白酶的给药量每1天为0.001～20g、优选为0.01～10g的量。

该血栓溶解剂优选制剂成上述给药量单位。

此外，上述蛋白酶由于具有血栓溶解作用，且在宽pH区域是稳定的，所以也能够配合于各种形态的食品。这样，含有上述蛋白酶的食品作为治疗或预防血栓症用的食品是有用的，除此之外，作为易吸收性食品、蛋白质强化食品等也是有用的。

对于含有上述蛋白酶的食品，该蛋白酶的含有比例可根据食品的形态等进行适当设定，通常为0.0001～20重量％，优选0.001～10重量％。此外，作为该食品每1天的摄取量，根据食品的形态、摄取者的性别及年龄等的不同而异，例如换算成上述蛋白酶的摄取量，相当于每1天为0.001～20g，优选为0.01～10g的量。

6.发酵食品

上述蛋白酶生产菌，由于在安全性上没有问题，对人体无害，所以可以直接食用，因此可以将该菌用于发酵食品的制造。即，本发明还提供通过将上述蛋白酶生产菌进一步接种于食品原料并使其发酵而得到的发酵食品。

作为该发酵食品的制造中使用的食品原料，可列举例如大豆、花生、小豆、蚕豆等豆类，米、麦等谷类，可可，豆腐渣等。该发酵食品中，作为优选的物质，可列举使用豆类作为食品原料而制成的物质。

该发酵食品可如下制造：在食品原料中加入水，使得水分含量为30～70重量％，根据需要进行灭菌之后，接种上述蛋白酶生产菌，在20～35℃下培养24～72小时。此外，根据需要，还可以预先在食品原料中添加促进蛋白酶生产菌生长的物质(例如淀粉等)。

该发酵食品由于含有上述蛋白酶，所以基于该蛋白酶的作用而发挥以血栓溶解作用为代表的各种生理作用，因此作为健康食品是有用的。此外，使用上述蛋白酶生产菌制成的大豆发酵食品与使用以往的根霉菌制成的根霉相比，呈现不同的风味，具有新的喜好性，并且在基于上述蛋白酶的作用而发挥优异的生理作用这一点上是优异的。

实施例

以下，基于实施例详细地说明本发明，但本发明并不限于这些例子。

实施例1  蛋白酶的制造

将从使用木槿属植物的叶制成的根霉中分离出的镰刀菌sp.BLB株(FERM BP-10493)用1个接种环接种于30ml的液体培养基(含有脱脂大豆粉末2重量％、葡萄糖2重量％、聚胨0.5重量％、酵母提取物0.2重量％、KH₂PO₄0.1重量％和MgSO₄0.05重量％)，在28℃振荡培养72小时，将其作为前培养液。接着，将15ml的前培养液接种于1.5L的液体培养基(含有脱脂大豆粉末4重量％、葡萄糖3重量％、酵母提取物0.2重量％、KH₂PO₄0.1重量％、K₂HPO₄0.1重量％、MgSO₄0.05重量％和硅0.03重量％)，在发酵罐中，在通气量为0.5VVM、28℃的条件下培养72小时。

用压滤器将所得培养液固液分离。根据上述酪蛋白分解法测定所得培养上清的蛋白酶活性，结果为68.2单位/ml。而且，根据上述纤维蛋白平板法测定所得培养上清的蛋白酶活性，结果为1500IU/ml。

实施例2 蛋白酶的精制

在实施例1所得的培养上清3500ml中以达到70％饱和的方式添加硫酸铵，将蛋白质盐析。将通过离心分离得到的沉淀物溶解于100ml的20mM醋酸缓冲液(pH5.0)中，用相同缓冲液进行透析脱盐。进而，将透析内液350ml通过经相同缓冲液平衡化的CM-TOYOPEARL色谱柱(4.5×30cm、TOSOH公司制)，使蛋白质吸附在色谱柱上，用直线浓度梯度法将所吸附的蛋白质溶出，所述直线浓度梯度法使用直到0.5M NaCl浓度的相同缓冲液。回收酪蛋白和纤维蛋白分解活性部分190ml，向其中添加硫酸铵，使得再次达到70％饱和，将蛋白质盐析。将通过离心分离得到的沉淀物溶解于含有0.2M NaCl的相同缓冲液3ml，使用Superdex75色谱柱(Amersham Bioscience公司制)进行凝胶过滤，回收酪蛋白和纤维蛋白分解活性部分。

