能够将XMP转化成GMP并保持与GMP降解有关的基因为失活状态的Escherichia菌株及其使用方法

摘要

本发明提供了一种由Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM－10536)衍生的突变菌株，其具有富积的失活deoD、aphA、appA和hprt基因，以及突变菌株的使用方法。

说明书

技术领域

本发明涉及能够将5’-黄嘌呤核苷酸(XMP)转化成5’-鸟嘌呤核苷酸(GMP)并保持与GMP降解有关的基因的失活状态的Escherichia菌株及其使用方法。

背景技术

5’-鸟嘌呤核苷酸(GMP)可由酵母RNA的微生物酶或者化学裂解产生，使用在含有糖、氮源和磷酸盐的培养基中培养的突变菌株直接发酵以便直接产生核酸，或者使用包括核酸媒介的发酵合成和核酸媒介化学或者酶转化成核酸的结合方法生产。近年来，由于其经济上的优点，将发酵或者化学合成和酶转化结合的结合方法在工业上被广泛使用。

通过结合方法生产GMP包括5’-黄嘌呤(XMP)的发酵合成和XMP到GMP的酶转化。此时，两种类型的微生物菌株可被使用。也就是说，XMP生产菌株在发酵系统中被使用，能够诱导编码XMP氨化酶活性的基因连续高水平表达的微生物菌株在酶转化中被使用。在这种情况下，在酶转化中使用的微生物菌株的存活率在后一培养阶段相对于初始培养阶段显著降低，从而降低了GMP的产量。而且，已知guaA基因编码的XMP氨化酶对宿主细胞来说是致命的，因此，XMP氨化酶的连续高水平表达阻碍了后一培养阶段过程中在酶转化中使用的微生物菌株的生长。此外，已知在用于酶转化的微生物菌株中负责GMP降解的内源基因被表达，从而促进了GMP的降解。

考虑到上述问题，本发明开发了含有能够根据细胞生长状态表达XMP氨化酶的XMP氨化酶编码基因和失活内源glnL基因的Escherichiasp.GPD1114(保藏编号No.KCCM-10543)。此外，本发明的发明人开发了来自Escherichia sp.GPD1114的Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)，其中ushA基因编码5’-核苷酸酶被去活化以除去GMP降解的可能性。

但是，由于除编码5’-核苷酸酶的ushA基因以外Escherichiasp.GPD1114仍然含有与GMP降解有关的内源基因，GMP可被降解成鸟苷或者鸟嘌呤。因此，现有技术需要所有与GMP降解有关的基因同时失活的微生物菌株。

发明内容

技术问题

本发明提供了能够将5’-黄嘌呤核苷酸(XMP)转化成5’-鸟嘌呤核苷酸(GMP)并保持与GMP降解有关的内源基因处于失活状态的微生物菌株。

本发明还提供了一种使用微生物菌株在培养基中高浓度富积GMP合成酶的方法。

本发明还提供了一种使用微生物菌株生产GMP、鸟苷-5′-二磷酸(GDP)或者鸟苷-5’三磷酸(GTP)的方法。

技术手段

本发明提供了由Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)衍生的Escherichia属菌株，其包括失活的deoD基因。

亲本菌株Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)是Escherichia coli，(E.coli)菌株，其中glnL基因是失活的，编码5’-黄嘌呤核苷酸(XMP)氨化酶的guaA基因通过转化插入，并且编码5’-核苷酸酶的内源ushA基因是失活的。在Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)中，XMP可通过guaA基因的表达被高水平转化成5’-鸟嘌呤核苷酸(GMP)，并且由于没有ushA基因表达，GMP降解活性很低，从而增加了GMP的产量。

在本文中，deoD基因不受限制，只要其为编码嘌呤-核苷磷酸化酶的基因。例如，deoD基因可以是NCBI保藏号no.NP_418801，但是本发明不限于此。因此，deoD基因意味着包含野生型基因和deoD基因的天然或者人工突变基因。

