LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株及其用途

摘要

本发明公开了一种LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株及其用途，属于医学生物技术领域。LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCC 1992。本发明的优点是：1)染色体稳定，分泌IgG1型抗体；2)可在无血清培养体系中培养；3)分泌抗体效价高，直接培养的上清可达到1∶20万；4)小鼠腹水可达到1mg/ml；效价可达到1∶360万，可以用protein G纯化；5)分泌抗体可以用于免疫组化(1∶1000)和免疫印迹(westernblot)实验(1∶3000)。

说明书

技术领域

本发明涉及LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株及其用途，属于医学生物技术领域。

背景技术

激素相关肿瘤，主要包括乳腺癌、子宫内膜癌与卵巢癌，是女性最为常见的恶性肿瘤，雌激素过度刺激以及雌激素受体α(ERα)过度表达肿瘤发生与进展的关键性因素，临床研究结果表明准确判断肿瘤细胞中ERα的功能状态是预后判断、治疗策略选择的重要指标，如ERα阴性乳腺癌患者的化疗反应性较阳性患者好，而对内分泌治疗的反应性则较ERα阳性患者差，ERα阳性乳腺癌患者可分为淋巴结转移与无淋巴结转移组，对这两组患者的临床治疗策略又有所不同。目前国内外多数单位采用免疫组化方法对ERα的表达进行常规检测，但单纯检测ERα表达状况只能反映其表达量，而不能反映其功能活性水平，如，在一些肿瘤中尽管可以检测出ERα的存在，但极可能是一种结构异常的ERα蛋白，实际上缺乏功能，从而导致假阳性结果，同样，一些不能通过生化及免疫组化检测出来而实际上具有生物学活性的ERα的存在也会导致假阴性结果，所以目前尚没有一个能合理判定肿瘤细胞中ERα功能活性的指标。

LRP16是我们识别的一个ERα诱导的靶基因，其表达水平明显依赖于雌激素活性，同时LRP16又是ERα的一个共激活因子，对ERα功能活性具有反馈增强作用，雌激素与ERα结合后的信号传导对LRP16存在依赖性，同时LRP16在某些细胞中对ERα有内激活效应，LRP16的这一特征具备了可以指示ERα功能活性的优良条件，所以我们认为检测雌激素相关肿瘤中LRP16的表达状况可以准确的判断肿瘤中ERα的功能活性。我们的前期研究结果还表明：抑制LRP16表达的雌激素依赖性乳腺细胞对放射线的杀伤敏感性显著增强，而对某些抗肿瘤药物的杀伤敏感性显著降低；使用LRP16多抗，通过免疫组化的方法初步检测了62例乳腺癌标本、76例子宫内膜癌标本与62例卵巢癌标本，发现在乳腺癌与子宫内膜癌中LRP16与ERα的表达呈正相关性，并且LRP16阳性与三种肿瘤的病程进展关系密切，表明LRP16在雌激素相关肿瘤中具有重要的分型价值、预后判定以及治疗指导性价值。

大量研究表明ERα与雌激素依赖性肿瘤的治疗及预后判断密切相关，但临床学家同时认识到单纯的通过生化与免疫组化方法检测肿瘤中ERα的表达量并不能准确地反映出ERα信号通路的功能活性，这一点是导致乳腺癌内分泌治疗抵抗的一个重要原因，并且是肿瘤化放疗策略选择的一个重要的限制行因素。为获得肿瘤中ERα信号活性的准确信息，有效的指导临床用药与判定预后，近年来，国内外临床机构开始在肿瘤中同时检测雌激素调节的靶基因，如孕激素受体(PR)、pS2、热休克蛋白27(HSP27)或组织蛋白酶D(Cath-D)等，结果证实同时检测ERα与其调控基因的水平对乳腺癌的预后预测优于目前任何一种指标。

近年来大量的临床研究结果表明，ERα阳性患者对化疗敏感性较阴性患者差，我们前期基于细胞系的研究结果显示：抑制LRP16基因的表达增强了乳腺癌MCF-7细胞的辐射敏感性，而降低了对某些化疗药物，如5-氟脲嘧啶(5-FU)、大剂量环磷酰胺(CTX)的杀伤敏感性，而对物氨甲喋呤(MTX)、吡柔比星(THP)和顺铂(DDP)的杀伤敏感性却没有明显变化，提示LRP16作为ERα功能活性的一个重要指标在激素依赖性肿瘤治疗中的潜在应用价值。

