天然型、断裂型或第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用

摘要

本发明公开了天然型、断裂型或第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用，实验证明：天然型β2糖蛋白I(nβ

说明书

技术领域

本发明涉及β2糖蛋白I的用途，特别是涉及β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的用途。

背景技术

β2糖蛋白I(β₂GPI)是富含磷脂结合位点的血浆蛋白(人的血浆中富含蛋白)，由326个氨基酸组成，包含有5个短同源重复序列和4个N连锁的糖基化位点，形成一个鱼钩状三维立体结构。β₂GPI的前四个结构域结构相似，而第五个结构域包含有一个保守的正电荷区域Cys²⁸¹-Cys²⁸⁸，这正是磷脂结合的主要位点。β₂GPI在结构域V Lys³¹⁷-Thr³¹⁸间的疏水环可以被纤维蛋白溶酶及FXIa所蛋白水解，从而可以阻断与阴性磷脂的结合并抑制了β₂GPI对于FXI活化的抑制作用。已有研究表明大部分抗磷脂的抗体与β₂GPI的结构域I优先结合。

血管新生，又称为血管发生、血管生成或血管形成，是自体血管以出芽或分枝的方式生长出新血管的过程。正常的血管形成在胚胎发育、伤口修复和月经周期中起重要作用。血管形成主要包括四个阶段：(1)血管内皮细胞去分化，血管通透性增加并出现渗漏；(2)内皮细胞释放蛋白溶解酶，降解细胞外基质，破环基底膜；(3)内皮细胞的迁移和增殖；(4)内皮细胞形成管状结构并相互连接等^[5]。血管发生受多种正性与负性调节因子的调控。现已发现多种细胞因子与血管形成有关，其中促进血管形成的因子有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等；抑制血管新生的因子有血栓素(thrombospondin)、血管抑素等。生理状态下，血管形成因子和抑制因子处于平衡状态，内皮细胞处于相对静止。在一些病理条件下，二者的平衡被破坏。其中血管形成因子的过度表达可导致异常的血管形成，往往与肿瘤、糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣等疾病有密切关系。

增殖型糖尿病视网膜病变(PDR)是糖尿病患者致盲的主要眼疾之一，对其防治是临床关注的焦点。研究证实视网膜血管新生异常是PDR发病的罪魁祸首，而血管内皮生长因子(VEGF)是促血管新生的重要因子。目前常应用激光光凝术和玻璃体切割术等治疗PDR，但可能发生术后视网膜脱离等严重并发症。另已发现VEGF受体的嵌合蛋白、抗VEGF单克隆抗体等能抑制眼内新生血管形成，但存在操作复杂、成本高、抑制程度参差等问题。因此寻求一种安全、有效、经济的阻抑VEGF及其受体表达与功能的药物，对于糖尿病视网膜病变、肿瘤、动脉粥样硬化的防治具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种天然型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种断裂型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种天然型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

一种断裂型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

一种第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I在制备抑制血管新生药物中的应用。

本研究在国内外首次发现天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)和第V结构域缺失型β2糖蛋白I(DI-IV)能够抑制内皮细胞血管新生。其作用机制是通过影响血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体的表达和磷酸化，抑制其信号传导途径，抑制下游的50个基因表达，进而抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管新生。本发明将为临床治疗血管新生性疾病，如糖尿病增殖型视网膜病变等提供新的防治手段。

附图说明

图1为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖；

图2为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖；

图3为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移；

图4为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移；

图5-1为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)(1μM)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-2为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)(1μM)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-3为断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)(1μM)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成

图5-4为断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)(1μM)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成

图5-5为第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)(1μM)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-6为第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)(1μM)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-7为第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)(1μM)不影响血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-8为第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)(1μM)不影响碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-9为人血清白蛋白(HSA)(1μM)不影响血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-10为人血清白蛋白(HSA)(1μM)不影响碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成；

图5-11为仅有培养液情况下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成(对照)；

图6为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的平均血管长度；

图7为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的平均血管长度；

图8为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管内皮生长因子(VEGF)受体的mRNA表达；

图9为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内Akt、ERK(1/2)、GSK3B(Ser9)的磷酸化激活；

图10为天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内Akt、ERK(1/2)、GSK3B(Ser9)的磷酸化激活；

