LRP16在子宫内膜样腺癌中的相关性研究及LRP16单克隆抗体的制备及应用

摘要

LRP16基因是1999年从正常成人外周血淋巴细胞中克隆获得的。LRP16基因定位于染色体11q11.2，是一雌激素(E2)反应性基因，它在多种雌激素依赖性肿瘤中高表达。 在既往的研究中发现LRP16过表达不仅能促进乳腺癌MCF-7细胞增殖，而且促进细胞的侵袭生长，并研究中证实LRP16基因通过调节细胞周期蛋白E(cyclin E)以及细胞周期蛋白D1的表达，促进了G1/S期的转换；抑制LRP16可降低MCF-7细胞的侵袭生长能力，其机制涉及E-钙黏着素(E-cadherin)基因的变化。对LRP16分子的活性研究也发现，LRP16是ERα的一个共激活因子，该作用方式不依赖于E2的存在，但E2可增强二者的作用。因此，我们认为，LRP16在ERα阳性乳腺癌的发生与进展中应有重要作用，抗LRP16的治疗可能有利于ERα阳性乳腺癌的好转。 因子宫内膜样腺癌与乳腺癌同属于激素相关性肿瘤，且我们在Ishikawa细胞中的研究也发现LRP16促进细胞的侵袭生长，分子水平的研究也涉及E-Cadherin基因的变化。因此本实验的第一部分通过对子宫内膜样腺癌的临床病例标本进行分析，在蛋白水平上进一步阐明LRP16与肿瘤发生发展及预后的关系。 随着对LRP16基因研究的不断深入，我们越来越发现它在激素相关性肿瘤的发生与进展中有重要的作用，因此制备效价高、特异性强的单克隆抗体是非常必要的。本实验的第二部分就是LRP16单克隆抗体的制备。LRP16McAb有利于对LRP16的组织分布和功能的进一步研究，也为肿瘤疫苗的研制和临床研究创造条件。 第一部分、LRP16在子宫内膜样腺癌中的相关性研究 目的：探讨LRP16在子宫内膜样腺癌(EEC)中的表达及与临床病理的相关性。 方法：用免疫组化法检测76例EEC患者癌组织标本中LRP16和雌激素受体α(ERα)、孕激素、E-Cadherin的表达水平。 结果：LRP16核阳性率为67.11％(51/76)，LRP16浆阳性率为96.05％(73/76)，浆核均阳性占64.47％(49/76)；ERα阳性占51.32％(39/76)，阴性占48.68(37/76)．ERα阴性患者中LRP16核阳性率(86.49％，32/37)明显高于ERα阳性患者(48.71％，19/39)(P＜0.01)，LRP16在胞核中表达与EEC患者的手术病理分期无显著相关性(P＞0.05)，但组织学分级和E-Cadherin的表达呈相关(P＜0.05)。胞浆中分布的LRP16与ERα表达无关(P＞0.05)，但胞浆中的LRP16与EEC的手术病理分期呈明显的负相关(P＜0.01)，与PR的表达呈正相关(P＜0.05)，与组织学分级则无显著相关性(P＞0.05)。在LRP16核浆均阳性的病例中，ERα阴性患者(81.08％，30/37)的比例明显高于ERα阳性患者(48.72％，19/39)(P＜0.01)；且LRP16在核浆中均有表达与EEC患者的手术病理分期及组织学分级无显著相关性(P＞0.05)。在EEC肿瘤细胞中核、浆分布的LRP16着色强度呈负相关(P＜0.05)。 结论：LRPl6在EEC细胞中均有表达，但其亚细胞分布与ERa状态密切相关，LRP16在胞浆中的表达可能提示良好预后。胞核中的LRP16表达与肿瘤的侵袭性相关。胞核、胞浆的亚细胞定位改变可能提示肿瘤的恶性演进。因此，本文认为LRP16基因可能EEC中是一重要的监测因子。 第二部分、LRP16单克隆抗体的制备及应用 目的：研制LRP16单克隆抗体。 方法：采用LRP16抗原免疫小鼠，用免疫的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000融合，以HAT和HT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔和有限稀释法克隆细胞后，接种小鼠腹腔制备腹水抗体，抗体纯化采用以SPA-Sepharose-6BFF为固定相的亲和层析法，Westernblot、免疫组化和间接ELISA法鉴定抗体的特异性、Ig亚型和效价。 结果：获得一株稳定分泌抗LRP16单克隆抗体的杂交瘤细胞，染色体众数为95，其腹水抗体和纯化的抗体效价均为1：3.2×107，属IgGl亚型。 结论：成功获得了LRP16单克隆抗体，命名为14-2-1C2H10，其特异性强，效价高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文索引

声明

第一部分：LRP16在子宫内膜样腺中的相关性研究

第一章前言

1.1子宫内膜癌

1.2LRP16基因研究背景

1.3立题依据

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第三章实验结果

3.1结果判断标准

3.2免疫组化结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

文献综述：子宫内容膜样腺癌的分子生物研究现状

第二部分LRP16单克隆抗体的制备及应用

第一章前言

1.1LRP16基因研究背景介绍

1.2单克隆抗体研究介绍

1.3本论文的立题依据

第二章材料与方法

2.1实验材料和试剂

2.2主要实验仪器

2.3主要液体的配置方法

2.4实验方法

第三章结果与讨论

3.1抗原制备

3.2小鼠免疫

3.3骨髓瘤细胞的准备

3.4融合

3.5杂交瘤细胞株的建立

3.6杂交瘤细胞染色体分析

3.7抗体亚型鉴定

3.8抗体大量制备

3.9抗体纯化

3.10抗原抗体反应性测定

3.11小结

参考文献

文献综述：LRP16基因在乳腺癌与子宫内膜癌的研究现状

在读期间发表的论文、硕士期间参加的主要学术活动

致谢