LRP16是我们实验室克隆并识别功能的一个人类基因，对该基因功能的研究成果具有自主的知识产权，与上述雌激素调控的靶基因有所不同，LRP16不仅是ERα的一个靶基因，而且是ERα的一个共激活因子，在某些细胞中LRP16对ERα存在内激活效应，在LRP16与ERα之间存在表达调控与反馈激活的作用，同时LRP16又不同于目前识别的其他ERα共激活因子，因为目前识别的其他ERα共激活因子的表达不受ERα的调控，所以检测肿瘤中LRP16的表达水平具备了反映ERα信号活性的良好特征，鉴于LRP16蛋白的功能特征，检测雌激素相关肿瘤中LRP16的表达应优于检测肿瘤中ERα本身的含量与其目前临床上使用的任何一个靶蛋白的水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一株LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在医学检验领域的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.1992。

一种由杂交瘤细胞株CGMCC 1992分泌的单克隆抗体。

LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株用于制备LRP16单克隆抗体的用途。

LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株用于制备检测雌激素相关肿瘤的试剂的用途。

一种由杂交瘤细胞株CGMCC 1992分泌的单克隆抗体用于制备检测雌激素相关肿瘤的试剂的用途。

LRP16单克隆抗体杂交瘤细胞株14-2-1C2H10，于2007年4月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号为CGMCC No.1992，建议的分类命名为：杂交瘤细胞。

我们采用上述杂交瘤细胞制备了LRP16单抗。该LRP16单抗，可用于通过免疫组化方法检测乳腺癌、子宫内膜癌以及卵巢癌中ERα、PR、LRP16以及E-cadherin的表达，进而对各指标的临床病理相关性、治疗相关性、无病生存期与总生存期进行统计学分析，最终判定LRP16对上述雌激素相关肿瘤的分型诊断的价值以及对临床治疗的指导性价值。

本发明的优点是：1)染色体稳定，分泌IgG1型抗体；2)可在无血清培养体系中培养；3)分泌抗体效价高，直接培养的上清可达到1∶20万；4)小鼠腹水可达到lmg/ml；效价可达到1∶360万，可以用protein A纯化；5)分泌抗体可以用于免疫组化(1∶1000)和免疫印迹(western blot)实验(1∶3000)。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为单克隆抗体染色体分析结果。

图2为单克隆抗体的IG类型鉴定结果。

图3为单克隆抗体纯度测定结果。

图4为采用单抗检测(免疫组化方法)正常子宫内膜中LRP16与ER  的表达，结果证实二者均在腺管上皮细胞中着色，且为细胞核分布。

具体实施方式

实施例1：制备杂交瘤细胞

一.材料和来源

1.抗原：LRP16蛋白(GeneBank No.AF202922)，根据文献(黄柯，孟元光，韩为东，赵亚力，李琦，宋磊.LRP16基因的多克隆抗体制备及表达的探索.军医进修学院学报.2007，28(2)：87-89.)的方法制备。(LRP16蛋白溶于1×PBS中，调整浓度为：4mg/ml)

2.动物：6-8周龄ABLB/c鼠(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)

3.骨髓瘤细胞系：SP2/0(美国ATCC细胞库)

4.完全和不完全佐剂(SIGMA公司)

5.RPMI-1640基础培养基、不完全RPMI-1640培养基、完全RPMI-1640培养基、HT培养基、HAT培养基(Gibico公司)

二.方法

1.免疫动物：

采用搅拌混合法，将等体积的抗原溶液和佐剂均匀混合。

初次免疫：每只鼠打≥8针(腋下腹股沟腹腔)每针0.2ml，用完全福氏佐剂；两周后第二次免疫：剂量针数同上但用不完全福氏佐剂；两周后第三次免疫：剂量针数同上但不加佐剂；(于融合前3天)加强免疫：50ug-100ug im\iv；3天后取脾并采血。

2.产生抗体的细胞的分离：

经四次免疫后的BALB/c小鼠，摘眼球放血。分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。浸泡于75％酒精中5分钟，于解剖台板上固定后用注射器注射5ml不完全培养基至腹腔，用酒精棉球轻轻按摩腹部，随后吸出注入的培养液，再用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜并剪开用培养基反复冲洗腹腔，收集腹冲液，1000r/min离心10分钟，弃上清。加HAT培养基至25-30ml将沉淀的细胞重悬，加入到3块96孔板中。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃5％CO2的培养箱中培养。