图11为相对条带密度分析证实天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内Akt的磷酸化激活；

图12为相对条带密度分析证实天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内GSK3B的磷酸化激活；

图13为相对条带密度分析证实天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)抑制血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内ERK(1/2)的磷酸化激活。

具体实施方式

我们通过Matri胶及VEGF/bFGF(VEGF为血管内皮生长因子，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子)研究天然型β₂GPI、断裂型β₂GPI或结构域缺失突变型β₂GPI是否在体外对脐静脉内皮细胞的血管生成产生作用。

我们的结果显示天然型β2糖蛋白I(nβ₂GPI)、断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)和第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)可以通过结构域I在体外抑制VEGF及bFGF诱导的血管新生，这是通过下调内皮细胞KDR/Flk-1的表达进而阻断MAPK/ERK和PI3K/Akt/GSK3β通路中下游效应分子的磷酸化而完成的，而第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)没有这种作用。

实施例1

材料与方法

试剂

天然β2糖蛋白I、第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)和第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)的氨基酸序列见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&id＝28814，序列号为CAA40977。

断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)序列见Hunt JE，Simpson RJ，Krilis SA.Identification of aregion of beta2-glycoprotein I critical for lipid binding and anti-cardiolipin antibody cofactoractivity.Proc Natl Acad Sci U S A.1993Mar15；90(6)：2141-5。

血浆来源的天然的β2GPI(nβ₂GPI)购自Haematologic Technologies Inc(EssexJunction，VT)。

几种β2糖蛋白I的制备方法：

(一)第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)和第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)的表达与纯化：

1.构建含带组氨酸标签的目的基因片段的杆状病毒载体

(1)PCR扩增目的基因：

第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)：

上游引物：5’-GTAATAAAAAACCTATAAAT-3’

下游引物：5’-ACAGAATTCTTAACAACTTGGCATGGCAGA-3’

第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)

上游引物：5’-ACTCTGAATTCTACACCCAGAGTATGT-3’

下游引物：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(M13引物)

反应条件：95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，25个循环。100ul反应体系(含10mMTris/HCl缓冲液，pH8.3、50mM KCl、1.5mMMgCl₂、0.01％明胶、200μMdNTP、1μM上游下游引物、3Utaq酶)。

(2)目的基因与载体连接

制备第V结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DI-IV)用BamHI/EcoRI分别消化目的基因，与质粒pVL1393，使用连接酶构建包含目的基因片段的重组杆状病毒(分别简称为pVLLD15和pVLLD14)。

制备第I结构域缺失突变型β2糖蛋白I(DII-V)用BamHI/EcoRI消化目的基因，同时用EcoRI/BglII消化质粒pVLL1，使用连接酶构建包含目的基因片段的重组杆状病毒(简称为pVLLD25)。

(3)High Five^TM昆虫细胞系中表达目标蛋白：

Express Five SFM培养液27℃100RPM培养sf9(草地夜蛾)细胞，达到1-2×10⁶细胞/ml后，每1000ml加入30ml病毒载体，50小时后提取各种类型的β2-糖蛋白I。

2.使用Ni-NTA树脂提取纯化目标蛋白

原理：多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的His-6的蛋白能结合于固化的Ni²⁺树脂，用适当缓冲液冲洗去除其他蛋白质后，可再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白。有高效、高容量、强力浓缩和快速的特点。

a)制备Ni²⁺亲和柱。

b)提取含目标蛋白的上清液。

c)纯化带组氨酸标签的目标蛋白。

应用Nickel bead(Qiagen)、结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠和500mmol/LnaCl，pH7.8)、咪唑洗脱缓冲液(10-150mmol/L)、冲洗缓冲液(50mMNaxP04，0.5mMNaCl，pH7.5-8.0)等。

3.或用抗体亲和性层析法提取纯化蛋白：(略)

4.改造sf9昆虫细胞(如调控细胞周期、提高翻译后加工能力、改变细胞新陈代谢特性、实现基因组热点组合等)，提高重组蛋白产量及纯度(目标纯度>95％)。

(二)天然型β2-糖蛋白I(nβ₂GPI)的提取与纯化鉴定：

1.17.5％过氯酸沉淀。

2.缓冲液交换，使用G-25交换柱。0.05MNaCl 0.035M乙酸缓冲液(pH4.8)