本发明的Escherichia菌株可以是E.coli DKO-ud(保藏号No.KCCM-10633)。

本发明还提供了由Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)衍生的Escherichia属菌株，其包括失活的deoD和aphA基因。

aphA基因不受限制，只要其为编码酸性磷酸酶的基因。例如，aphA基因可以是NCBI保藏号no.NP_418479，但是本发明不限于此。因此，aphA基因意味着包含野生型基因和aphA基因的天然或者人工突变基因。

本发明的Escherichia菌株可以是E.coli TKO-udh(保藏号No.KCCM-10631)。

本发明还提供了由Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)衍生的Escherichia属菌株，其包括失活的deoD、aphA和appA基因。

appA基因不受限制，只要其为编码酸性(聚)磷酸酶的基因。例如，appA基因可以是NCBI保藏号no.NP_415500，但是本发明不限于此。因此，appA基因意味着包含野生型基因和appA基因的天然或者人工突变基因。

本发明的Escherichia菌株可以是E.coli QKO-udhp(保藏号No.KCCM-10632)。

本发明还提供了由Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)衍生的Escherichia属菌株，其包括失活的deoD、aphA、appA和hprt基因。

hprt基因不受限制，只要其为编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因。例如，hprt基因可以是NCBI保藏号no.NP_414667，但是本发明不限于此。因此，hprt基因意味着包含野生型基因和hprt基因的天然或者人工突变基因。

本发明的Escherichia菌株可以是E.coli QIKO(保藏号No.KCCM-10630)。

在本文中，术语“失活”指的是目标基因不表达，或者即使可能表达，基因也不能产生功能基因产物。“失活”包含目标基因完全失活或者由于其显著较低的表达水平基本上不表达的意思。

在本发明的Escherichia菌株中，失活的基因可通过本领域已知的方法得到，例如位点特异性基因突变或者同源重组，但是本发明不限于此。同源重组是优选的。基因的失活可通过缺失、替代、插入或者其重组来诱导，但本发明不限于此。

通过同源重组产生的基因失活包括通过将外源DNA插入到目标基因DNA片段中构建失活的基因盒，将盒插入微生物菌株中诱导微生物细胞中的内源基因与盒之间的同源重组，并选择含有失活基因的重组菌株。为了方便起见，被克隆到目标DNA中的外源DNA可包含选择标记，例如抗生素抗性基因。具有含抗生素抗性基因的盒的失活目标基因可以很容易在含有生物素的琼脂糖平板上选择。重组的发生可通过核酸杂交、PCR(聚合酶链反应)等来确定。

在制备本发明的Escherichia菌株过程中使用含有抗生素抗性基因的失活盒的情况下，优选在选择完成后将抗生素抗性基因除去。例如，从选定菌株中除去抗生素抗性基因包括使用表达能够识别失活盒的特异性核苷酸序列并去除抗生素抗性基因的质粒转化所选菌株；并从转化体中去除抗生素抗性基因。所产生的不含抗生素抗性基因的转化体可在含有氨苄西林的琼脂糖平板上选择。抗生素抗性基因从目标DNA的去除可通过用牙签将菌落转移到含有适量抗生素的琼脂糖平板上并使菌落在琼脂糖平板上生长来确认。