脾细胞：掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用注射器内芯挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用100目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加冰醋酸破红后计数。通常每只小鼠可得1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×10⁸-10×10⁸脾细胞。

3.骨髓瘤细胞系：

骨髓瘤细胞生长快通常以1∶10传代，(37℃，5％CO₂孵箱，用含8％FBS的完全RPMI-1640培养基(Gibico公司))，融合前，使大多数细胞处于对数生长期，细胞形态均一，细胞密度适中(大约70-80％)。

4.细胞融合：

将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按4∶1混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀；1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净；在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；置38℃水浴中预热；用1ml吸管在1分钟左右加预热至37℃的50％PEG(pH＝8.0)1ml，沿管壁边加边轻轻搅拌；用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的完全培养基；20-37℃静置5分钟；分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养；5天后用HAT培养基换出1/2培养基；7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；(第14天后可用普通完全培养基)；经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。抗体检测的方法为Elisa法，以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清，常规操作。

5.克隆培养杂交瘤细胞：

制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含15％血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度；按每毫升加入5×10⁴-1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞(从大于等于10周龄ABLB/c鼠分离获得)；每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10；37℃、7.5％CO₂湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

选择Elisa阳性值高的克隆，细胞活力强底面积覆盖＞1/4放大到24孔板当细胞量大于1/2底面积进行亚克隆化，选取10-15个克隆亚克隆2-3个，亚克隆化后14天选取细胞状态良好的测定Elisa对其阳性值高的再进行扩增选取5-10个亚克隆2-3个；同法在进行亚克隆，共三次，20代。

5.杂交瘤细胞培养

用8％的FBS(德国Biochrom AG公司)培养细胞，37℃、5％CO₂，隔一天换一次液；细胞大而透亮，大小均一为佳。

实施例2：ELISA法筛选杂交瘤细胞

一.主要试剂：

1.包被液：碳酸盐缓冲液pH＝9.6，Na₂CO₃1.59g；NaHCO₃2.93g；加蒸馏水至1000ml。

2.冲洗液和稀释液：PBST pH＝7.4：NaCl 8.0g；KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄.12H₂O2.9g；KCl 0.2g；Tween 0.5ml加蒸馏水至1000ml。

3.封闭液：1％BSA(1g/100ml BSA购至SIGMA公司)

4.显色液：TMB，每ml TMB加入3ul 2mg/ml的抗氧化剂Na₂S2O₃.5H₂O

A液：0.2M Na₂HPO₄(28.4克/L)25.7ml

0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml

H₂O₂0.1％；加蒸馏水50ml。

B液：TMB 3.90g

柠檬酸10.52g

EDTA 1.86g

甘油  2000ml

DMSO 300ml，加热溶解后加蒸馏水至10000ml。

5.终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

二.方法：

1.包板：浓度5-10ug/ml，4℃过夜，甩板洗涤3-6次，拍干；

2.封闭：1％BSA每孔200ul，37℃，1小时；

3.一抗：取每孔培养上清100ul加入酶标板中，37℃2小时，洗板3次，2min/次，拍干。

4.二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG稀释比是1∶3000(中杉金桥公司)，37℃1小时，洗板3次，2min/次，拍干。

5.显色：先加A液50/孔；再加B液50/孔。37℃10分钟(以具体情况定)

6.终止：50ul/孔2M H₂SO₄。

7.波长450nm记录分析。

三.结果

在融合后用ELISA做效价测试：融合后大约11天左右新生的杂交瘤细胞达底面积的1/10-1/4，在培养上清中可以检测到。

其中C号鼠：本底0.000；阴参0.035，0.043；阳参1.136，1.230 ；(10ug/mlLRP16包板)。效价＞1.0的有C3H1 1.169；C2H10 1.075；C1A4 1.067；C1F6 1.027；C1A8 1.136；C2C12 1.148；C2E10 1.135；C3E2 1.017；C3F4 1.042；其中C2H2 0.707

3号鼠：本底0.000；阳参1.573，1.705；31G1 1.009；(10ug/mlLRP16包板)。31H1 1.180；31H6 1.136；31F10 1.004；31D11 1.032；33F1 1.036；33H1 1.244；33H91.202；33E10 1.106；33C12 1.541；