3.阳离子交换层析。0.05MNaCl 0.035M乙酸钠缓冲液(pH4.8)、0.05MNaCl 0.035M乙酸钠缓冲液(pH5.2)1MNaCl 0.035M乙酸钠缓冲液(pH5.2)

4.肝素亲和层析。0.03MNaCl 0.02Mtris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.15MNaCl 0.02Mtris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.5MNaCl0.02Mtris-HCl缓冲液(pH8.0)

5.凝胶过滤。0.5MNaCl0.02Mtris-HCl缓冲液(pH8.0)

6.测定蛋白浓度、还原条件下SDS-PAGE、直接ELISA实验。

7.计算人血浆中β2-糖蛋白I的生成量。

8.氨基酸测序鉴定。

(三)断裂型β2糖蛋白I(cβ₂GPI)的制备

以下所有酶促反应均在37℃0.1mmol/LTris-HCl(pH7.5)含20mmol/LNaCl和0.3mmol/LCaCl₂下进行。β2-糖蛋白I与凝血酶以56∶1的摩尔浓度比进行反应，加入2倍体积的8mmol/L的盐酸胍终止反应。用10mmol/Ltris-HCl(pH8.0)的缓冲液稀释10倍，加样入HiTrap肝素柱，分别以含0.1mmol/L和1mmol/L的NaCl洗脱蛋白，计算断裂型β2-糖蛋白I的生成量。N-末端氨基酸测序鉴定蛋白。

内皮细胞培养液EGM Bulletkit(包含有内皮细胞基础培养基，0.5ml rhEGF，0.5ml氢化可的松，0.5ml GA-1000(庆大霉素、两性霉素B)，2ml牛脑提取物(BBE)，10ml胎牛血清(FBS)，QCL-1000^内毒素检测试剂盒购自Clonetics Inc.(Cambrex，MD)。

M199培养基、Hank’s液、磷酸缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素、内皮细胞生长因子(ECGP)、NuPAGE^TM4-12％聚丙烯酰胺凝胶、SYBR^Green qRT-PCR试剂盒购自Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)。人血清白蛋白(HAS)、胶原酶、明胶、EDTA、原钒酸钠、蛋白酶抑制剂、Accustain^苏木素缓冲液购自Chemical Co.(St.Louis，MO)。重组人血管内皮生长因子(rhVEGF)(165个氨基酸)、重组人成碱性细胞生长因子(rhbFGF)(157个氨基酸)购自R&D systems(Minneapolis，MN)。抗Erk1/2，Akt，GSK3B、抗β-actin、抗小鼠IgG辣根过氧化物酶、抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体由Cell Signaling Technology(Beverly，MA)单克隆小鼠抗人CD31抗体购自DAKO Australia Pty.Ltd.(Botany，NSW，Australia)。缺乏生长因子的Matri胶(无VEGF和FGF2)获自Becton Dickinson Biosciences(Bedford，MA)。CellTiter96^Aqueous细胞增殖分析试剂盒购自Promega(Madison，WI)。QIAamp^RNA提取试剂盒购自QIAGEN Pty.Ltd.(Clifton Hill，Victoria，Australia)。Rotor-Gene^TM3000实时定量PCR分析仪来自Corbett life science(Sydney，NSW，Australia)。BCA蛋白分析试剂盒来自Pierce(Rockford，IL)。硝酸纤维素膜(0.2μm)、ECL western印迹检测试剂购自Amersham Biosciences UK Ltd.(Little Chalfont，Bucking hamshire，UK)。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离与培养

HUVECs按照已经建立的方法从新鲜的脐带中获取。简言之，将导管插入人脐带的静脉中，用预冷的Hank’s缓冲液冲洗以清除内部血液，然后用1mg/ml II型胶原酶37℃孵育15分钟。重悬浮后内皮细胞接种于75cm²的培养瓶中，在含5％CO₂的37℃孵箱中进行孵育。当细胞融合后用5％胰酶-EDTA溶液消化分离。依据内皮细胞典型的鹅卵石样形态及抗CD31抗体免疫组化染色对其进行鉴定。