在如此得到的部分(最终精制物)中，确认了具有如下特性的蛋白酶被精制：(1)对于最终精制物，确认其作用和基质特异性后，获得上述表1所示的结果。最终精制物的蛋白酶活性用酪蛋白分解法测定，结果为634U/mg。(2)对于最终精制物，确认其作用pH和最佳pH后，获得图1所示的结果。(3)对于最终精制物，确认其pH稳定性后，获得图2所示的结果。(4)对于最终精制物，确认其作用温度和最佳温度后，获得图3所示的结果。(5)对于最终精制物，确认其温度稳定性后，获得图4所示的结果。(6)对于最终精制物，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，显示单一的带(推定分子量约27000)。(7)对于最终精制物，确认抑制剂的影响后，获得上述表2所示的结果。

此外，如此得到的最终精制物，通过使用小鼠的急性毒性实验确认了安全性。而且，对于该最终精制物，还确认了突然变异诱发性为阴性。

实施例3  蛋白酶的氨基酸序列和编码其的碱基序列的鉴定

<编码实施例2所得蛋白酶的基因组DNA序列的鉴定>

对于上述在实施例2中得到的蛋白质，解析N末端侧的氨基酸序列。已知在上述实施例2中所得蛋白质的N末端侧的氨基酸序列对来源于Fusarium oxysporum、Phaeosphaeria nodorum SNP1和Verticilliumdahliae的胰蛋白酶具有同源性。因此，考虑到这些信息，设计引物对A(5’-GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT-3’和5’-TCACCCTGGCAAGAGTCCTTGCCACC-3’)。使用该引物对A，以镰刀菌sp.BLB株(FERM BP-10493)的基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应中使用LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)。使用ISOPLANT(NIPPONGENE公司)从镰刀菌sp.BLB株中提取基因组DNA。其结果，约600bp的DNA片段被扩增。

接着，对该扩增片段进行测序，设计新的引物对B(5’-ACCATTCCCATTGTCTCTCGCGCCACTT-3’和5’-GGCGTTAAGAAGGGTACCACCGCACCAA-3’)。另一方面，将镰刀菌sp.BLB株的基因组DNA进行SalI消化之后，使其自身伸长(self ligation)。以其为模板，使用引物对B进行反向PCR反应，结果约2.5Kbp的DNA片段扩增了。

进而，对得到的扩增片段进行测序，设计新的引物对C(5’-CTTGCCAGGGTGACAGCGGTGGCCC-3’和5’-CAAGGATCAGCATCCCGATGAGGAAAGT-3’)。另一方面，将镰刀菌sp.BLB株的基因组DNA进行SacI消化之后，使其自身伸长(selfligation)。以其为模板，使用引物对C进行反向PCR反应，结果约4Kbp的DNA片段扩增。对该扩增片段进行测序，明确了编码本发明蛋白酶的1740bp的基因组碱基序列(序列号5)。另外，此处的基因操作所用的试剂使用TaKaRa公司制的试剂。而且，DNA测序中使用BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit(Applied Biosystems公司)。

<编码实施例2所得蛋白酶的cDNA序列和氨基酸序列的鉴定>

上述鉴定的基因组碱基序列(序列号5)中存在内含子，所以为了确定编码实施例2所得蛋白酶的区域，有必要鉴定cDNA的碱基序列。因此，根据以下的方法，进行编码实施例2所得蛋白酶的cDNA序列和氨基酸序列的鉴定。

首先，使用镰刀菌sp.BLB株的培养液和FastRNA Pro Kit(BIO101公司)，获得全RNA。进而，使用SuperScriptIII First-Strand System(Invitrogen公司)和Oligo dT引物，由所得全RNA调制cDNA文库。另外制作TempeRTFored1引物(5’-CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT-3’)和TempeRTRevese1引物(5’-AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3’)。使用该引物对、LA Taq(TaKaRa公司)和上述得到的cDNA文库，通过PCR法扩增目的cDNA。PCR反应条件为(98℃20秒、55℃20秒、68℃60秒)进行30次循环。对扩增得到的约800bp的DNA片段进行测序，结果明确编码实施例2所得蛋白酶的cDNA序列(序列号2)和实施例2所得蛋白酶的氨基酸序列(序列号1)。