本发明的Escherichia菌株可使用下列典型方法来制备。

从Escherichia sp.GPU1114(保藏编号No.KCCM-10536)提取基因组DNA，使用基因组DNA作为模板通过PRC扩增deoD、aphA、appA和hprt基因。deoD、aphA、appA和hprt基因被克隆到质粒或者其它载体中以构建重组载体(例如重组质粒pDEO，pAPH，pAPP，pHPRT)。宿主细胞诸如E.coli细胞被重组载体转化。在转化体培养之后，从转化细胞中提取含有deoD、aphA、appA和hprt基因的重组载体。含有抗生素抗性基因片段的loxp被插入到重组载体的deoD、aphA、appA和hprt基因中以构建含有失活deoD、aphA、appA和hprt基因的重组载体(例如pTdeoD：loxpKAT，pTaphA：loxpKAT，pTappA：loxpKAT，pThprt：loxpCAT)。重组载体被插入到宿主细胞并培养。培养后，从转化体中提取重组载体并使用合适的限制性酶消化以获得deoD、aphA、appA和hprt基因失活的盒片段(例如ΔdeoD：loxpKAT，Δaph：loxpKAT，Δapp：loxpKAT，Δhprt：loxpCAT)。首先，通过电转化等将ΔdeoD：loxpKAT插入到产生的GMP菌株GPU1114中，然后转化产生的GMP菌株GPU1114被保持在抗生素选择压力下以允许含有抗生素标记的deoD基因片段和基因组野生型deoD基因之间的重组发生，从而得到甚至在生长继续时也保持deoD基因为失活状态的重组菌株。为了进一步使所选的重组菌株中的aphA基因失活，抗生素标记必须被除去。为了这一点，识别抗生素抗性基因中的loxp位点并除去抗生素抗性基因的重组载体表达基因通过电转化等插入到所选的重组菌株中。产生的转化体的选择使用获得的抗生素抗性在含有氨苄西林的琼脂糖平板上进行。抗生素抗性基因从目标DNA中的去除可通过使用牙签在含有合适抗生素的琼脂糖平板上菌落转移和在琼脂糖平板上菌落生长来确认。产生的转化体被保持在抗生素选择压力下以允许含有部分抗生素标记的deoD基因片段和基因组野生型deoD基因之间的重组发生，从而得到甚至在生长继续时也保持ushA和deoD基因的失活状态的重组菌株(例如E.coli DKO-ud)。当上述过程被顺序应用到aphA、appA和hprt基因时，就可得到具有累计的失活deoD、aphA、appA和hprt基因的转化菌株。

本发明还提供了富积细胞中GMP合成酶的方法，包括培养本发明的Escherichia菌株。

本发明还提供了生产GMP、鸟苷5’-二磷酸(GDP)或者鸟苷5’-三磷酸(GTP)的方法，包括培养本发明的Escherichia菌株。

在本发明的方法中，本发明的Escherichia菌株的培养可在公知的培养条件下进行，例如在含有碳源、氮源、氨基酸、无机化合物等的培养基中培养，同时调节培养基的温度和pH值。

氮源可以是碳水化合物诸如葡萄糖、果糖或者灭菌糖蜜(即被转化成还原糖的糖蜜)，氮源可以是无机氮源诸如氨水、氯化铵和硫酸铵，以及有机氮源诸如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、玉米浸出液、酪蛋白羟化酶、鱼肉及其消化产物、脱脂大豆或者其消化产物。无机化合物可以是磷酸氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。当需要时，培养基可被补充有维生素、碱基等。培养可在有氧条件下进行，例如通过摇动或者有氧搅拌进行，优选在30到40℃下进行。培养基的pH可以被保持为中性。培养可进行1到2天使具有XMP氨化酶活性的产物在培养基中富积。

在本发明中，GMP可通过使用由根据本发明的Escherichia菌株的培养产生的GMP合成酶将XMP转化成GMP来生产。XMP到GMP的转化可通过将增加XMP的细胞膜渗透性的材料(例如二甲苯)添加到培养基中使XMP被引入到GMP生产菌株中来得到。增加XMP的细胞膜渗透性的材料在本领域是公知的，例如疏水材料(例如二甲苯、甲苯、苯、醋酸乙酯)，表面活性剂(例如聚氧乙烯硬脂酰胺)(例如NymeenS-215，Nihon Yushi Co.)阳离子表面活性剂诸如十六烷基三甲基溴化铵、Cation FB或者Cation F2-40E或者阴离子表面活性剂诸如硫酸油酸酰氨钠(sodium oleylamide sulfate)、Newrex TAB和Rapizole 80)，金属离子(例如钙离子、镁离子)，但本发明不限于上述所示的例子。增加XMP细胞膜渗透性的材料的含量可根据材料的类型而变化，并可由本领域技术人员适当调节。例如，二甲苯可以为培养基总重量的0.5到1wt％。另外，GDP或者GTP可通过公知的GMP酶或者化学磷酸化的GMP来生产。GDP或者GTP可通过公知的GMP酶或者化学磷酸化来生产。