在刺激实验中细胞以含20％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的M199培养基进行培养，而后用无血清的M199培养基培养12小时，然后再在无血清培养基中施加干预因素：天然的、断裂的、结构域缺失型突变的β₂GPI(DI-IV和DII-V)、HSA、VEGF及bFGF。所有的试剂及培养基都以QCL-1000^Limulus试剂盒检测内毒素。

抗CD31抗体对HUVECs进行免疫组化染色

将2-3×10⁴HUVECs加在玻片上风干、丙酮固定，然后用TBS冲洗3次。滴加100ul3％过氧化氢室温孵育10分钟，TBS冲洗3次，滴加100ul抗CD31抗体(1∶100稀释)或是同种型小鼠IgG(对照)再孵育1小时，TBS冲洗后再加入100ulHRP标记的抗小鼠IgG(1∶100稀释)孵育40分钟，TBS清洗3次。DAB显色、苏木素复染、TBS冲洗数次后用显微镜显像系统观察CD31阳性细胞。

体外内皮细胞伤口愈合实验

应用体外伤口愈合实验来观察β₂GPI对于rhVEGF和rhbFGF诱导的HUVECs迁移的影响。用0.1％明胶包被的48孔板培养HUVECs，细胞融合后，以100-200μl微量加样器吸头对单层细胞进行划痕形成一裸露区，以无血清的培养基清洗后用含2％胎牛血清(此浓度可维持细胞生存但是并不引起细胞的迁移)的培养基进行培养。培养基中分别加入rhVEGF(50ng/ml)或rhbFGF(20ng/ml)、以无生长因子的作为对照，并加入nβ₂GPI(100nMand1μM)、断裂的或突变的β₂GPI(DI-IV和DII-V)(100nM)或是HSA(人血浆白蛋白)(100nM and 1μM)，孵育18小时后，用PBS冲洗两次后10％福尔马林进行固定、HE染色、以低倍镜(×50)进行显微照相。细胞迁移的定量分析应用如下方法：计数从划痕边缘迁移到裸露区的细胞数并除以裸露区的面积以cells/mm²表示，每孔细胞随机选取3个视野进行计数。每组细胞分别重复培养3孔。

HUVEC的增殖实验

细胞以5,000个/孔的密度接种于96孔板，培养24小时后以无血清的培养基饥饿12小时，以含2％胎牛血清的M199培养基进行培养72小时，培养基中加入rhVEGF(10ng/ml)或rhbFGF(10ng/ml)，同时加入nβ₂GPI or HSA(10nM，100nM and 1unM)。20ulMTS试剂与100ul培养基混合后滴加到每个孔中，37℃孵育2小时。酶标仪测定490nm的吸光度，490nm的吸光度与存活细胞的数量成正比，实验的线性范围为1000和8000个细胞/孔。

体外HUVEC在Matri胶上血管发生实验

在细胞铺板前，96孔板先以70ul不含生长因子的Matri胶进行包被，37℃30分钟进行固化。HUVEC以0.5×10⁴的密度接种于Matri胶表面于无血清的培养基进行培养，培养基中不加入或者加入10ng/ml rhVEGF或10ng/ml rhbFGF，并加入nβ₂GPI、cβ₂GPI、突变的rhβ₂GPI(DI-IV和DII-V)(浓度为10nM、100nM和1uM)。6小时后监测毛细血管样结构形成的情况，以显微镜成像系统以低倍镜(×50)进行拍照并存储为TIFF图片。在每次分析时对同一实验条件的3孔细胞分别随机选取5个视野进行拍照。管样结构形成的图像分析采用的是从网上下载的软件http://www.scioncorp.com/，图像被输入成Scion图片并转换成二元的形式。细管长度的计算方法是在每一个小管旁边画一条线然后以像素的形式测量线的长度。所有测量的数据在显微镜/相机测定后转换成um的单位，因为在镜头中安装了以um为单位的标尺。