明确了，实施例2所得蛋白酶的氨基酸序列(序列号1)与来源于Fusarium oxysporum的胰蛋白酶具有76％的同源性，与来源于Phaeosphaeria nodorum SNP1的胰蛋白酶具有62％的同源性。

实施例4 发酵食品的制造

将1kg大豆在3L的1.0重量％乳酸水溶液中浸渍一夜，将皮去除。然后，将去除皮的大豆浸渍在1.0重量％乳酸水溶液中，蒸煮30分钟。接着，在蒸煮后的大豆中添加20g淀粉进行混合，接种镰刀菌sp.BLB株的前培养液3ml，在28℃培养48小时，制造大豆发酵食品(根霉)。明确了如此得到的大豆发酵食品(根霉)，与使用以往的根霉菌(Rhizopus)制成的根霉相比，酿造出不同的风味，是具有新的喜好性的大豆发酵食品。

此外，将上述得到的大豆发酵食品1g添加到4ml的生理盐水中，在28℃搅拌3小时后，通过离心分离回收上清。根据上述纤维蛋白平板法测定所得上清的蛋白酶活性。此外，为了比较，使用以往的根霉菌(Rhizopus)来代替镰刀菌sp.BLB株，用与上述相同的方法制作大豆发酵食品(根霉)，同样地测定蛋白酶活性。其结果，使用镰刀菌sp.BLB株制成的大豆发酵食品时，其溶解面积为150mm²，与此相对，使用以往的根霉菌制成的根霉为70mm²。

由以上结果可确认，通过使用镰刀菌sp.BLB株制造大豆发酵食品(根霉)，与使用以往的根霉菌的情况相比，可以提供血栓溶解性高的发酵食品。

此外，上述得到的大豆发酵食品通过使用小鼠的急性毒性实验确认了安全性。

          序列表

<110>素出药株式会社

<120>新型蛋白酶、生产该蛋白酶的微生物及其利用

<130>P06-24

<160>5

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>250

<212>PRT

<213>镰刀菌属

<400>1

Met Val Lys Phe Ala Thr Ile Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Val Ala

1               5                   10                  15

Ala Arg Pro Gln Asp Arg Pro Leu Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala Ser

            20                  25                  30

Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Tyr Gln Gly Gly Pro

        35                  40                   45

Trp Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala

    50                 55                   60

His Cys Thr Ser Gly Arg Ala Ala Ser Ala Phe Gln Val Arg Ala Gly

65                  70                  75                  80

Ser Leu Asn Arg Asn Ser Gly Gly Val Thr Ser Ser Val Ser Ser Ile

                 85                 90                  95

Arg Ile His Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Leu Asn Asn Asp Val Ser

            100                 105                 110

Ile Leu Lys Leu Ser Thr Pro Ile Ala Ser Ser Ser Thr Ile Ser Tyr

        115                 120                 125

Gly Arg Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Ala Ala Gly Ser Ser Ala

    130                 135                 140

Thr Val Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ala Gln Gly Ser Pro Ser Ser Pro

145                 150                 155                 160

Val Ala Leu Arg Lys Val Thr Ile Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys

                165                 170                 175

Arg Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Asn Met Phe Cys Ala

            180                 185                 190

Gly Leu Glu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

        195                 200                 205

Pro Ile Val Asp Thr Ser Asn Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly

    210                 215                 220

Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Phe Ser Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly

225                 230                 235                 240

Thr Leu Arg Ser Tyr Ile Asp Gly Gln Leu

                245                 250

<210>2

<211>750

<212>DNA

<213>镰刀菌属

<400>2

catggtcaag ttcgctacca tcgtcgcact cgttgctcct cttgtcgccg ctaggcctca  60

ggaccgcccc ctcatcgttg gcggaacggc tgccagtgct ggtgacttcc ccttcatcgt  120

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taccctccgc tcttacattg acggccagct                                   750

<210>3

<211>548

<212>DNA

<213>镰刀菌属

<400>3

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<210>4

<211>563

<212>DNA

<213>镰刀菌属

<400>4

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<210>5

<211>1740

<212>DNA

<213>镰刀菌属

<400>5

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