附图说明

通过参照附图的典型实施方式的详细描述，本发明的上述和其它特征和优点将更加明显，其中：

图1A是本发明实施例1的重组质粒pDEO的构建方案；

图1B是本发明实施例1的重组质粒pTdeoD：loxpKAT的构建方案；

图2A是本发明实施例2的重组质粒pAPH的构建方案；

图2B是本发明实施例2的重组质粒pTaphA：loxpKAT的构建方案；

图3A是本发明实施例3的重组质粒pAPP的构建方案；

图3B是本发明实施例3的重组质粒pTappA：loxpKAT的构建方案；

图4A是本发明实施例4的重组质粒pHPRT的构建方案；

图4B是本发明实施例4的重组质粒pThprtA：loxpCAT的构建方案。

最佳实施方式

此后，将参照下列例子对本发明进行更具体的描述。下列例子是用于说明的目的而不是用于限制本发明的范围。

实施例

实施例1：使用重组质粒构建重组质粒和失活deoD基因

使用Ecoli GPU1114(保藏号No.KCCM-10536)的基因组DNA作为模板和在SEQ ID NOS：1和2中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增含有deoD基因开放阅读框(ORF)的大约720bpDNA片段。PCR在94℃下30秒钟变性，50℃下30秒钟退火，68℃下1分30秒延伸35个循环。

在PCR产物被0.1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级后，含有720bp DNA片段的带被纯化。DNA片段被结合到pUC 18克隆载体(Promega Co.)的HindII位点中，在16℃下过夜(见图1A)。产生的重组质粒pDEO被转化到E.coli DH5α中，得到的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上37℃下培养过夜。

在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA并使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化以鉴别克隆的deoD基因片段的存在。鉴别的pDEO质粒使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化并且大约720bp的带显示在0.8％琼脂糖凝胶上。同时，质粒pGU6(U.Guldenre等人，A new efficient gene disruption cassettefor repeated use in budding yeast。Nucleic Acid Research 24(13)，1996，pp2519-2524)用限制性内切酶EcoRV和HincII消化以得到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。包含在带中的DNA片段通过平末端连接被结合到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段中以得到重组质粒pTdeoD∷loxpKAT(大约4.5kb) (见图1B)。

在pTdeoD∷loxpKAT重组质粒被转化到E.coli DH5α中之后，得到的转化体被涂布到到含有卡那霉素(每个50mg/L)的固体培养基上37℃下培养过夜。在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林和卡那霉素的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGENmini prep试剂盒(QIAGEN)提取质粒DNA。含有deoD基因的开放阅读框和loxpKAT位点的大约2.3kb DNA质粒DNA作为模板和在SEQ IDNOS：1和2中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增。PCR在94℃下1分钟变性，55℃下1分钟退火，68℃下1分钟延伸35个循环。

将得到的DNA片段ΔdeoD∷loxpKAT电转化到含有外源guaA基因的GPU1114中，得到的转化体被涂布到含有卡那霉素的固体培养基上以选择菌落。

为了从选择菌落的重组菌株中除去抗生素标记，pCP20质粒被转化到所选菌落的重组菌株中，产生的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上并在30℃下培养过夜。在固体培养基上成长的菌落由牙签挑到含有氨卞西林的固体培养基中，含有卡那霉素的固体培养基中以及不含抗生素的固体培养基中并在43℃下培养过夜。仅能在不含抗生素的固体培养基中生长的菌落被收获，菌落被命名为E.coli DKO-ud并于2004年11月30日保藏在Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(保藏号No.KCCM-10633)。

实施例2：使用重组质粒构建重组质粒和失活aphA基因

使用从实施例1中得到的E.coli DKO-ud提取的基因组DNA作为模板和在SEQ ID NOS：3和4中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增含有alphA基因ORFs的大约714bpDNA片段。PCR在94℃下30秒钟变性，55℃下30秒钟退火，68℃下1分30秒延伸35个循环。

在PCR产物被0.1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级后，含有714bp DNA片段的带被纯化。DNA片段被结合到pGEN-T-easy的克隆载体(PromegaCo.)中16℃下过夜(见图2A)。产生的重组质粒pAPH被转化到E.coli DH5α中，得到的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上37℃下培养过夜。