实时定量PCR测定KDR/Flk-1和Flt-1mRNA表达

HUVECs在无血清的M199培养基中孵育过夜后，施加处理因素60分钟：HAS或是nβ₂GPI(2μM)。然后细胞中加入rhVEGF(40ng/ml)37℃孵育30分钟。细胞总RNA的提取采用的是QIAamp^RNA blood mini Kits，应用RNase-Free Dnase以去除基因组DNA的干扰，所提取的RNA浓度以OD260nm的数值来计算；RNA的完整性以EB染色用琼脂糖凝胶电泳观察核糖体18s及28s亚基的条带来鉴定。OD260/OD280的比值在1.8-2.0。1ug的RNA被逆转录为cDNA，引物的设计采用的是Primer3.0软件，引物见无二聚体形成没有非特异扩增产物。KDR/Flk-1(AF063658)的引物序列如下：上游5’-ACCCCTTGAGTCCAATCACAC-3’，下游5’-CATGGCTCTGCTTCTTCTCCTTTG-3’；Flt-1(NM002019)上游：5’-TCTCACACATCGACAAACCAATACA-3’，下游5’-GGTAGCAGTACAATTGAGGACAAGA-3’.；管家基因β-actin(BC013835)上游5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’。

实时定量PCR体系包括：12.5ul Platinum^SYBR^Green qPCR superMix-UDG(包含platinum^Taq DNA polymerase(60U/ml)，40mM Tris-HCl(pH8.4)，100mM KCl，6mMMgCl₂，400μM dGTP，400μM dATP，400μM dCTP，400μM dUTP，40U/ml UDG and SYBR^Green I)，0.5μl引物(上游和下游)(10μM)，cDNA和水。用Rotor-Gene^TM3000实时PCR监测系统进行扩增，PCR循环条件如下：UCG活化50℃2分钟，95℃2分钟，94℃5秒45个循环，然后55℃10秒，72℃10秒，在55℃-95℃间(10秒一个间距递增0.5℃)根据监测SYBR^Green荧光绘制熔解曲线。所有样本重复3次。应用Rotor-gene6软件通过比较阈循环数(Ct)与每一个测定值拷贝数的对数分析测定的曲线。通过连续的稀释模板cDNA的浓度来检测PCR扩增的效率，收集熔解曲线的数据来评价PCR扩增的特异性。在每一个标本中加入β-actin的引物来校正样本间的差异。每一个实验样本mRNA表达水平以β-actinmRNA表达水平进行标准化。

Western blotting法检测信号传导通路

HUVECs在无血清培养基中培养过夜后，加入nβ₂GPI或HSA(500nM and2μM)孵育60分钟，然后再加入40ng/ml rhVEGF37℃孵育30分钟。加入含有100um矾酸钠的冷PBS溶液1ml以结束反应，样本置于冰上用冷PBS洗涤，用缓冲液(含10mM Tris-HCl，5％脱氧胆酸，5％Triton X-100，250mM NaCl pH7.5，5mM EDTA，0.1mM原矾酸钠，丝氨酸蛋白酶抑制剂cocktail(含有1mM PMSF，10ug/ml Leupeptin and 1ug/ml aprotinin)进行裂解，细胞再于冰上孵育5分钟，然后用超声波裂解。裂解产物在4℃以12000g离心15分钟，上清蛋白质的浓度Micro BCA^TM Protein Assay Reagent Kit进行测定。30ug的蛋白上样于4-12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后凝胶转移至0.2um的硝酸纤维素膜。转移后的膜以含2％BSA的TBST或是0.5％的脱脂奶粉室温孵育1小时，然后以特异性的一抗(phospho-ERK1/2，total-ERK1/2，Akt，phospho-Akt(ser473)or phospho-GSK-3β(ser9))再进行孵育，TBST充分洗涤后，再加入HRP标记的抗兔IgG(1∶1000)室温孵育1小时。免疫印迹通过增强化学发光来观察，用高性能的化学发光胶片进行X线摄像。用Bio-Rad Gel Doc2000分析系统对胶片图像条带的密度进行测定。计算每一目的条带的密度值与theβ-actin的比值作为待测目的蛋白的相对密度。

统计学分析

数据以均数±标准差表示。两组间比较采用student’s t检验，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s检验。p<0.05为差异有显著性差异。