1号鼠：本底0.000；阳参2.052；(10ug/mlLRP16包板)。1D10 1.216；1B11 1.241；1B7 0.819。

A号鼠：本底0.000；阳参1.475；(10ug/mlLRP16包板)。A3C8 1.127；A3H7 1.186；A3E8 1.034；A3H8 1.184；A3H9 1.249。

细胞株的选择需要考虑：上清中抗体的量受多因素的影响、杂交瘤细胞的数量、杂交瘤细胞的分泌抗体的能力、杂交瘤细胞的生长状态、残余脾细胞、上清液的量等等因素。因此细胞株的选择不能单看效价值得高低，要综合各方面因素来选择。本实验选择C3H1、C2H10、C2H2和A3H7四个细胞株，其它细胞株的扩增与冻存。

其中C2H10(即14-2-1 C2H10)于2007年4月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC No.1992，建议的分类命名为：杂交瘤细胞。

实施例3：动物体内表达单克隆抗体

一.材料和来源

1.小鼠：成年BALB/c小鼠，年龄＞15周，(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)

腹腔处理前体重分别是1号30.0g，2号29.1g

用液体石蜡处理后体重分别是31.2g，2号30.6g

2.细胞株：CGMCC No.1992。

3.培养基选择：8％-9％的胎牛血清完全培养基，(德国Biochrom AG公司)

二.方法

1.选择生长状态好的SP2/0细胞进行扩增培养，细胞生长密度不宜过大，最好不超底面积的80％。大约每只小鼠需9-12瓶(25cm培养瓶)细胞，每瓶约含5×10⁶细胞。

2.腹腔处理：小鼠腹腔内注射高压过的液体石蜡每只0.7ml，处理后10天至2个月都可用。

3.注射细胞：收集对数生长期的杂交瘤细胞，离心洗涤1-2次重悬浮生理盐水中，调整好浓度(浓度为1×10⁷-2×10⁷/ml)，每只老鼠腹腔内注射0.8ml。

4.接种后观察：接种后第1-5天，两只小鼠无明显不适，体重略微增加(分别增加0.7g和0.8g)从第6天开始腹部明显膨隆，体重1天之内陡增0.9g和1.1g。之后必须在一周内老鼠体重下降时抽取腹水(3-5ml)，腹水3000rpm 5min室温离心收集细胞注入腹腔已处理好的老鼠体内可以加快产生腹水的时间，约在注射后第3天可见腹部膨隆。

5.腹水的处理：3000rpm室温离心收集细胞，在4℃12000r/min，15分钟除去上层油脂和下层细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存备用，或冻干保存。经测定，小鼠腹水可达到0.6-1mg/ml；效价可达到1∶360万。

6.纯化方法：用注射器抽取10ml protin A装入柱子中，用去离子水流洗3-5个柱床体积洗掉乙醇。先用50ml平衡缓冲液(50m M Tris-Cl，3M NaCl，pH＝8.0)平衡亲和柱，取培养上清，加入同体积平衡缓冲液(二者体积比1∶1)，混合液过柱子蠕动泵转速为10rpm，约0.5ml/min，使单抗充分结合在亲和柱上，用平衡缓冲液流洗5-10个柱床体积，使UV detector回到基线；用2倍柱子装填体积的冲洗液(0.1M甘氨酸pH＝5.0)洗脱，流速为速度0.5ml/min；收集洗脱液，并用中和液(1M Tris-ClpH＝7.5)迅速将洗脱液的pH调至7.4左右。对收集到的各管进行跑胶看其纯度及浓度差异，选择浓度和纯度高的。用超滤管浓缩，10000rpm，4℃，20min。(抗体的保存：加0.1％叠氮纳-80℃长期保存。)

实施例4：体外法获得单克隆抗体

选择经过三次亚克隆化的C2H10，C2H10，A3H7细胞株进行无血清驯化，首先用含9％FBS的完全培养基培养细胞，后依次用含20％、40％、60％、80％、100％的无血清培养基(北京博特纳公司)培养。其中C2H10和A3H7细胞株明显不能耐受无血清驯化过程，分别于含40％、60％的无血清培养基培养后死亡。C2H10细胞株生长活跃，能够耐受此过程，但需每日换液，稳定培养5代后液氮冻存。

