高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法

摘要

一种高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法，采用酪蛋白底物琼脂鉴定平板初筛与发酵酶活测定复筛的方法获得高产耐高温蛋白酶苏云金芽孢杆菌Bt140；采用Plackett－Burman设计与响应面分析法快速获得了Bt140最佳的发酵产酶配方与发酵条件，最终摇瓶发酵水平可达918.56U/mL。Bt140生产耐高温蛋白酶时，不影响发酵结束收集芽孢生产杀虫剂，使该菌兼具有蛋白酶与杀虫剂两种产品的生产能力。以1吨发酵为例，除了获得相应的Bt杀虫剂外，还获得60～90Kg1万单位的酶粉。

说明书

所属技术领域  本发明涉及高产蛋白酶菌株的筛选及培养方法，特别是高产耐高温蛋白酶苏云金杆菌的筛选及培养方法。

背景技术

蛋白酶是一种重要的酶制剂，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革工业中。耐高温蛋白酶具备耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点，其研究尤为重视。人们已经从Thermus aquatics，Bacillusthermoproteolyticus，B.stearothermophilus，Thermoactinomycesvulgaris，Sulfolobus solfataricus，Pyrococus furiosus等高温菌中分离到各种类型的高温蛋白酶。目前高温蛋白菌产量低，生产成本高。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种非常重要的昆虫病原细菌，是至今为止最为成功的微生物杀虫剂。其主要用途作为生物农药，国内外尚未见到利用Bt生产耐高温酶的报道。

通常发酵优化过程需要的周期较长，工作量大。采用统计数学的方法能够较快达到优化目标，同时可建立相关的数学模型，预测最佳值。获得优化值更具科学性、可靠性与准确性。目前二水平设计的Plackett-Burman设计与响应面分析法(Response surface methodology简称RSM)是被认为在优化过程中最有效的统计方法。

发明内容

本发明的目的：筛选高产耐高温蛋白酶的Bt菌株，采用数学统计学的方法进行该菌株发酵条件优化，获得最优的培养基与培养条件。

1、菌株筛选方法，包括以下步骤：

初筛：在55℃的条件下，利用酪蛋白琼脂鉴定平板对市场所能购得的提供初筛Bt菌株的菌落琼脂块与其初始发酵液分别进行检测，选取水解酪蛋白形成透明圈较大且水解圈明显的菌株为初筛菌株；

复筛：对所述初筛菌株进行发酵验证，以酪蛋白为底物，采用紫外分光测定法进行酶活测定，选取高酶活的菌株Bt140为高产耐高温蛋白酶的菌株，其初始发酵水平为263.43U/mL。

2、发酵条件优化：

(1)Bt140形态特征与生理生化特征

采用微生物学分析法进一步了解Bt140细胞形态特征与常见生理生化反应特征。

表1 Bt 140生理生化特性

(2)Plackett-Burman设计筛选重要影响因子

通过单因素筛选试验得到与Bt140产酶相关的培养基与培养条件8个因素。采用Plackett-Burman设计筛选产酶重要影响因子，选用试验次数N＝12的设计，对初始pH、装量、葡萄糖(％)、酵母粉(％)、黄豆饼粉(％)、KH₂PO₄(％)、MgSO₄(％)和CaCO₃(％)等8个因素进行考察，结果见表2、表3，发现可信度大于80％的几个因素均为培养基组分。它们对产酶影响顺序为：黄豆饼粉＞酵母粉＞葡萄糖＞CaCO₃

表2 N＝12的Plackett-Burman的试验设计与结果

表3各因素的主效应

(3)响应面分析优化培养基组成

对三个重要因素，即黄豆饼粉、酵母粉、葡萄糖，采用Box-Behnken的中心组合设计，设计了3因素3水平共15个试验点，进行响应面分析优化，建立了二次响应面回归模型并进而寻求最优响应因子水平。回归方程中回归系数的估算值见表4，得到拟合二次回归方程如下：Y＝759.36+51.33*X1+7.21*X2-20.98*X3+12.45X1*X1-61.21X2*X2-74.52X3*X3-29.47X1*X2+1.50X2*X3-0.53X1*X3。模型可信度分析见表5。二次响应面回归模型是显著(决定系数R²＝0.9472)，模型拟合程度很好，说明这3个因素及其二次项能解释Y变化的94.72％，模型回归P值＝0.0104；拟合不足P值＝0.6561，说明模型失拟不显著，回归显著，所以该模型可以用于Bt产酶发酵优化的理论预测。由模型推出最高产酶水平的最佳培养基配方(重量百分比)为：黄豆饼粉1.8％、酵母粉0.36％、葡萄糖0.14％、KH₂PO₄ 0.25％、MgSO₄·7H₂O 0.035％、CaCO₃ 0.05％、其余为水。初始pH值为7.0。模型预测值为826.66 U/mL，实验验证值为837.71U/mL，试验值与模型计算值相差+1.34％。

表4回归方程中回归系数的估计值

Table 6  Estimated value of coefficient in the regression equation

表5方差分析表

(4)培养条件优化

采用单因素筛选法对Bt140产酶条件进行优化，确定最佳的发酵条件：所述产酶条件包括发酵温度、装液量、接种量和发酵时间。培养基装量35mL/250mL三角瓶，培养温度31℃，摇瓶转速为250r/min，接种量为0.75mL(菌悬液浓度7×10⁶个/mL)，初始pH7.0，发酵时间为24h。