结果

β₂GPI呈剂量依赖性的抑制VEGF和bFGF诱导的HUVEC的增殖

血管新生包括内皮细胞局部的增殖。HUVEC在不同的条件下进行孵育：天然的、断裂的、结构域缺失型突变的β₂GPI(DI-IV and DII-V)或是HSA(10nM，100nM and1μM)，同时施加rhVEGF或rhbFGF(10ng/ml)刺激因素，以此来观察β₂GPI是否可以影响VEGF和bFGF诱导的细胞增殖。用MTS方法定量测定存活的内皮细胞数。与BSA相比，10nM，100nM and1000nM nβ₂GPI可呈剂量依赖性的抑制10ng/ml rhVEGF诱导的内皮细胞的增殖，其抑制率分别为11.49±14.31％(mean±SE，n＝6)(P>0.05)，38.70±8.808％(mean±SE，n＝6)(P<0.01)和68.89±6.118％(mean±SE，n＝6)(P<0.01)。此外，100nM and1000nM cβ₂GPI可以抑制rhVEGF诱导的内皮细胞的增殖，其抑制率分别为22.27±12.76％(mean±S，n＝6)(P>0.05)和34.44±8.550％(mean±SE，n＝3)(P<0.05)。DI-IV(100nM and1μM)也可以抑制rhVEGF诱导的内皮细胞的增殖，其抑制率分别为21.32±8.407％(mean±SE，n＝6)(P<0.05)和30.32±11.01％(mean±SE，n＝6)(P<0.05)。(见图1)另一方面，nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV同样可以呈剂量依赖性的抑制rhbFGF诱导的内皮细胞的增殖。(见图2)而DII-V对于rhVEGF或rhbFGF诱导的内皮细胞的增殖没有影响。

nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV呈剂量依赖性的抑制VEGF和bFGF诱导的HUVEC的迁移

内皮细胞穿过基底膜的迁移是建立新生血管的关键步骤。为了观察β₂GPI在体外对于rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞迁移的作用，我们采用了如下方法：对融合的单层内皮细胞进行划痕以去除一部分单层细胞形成一裸露区，然后施加干预：对照缓冲液、rhVEGF(50ng/ml)或rhbFGF(20ng/ml)，同时加入nβ₂GPI或HSA(100nM and1μM)孵育18小时。18小时后显微镜观察每孔细胞，在图3中我们可以看到与BSA相比，nβ₂GPI可呈剂量依赖性的抑制rhVEGF诱导的细胞迁移(100nM nβ₂GPI，37.24±15.75％(mean±SE，n＝6)(P<0.05)；1000nM nβ₂GPI，83.46±2.589％(mean±SE，n＝6)(P<0.01))。与此结果相似，nβ₂GPI亦可呈剂量依赖性的抑制rhFGF诱导的细胞迁移(与BSA相比，100nM nβ₂GPI，38.15±19.89％(mean±SE，n＝6)(P<0.05)；1000nM nβ₂GPI，76.15±9.350％(mean±SE，n＝6)(P<0.01))。在图4中我们可以看到，100Nm cβ₂GPI和DI-IV可以抑制rhVEGF诱导的细胞迁移(分别为54.90±6.867％(mean±SE，n＝6)(P<0.01)和44.11±11.55％(mean±SE，n＝6)(P<0.05))，100nM cβ₂GPI和突变的β₂GPI(DI-IV)同样可以抑制rhFGF诱导的细胞迁移(分别为59.56±4.683％(mean±SE，n＝6)(P<0.01)，44.06±12.77％(mean±SE，n＝6)(P<0.01))。此外，nβ₂GPI、cβ₂GPI、突变的β₂GPI(DI-IV)之间对于抑制细胞迁移的作用没有显著性差异。然而，突变的β₂GPI(DII-V)并不能抑制rhVEGF或rhbFGF诱导的细胞迁移，这就说明结构域I含有介导血管新生作用的重要序列。

nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV可以在Matri胶上抑制VEGF和bFGF诱导的HUVEC的血管发生。

血管新生以内皮细胞新生管样结构为重要特征，因此我们采用血管形成实验来研究nPβ₂GPI对于HUVEC毛细血管样结构生成的影响。在Matri胶上给与rhVEGF或hbFGF(10ng/ml)刺激后，内皮细胞聚集成束状，6小时后开始形成管样结构(图5)。nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV(100nM and1000nM)均可以显著性的抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞管样结构的形成(P<0.01)(见图6、图7)然而，突变的β₂GPI(DII-V)并不能抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞管样结构的形成(P>0.05)。有趣的是，nβ2GPI仅在浓度为1000nM时才可抑制bFGF诱导的管样结构的形成，而nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV均可成剂量依赖性的抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞管样结构的形成(见图6、图7)。β₂GPI可以抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA表达而对于Flt-1则没有影响