二.纯化：

利用蛋白A亲和层析法。用注射器抽取10ml protin A装入柱子中，用去离子水流洗3-5个柱床体积洗掉乙醇。先用50ml平衡缓冲液(50m M Tris-Cl，3M NaCl，pH＝8.0)平衡亲和柱，取培养上清，加入同体积平衡缓冲液(二者体积比1∶1)，混合液过柱子蠕动泵转速为10rpm，约0.5ml/min，使单抗充分结合在亲和柱上，用平衡缓冲液流洗5-10个柱床体积，使UV detector回到基线；用2倍柱子装填体积的冲洗液(0.1M甘氨酸pH＝5.0)洗脱，流速为速度0.5ml/min；收集洗脱液，并用中和液(1M Tris-Cl pH＝7.5)迅速将洗脱液的pH调至7.4左右。对收集到的各管进行跑胶看其纯度及浓度差异，选择浓度和纯度高的。用超滤管浓缩，10000rpm，4℃，20min。(抗体的保存：加0.1％叠氮纳-80℃长期保存。)

实施例6：抗体特性的鉴定

一.杂交瘤细胞的染色体分析

1.方法：

在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。在培养瓶中加入秋水仙素(100ug/ml，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为0.1-0.4ug/ml(若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml)；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min 10分钟，弃上清。加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1ml，混匀，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。取出离心管，1000r/min5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的10％Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。

镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

2.结果：染色体稳定，见图1。

二.单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定

一.材料

1.包被液：碳酸盐缓冲液pH＝9.6，Na₂CO₃1.59g；NaHCO₃2.93g；加蒸馏水至1000ml。

2.冲洗液和稀释液：PBST pH＝7.4：NaCl 8.0g；KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄.12H₂O2.9g；KCl 0.2g；Tween 0.5ml加蒸馏水至1000ml。

3.封闭液：5％FBS(Biochrom AG公司)

4.显色液：TMB，每ml TMB加入3ul 2mg/ml的抗氧化剂Na₂S₂O₃.5H₂O

A液：0.2M Na₂HPO₄(28.4克/L)25.7ml

0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml

H₂O₂ 0.1％；加蒸馏水50ml。

B液：TMB 3.90g

柠檬酸10.52g

EDTA  1.86g

甘油  2000ml

DMSO 300ml，加热溶解后加蒸馏水至10000ml。

5.终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

二.方法：

(一)

1.包板：浓度10ug/ml，4℃过夜，甩板洗涤3-6次，拍干；

2.封闭：5％FBS(Biochrom AG公司)于37℃封闭1小时；

3.一抗：取每孔培养上清100ul加入酶标板中，37℃1小时，洗板3次，2min/次，拍干。

4  抗体亚型：无HRP标记羊抗鼠抗体亚型稀释比1∶1000(SIGMA公司)37℃50分钟，洗板3次，2min/次，拍干。

4.二抗：HRP标记的兔抗羊IgG稀释比是1∶3000(中杉金桥公司)，37℃30分钟，洗板3次，2min/次，拍干。

5.显色：先加A液50/孔；再加B液50/孔。37℃10分钟；

6.终止：50ul/孔2M H₂SO₄。

7.波长450nm记录分析。

1.结果：单克隆抗体为IgG1型抗体，见图2。

(二)抗体特异性检测：

1.方法：采用常规的Western Blot印迹方法(免疫印记法)测定抗体纯度，操作步骤参见(赵亚力，马学斌，韩为东主编的《分子生物学基本实验技术》，一抗为LRP16单抗(腹水纯化后的)，二抗为羊抗鼠IgG/HRP(中杉金桥生物技术有限公司)，ECL试剂盒(普利莱基因技术有限公司)

2.结果：抗LRP-16纯化的单克隆抗体可特异性识别分子量为36kD的LRP-16蛋白参见图3，与LRP16多抗结果比较特异性强，几乎没有非特异反应性带形成。

(三)抗体效价测定：

1.方法：常规ELISA法

2试剂：同ELISA法筛选杂交瘤细胞

2.结果：直接培养的上清可达到1∶20万；小鼠腹水可达到0.6-1mg/ml；效价可达到1∶100万至1∶360万。

上述LRP16单抗适合于western blot与免疫组化研究使用，结果显示该抗体特异性高，背景干净(western blot实验结果如图3示，免疫组化结果如图4示)。