(5)Bt140蛋白酶酶学特性

Bt140蛋白酶最适用作用温度为55℃，在55℃条件下1h基本不失活，在60℃条件下1h仍有60％以上的活力，是典型的耐高温蛋白酶。

3、Bt140发酵条件优化结果

采用黄豆饼粉培养基，最佳的产酶配方按重量百分比如下：黄豆饼粉1.8％、酵母粉0.36％、葡萄糖0.14％、KH₂PO₄ 0.25％、MgSO₄·7H₂O 0.035％、CaCO₃ 0.05％，其余为水；

最佳的发酵产酶培养条件：培养基装量35mL/250mL三角瓶，培养温度31℃，摇瓶转速为250r/min，接种量为0.75mL(菌悬液浓度7×10⁶个/mL)，初始pH7.0，发酵时间为24h。

Bt140蛋白酶酶学特性研究表明是一种典型的耐高温蛋白酶。

本发明的优点在于：1.首次采用Bt菌株制备耐高温蛋白酶；

2.高温蛋白酶由于其具备耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点，在工业具有更广泛的用途；

3.Bt140生产耐高温蛋白酶时，不影响发酵结束收集芽孢生产杀虫剂，使该菌兼具有蛋白酶与杀虫剂两种产品的生产能力。以1吨发酵为例除了获得相应的Bt杀虫剂外，还获得60～90Kg 1万单位的酶粉。

4.采用统计学方法对Bt140产酶过程进行优化，获得最佳配方与发酵条件，Bt140产酶水平有了显著的提高，由初筛的263.43U/mL提高到918.56U/mL。

具体实施例

实施例一：一种高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选方法，包括以下步骤：

酪蛋白底物琼脂鉴定平板制作：琼脂鉴定平板配方(重量百分比)为酪蛋白2％，琼脂2％，其余为水，pH为7.0-7.2，制备成厚度为3mm的琼脂平板。

初筛1：平板分离34株Bt菌株，待长出稀疏的小菌落后，用打孔器取出长有单菌落的琼脂小块，每一菌株取3个琼脂块，将34株琼脂块置于同一块的鉴定平板上，共三块鉴定平板，置于37℃继续培养24h，根据琼脂块周围形成的蛋白水解圈大，且透明程度高的菌株为高产菌株。

初筛2：利用打孔器在酪蛋白底物琼脂鉴定平板上打出34个1.5mm的大小一置的孔洞，分别在孔洞中加入15μL34株菌株的发酵酶液，将鉴定平板置于55℃的培养箱中24h，重复3块平板。根据孔洞周围所形成的蛋白水解圈大，且透明程度高的菌株为高产菌株。

结合初筛1与初筛2可以准确获得34株Bt中耐高温蛋白酶高产菌4株。

复筛：对初筛菌株获得4株Bt菌株进一步进行发酵验证，并以酪蛋白为底物，采用紫外分光测定法进行酶活测定，获得高酶活的菌株Bt140，其初始发酵水平为263.43U/mL。

实施例二：Bt140产酶发酵液制备

Bt140发酵液制备，包括菌株选择、斜面培养、一级种子、斜面培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。Bt140斜面培养置于37℃下，培养2d后，保存于4℃的冰箱中。从斜面接一环至250mL三角瓶中，培养基装量为35mL/250mL三角瓶，培养基为牛肉膏蛋白胨，在31℃的条件下，置于250r/min的摇床上，培养15h，获得一级种子。通过对一级种子的计数，控制发酵的接种量为0.75mL(菌悬液浓度7×10⁶个/mL)，发酵培养基配方(重量百分比)为：黄豆饼粉1.8％、酵母粉0.36％、葡萄糖0.14％、KH₂PO₄0.25％、MgSO₄·7H₂O 0.035％、CaCO₃ 0.05％，其余为水。发酵产酶培养条件为：培养基装量35mL/250mL三角瓶，培养温度31℃，摇瓶转速为250r/min，菌悬液浓度为7×10⁶个/mL，每瓶接种量为0.75mL，初始pH7.0，发酵时间为24h，即获得Bt140产酶发酵液。

实施例三：利用Bt140产酶发酵液制备耐高温蛋白酶和Bt杀虫剂

1、制备Bt杀虫剂：取如实施例一所述的Bt140产酶发酵液1000L，调节pH至5.0，在50r/min搅拌下，按3％的比例加入絮凝剂Al₂(SO₄)₃.18H₂O30kg，沉淀2h后，采用蝶式离心机，离心机转速为8000r/min，离心操作15-20min，进行菌液分离，获得湿菌体和去除菌体后的产酶发酵液。收集湿菌体真空干燥8h，粉碎后得Bt杀虫剂；去除菌体后的产酶发酵液用于制备耐高温蛋白酶。

2、制备食品级耐高温蛋白酶：取去除菌体后的产酶发酵液1000L，采用100目的滤布滤除大颗粒，将过滤液进行超滤浓缩，超滤膜的孔径为10000道尔顿，浓缩比为1∶4，获得耐高温蛋白酶的浓缩液。加入70kg固体助剂玉米淀粉进行喷雾干燥。采用离心式喷雾机，空气进口温度为80℃，出口温度40℃，最终制备得到10000U/g食品级耐高温蛋白酶酶粉。

3、制备工业级耐高温蛋白酶酶粉：取去除菌体后的产酶发酵液1000L，用盐酸调节pH至4.0以下，加入硫酸铵使其浓度控制在55-60％，沉淀24h后，倾去上清液，将沉淀通过三足式离心机，在4000r/min的条件下离心20min除去母液，将沉淀置于40℃条件下真空干燥，烘干后磨成粉制备得到5000U/g工业级耐高温蛋白酶酶粉。