在此我们研究nβ₂GPI是否可以抑制KDR/Flk-1——在内皮细胞增殖、迁移及血管发生中发挥重要作用的受体——的表达。500nM and2000nM的nβ₂GPI可以抑制rhVEGF(40ng/ml)诱导的内皮细胞KDR/Flk-1mRNA的表达，可分别抑制58.94±14.24％(mean±SE，n＝3)(P>0.05)和81.69±5.634％(mean±SE，n＝4)(P<0.05)见图8；它同样也可抑制bFGF(40ng/ml)诱导的内皮细胞KDR/Flk-1mRNA的表达，可分别抑制92.72±2.270％(mean±SE，n＝3)(P<0.01)and82.44±7.691％(mean±SE，n＝3)(P<0.01)。与之相反，nβ₂GPI不能抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的内皮细胞Flt-1的表达。

β₂GPI可以阻断rhVEGF和rhbFGF诱导的下游信号传导通路

rhVEGF和rhbFGF与内皮细胞上受体结合后可以活化细胞内一系列激酶。内皮细胞的生存有赖于PI3K的活化，而后增加磷脂酰肌醇3，4，5并活化多种细胞内的分子，比如Akt及其下游蛋白GSK3β。rhVEGF和rhbFGF通过活化这些通路中的蛋白经由MAPK途径进而激活Erk-1/2而发挥作用。为了研究nβ₂GPI对于rhVEGF和rhbFGF诱导的KDR/Flk-1触发的下游信号传导分子的作用，我们检测ERK1/2，Akt，and GSK3β的活化情况。内皮细胞由500nM和2μM的nβ₂GPI预处理1小时，而后给与rhVEGF或rhbFGF(40ng/ml)刺激30分钟。用磷酸化的特异性抗体以western blotting方法检测ERK1/2，Akt(Ser473)andGSK-3β(Ser9)的活化情况(见图9、图10)。nβ₂GPI可呈剂量依赖性的抑制rhVEGF和rhbFGF诱导的Akt(Ser473)，GSK-3β(Ser9)and ERK1/2的磷酸化。(见图11、图12、图13)

讨论

我们的实验结果表明nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV可以在体外抑制rhVEGF-和rhbFGF诱导的内皮细胞增殖、迁移和血管形成，这一过程主要是由KDR/Flk-1及其下游信号传导通路(包括MAPK/ERK和PI3K/Akt/GSK3β通路)所调节。

β₂GPI是一种磷脂结合的血浆蛋白由5个结构域组成。β₂GPI的结构提示在第五个结构域插入类脂膜，两个结构域(III和IV)通过糖基化来防止蛋白水解，另两个结构域(I和II)从类脂表面伸出，这样就可以与其他蛋白质和/或抗体结合。结构域V与其他几个不同，它含有带正电荷的赖氨酸和一个疏水的环状C末端。第五个结构域的C末端是外露于表面的，因此在Lys³¹⁷与Thr³¹⁸易于被纤维蛋白溶酶和FXIa水解，形成断裂型β₂GPI。在有血栓形成及DIC、白血病、红斑狼疮的患者血浆中可以检测到断裂型β₂GPI，它是体内纤维蛋白溶解作用激活的敏感性标志物。DIC及纤溶作用的激活是肿瘤患者的常见病变。最近许多研究发现许多抑制血管生成的蛋白水解片段或是一些蛋白隐藏的结构域，如血管他丁、内皮他丁、血小板反应素，金属蛋白酶组织抑制剂可以阻断肿瘤向血管生成表型进行转换。

以往的研究表明VEGF与VEGFRs是内皮细胞增殖、迁移的主要调节因子，VEGF通过与其特异性受体相互作用诱导内皮细胞血管生成。迄今为止β₂GPI对于抑制VEGF诱导的血管生成的分子学机制尚未完全阐明。目前并没有文献报道关于β₂GPI对于VEGFR及其下游信号传导通路分子表达的影响。因此我们在体外研究nβ₂GPI、cβ₂GPI及结构域缺失突变的β₂GPI(DI-IV，DII-V)对于VEGF诱导的血管生成的影响。

我们的结果显示在体外，nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV有着强大的抗血管生成的作用。nβ₂GPI、cβ₂GPI及DI-IV可呈剂量依赖性的影响VEGF诱导的内皮细胞与血管生成相关的进程，包括内皮细胞增殖、迁移及管样结构的生成。

β₂GPI的结构域I介导其对于VEGF与bFGF诱导的内皮细胞的血管发生的抑制作用，而β₂GPI的结构域V并无此作用。有趣的是，抗β₂GPI的抗体可以直接对抗与APS临床表现相关的结构域I的抗原决定簇。APS患者的抗体可以通过MAPK途径呈剂量依赖性的诱导单核细胞VEGF和Flt-1的表达。目前的研究提出了这样一种新的可能性，β₂GPI的结构域I的抗血管生成的作用可能被APS患者体内针对结构域I的抗体所消除。

我们假设β₂GPI的抗血管生成的作用与VEGF/KDR/Flk-1系统成特异性的相关。为了验证这个假设，我们首次应用了另外一个强大的致血管生成因子——bFGF研究了β₂GPI对于内皮细胞增殖、迁移及血管生成的影响，发现β₂GPI同样可以抑制bFGF诱导的内皮细胞的血管生成。这些结果表明β₂GPI抗血管生成的活性并不局限于某个特定的配体或受体。

为了证实β₂GPI通过下调VEGFR来实现抗血管生成的作用，我们测定了Flt-1和KDR/Flk-1基因的表达。实时定量PCR分析显示β₂GPI可呈剂量依赖性的抑制VEGF诱导的KDR/Flk-1基因表达，而Flt-1表达未受影响。KDR/Flk-1是内皮细胞VEGF发挥作用的主要介质。有趣的是β₂GPI同样也可抑制bFGF诱导的KDR/Flk-1基因表达。这就说明bFGF通过间接活化VEGF/VEGFR通路来诱导血管新生，而不是通过自身受体而发挥作用。以往学者提示bFGF通过调节VEGF受体的数目使内皮细胞对于低浓度的VEGF的刺激作用更为敏感，我们的实验进一步证实了这一假设。因此，我们有理由相信，对于KDR/Flk-1的抑制作用是β₂GPI抑制VEGF和bFGF诱导内皮细胞血管生成作用的主要机制。

以往研究表明，VEGF通过活化MAPK/ERK1/2通路来诱导内皮细胞的增殖并通过激活PI3K，增加磷脂酰肌醇3，4，5，活化AKt及其下游分子维持细胞的生存。在丝氨酸/苏氨酸蛋白合成酶中表达的GSK-3，是PI3K/Akt通路的主要下游作用原件，通过调节细胞周期蛋白D1的蛋白水解及亚细胞器的定位来发挥作用，它的活性可以被Akt介导的Ser9磷酸化而抑制。细胞周期蛋白D1是内皮细胞周期中由G1期向S期转化的重要介质，通过形成细胞周期蛋白D1与CDK4复合物使RB蛋白磷酸化而失活，然后释放E2F来介导由G1期向S期转化。因此我们研究β₂GPI是否可以阻断VEGF诱导的KDR/Flk-1通路的下游事件，如活化ERK1/2或使Akt和GSK-3B磷酸化。我们发现β₂GPI可以阻断VEGF诱导的ERK1/2，Akt(Ser473)的磷酸化。与以往研究一致，各种血管原性分子如内皮他丁、辣椒辣素、酸性黄可以通过下调细胞周期蛋白D1从而抑制RB的磷酸化及DNA的合成，我们的研究表明β₂GPI可以显著性的抑制rhVEGF或rhbFGF诱导的GSK3β(Ser9)的磷酸化。因此我们提出β₂GPI对于与rhVEGF或rhbFGF诱导的内皮细胞的抗血管生成作用可能还伴随着通过抑制细胞周期蛋白D1表达及RB磷酸化而使细胞停留在细胞周期的G0/G1期。在我们的实验中，可以很容易看出β₂GPI通过下调内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA表达来阻断rhVEGF或rhbFGF诱导的MAPK/ERK及PI3K/Akt/GSK3β通路下游信号蛋白的磷酸化。这些实验结果结合β₂GPI的分子结构为今后进一步研究β₂GPI在血管新生中的作用的确切机制开拓了美好的前景。