在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA并使用限制性内切酶ClaI消化以鉴别克隆的aphA基因片段的存在。鉴别的pAPH质粒使用限制性内切酶ClaI消化并且大约3.7kb的带显示在0.8％琼脂糖凝胶上。包含在带中的DNA片段通过平末端连接与T4聚合酶连接。同时，质粒pUG6用限制性内切酶EcoRV和HincII消化以得到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。平末端连接的DNA片段被结合到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段中以得到重组质粒pTaphA∷loxpKAT(大约5.4kb)(见图2B)。

在pTaphA∷loxpKAT重组质粒被转化到E.coli DH5α中之后，得到转化体被涂布到到含有氨苄西林和卡那霉素(每个50mg/L)的固体培养基上，并在37℃下培养过夜。在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林和卡那霉素的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)提取质粒DNA。利用质粒DNA作为模板和在SEQ ID NOS：3和4中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增含有aphA基因的开放阅读框和loxpKAT位点的大约2.4kbDNA片段。PCR在94℃下1分钟变性，55℃下1分钟退火，68℃下1分钟延伸35个循环。

将得到的DNA片段ΔaphA∷loxpKAT电转化到在实施例1中得到的E.coli DKO-ud中，得到的转化体被涂布到含有卡那霉素的固体培养基上以选择菌落。

为了从选择菌落的重组菌株中除去抗生素标记，pCP20质粒被转化到所选菌落的重组菌株中，产生的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上并在30℃下培养过夜。在固体培养基上成长的菌落由牙签挑到含有氨卞西林的固体培养基中、含有卡那霉素的固体培养基中以及不含抗生素的固体培养基中并在43℃下培养过夜，得到仅能在不含抗生素的固体培养基中生长的菌落，菌落被命名为E.coli TKO-udh并于2004年11月30日保藏在KCCM (保藏号No.KCCM-10631)。

实施例3：使用重组质粒构建重组质粒和失活appA基因

使用从例1中得到的E.coli DKO-ud中提取的基因组DNA作为模板和在SEQ ID NOS：5和6中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增含有appA基因ORF的大约1.3kb DNA片段。PCR在94℃下30秒钟变性，55℃下30秒钟退火，68℃下1分30秒延伸35个循环。

在PCR产物被0.1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级后，含有1.3kb DNA片段的带被纯化。DNA片段被结合到pGEM-T-easy的克隆载体中16℃下过夜(见图3A)。产生的重组质粒pAPP被转化到E.coli DH5 α中，得到的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上，并在37℃下培养过夜。

在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA并使用限制性内切酶ClaI消化以鉴别克隆的aphD基因片段的存在。鉴别的pAPP质粒使用限制性内切酶BlcI消化并且大约4.3kb的带显示在0.8％琼脂糖凝胶上。包含在带中的DNA片段通过平末端连接与T4聚合酶连接。同时，质粒pUG6用限制性内切酶EcoRV和HincII消化以得到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。平末端连接的DNA被结合到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段中以得到重组质粒pTappA∷loxpKAT(大约6.3kb)(见图3B)。

在pTappA∷loxpKAT重组质粒被转化到E.coli DH5α中之后，得到转化体被涂布到到含有氨苄西林和卡那霉素(每个50mg/L)的固体培养基上，并在37℃下培养过夜。在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林和卡那霉素的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)提取质粒DNA。含有appA基因的开放阅读框和loxpKAT位点的大约3.1kb DNA片段利用质粒DNA作为模板和在SEQ ID NOS：5和6中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增。PCR在94℃下1分钟变性，55℃下1分钟退火，68℃下1分钟延伸35个循环。

将得到的DNA片段ΔappA∷loxpKAT电转化到在例2中得到的E.coliDKO-udh中，得到的转化体被涂布到含有卡那霉素的固体培养基上以选择菌落。

为了从选择菌落的重组菌株中除去抗生素标记，pCP20质粒被转化到所选菌落的重组菌株中，产生的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上并在30℃下培养过夜。在固体培养基上成长的菌落由牙签挑到含有氨卞西林的固体培养基中、含有卡那霉素的固体培养基中以及不含抗生素的固体培养基中并在43℃下培养过夜，得到仅能在不含抗生素的固体培养基中生长的菌落，菌落被命名为E.coli QKO-udhp并于2004年11月30日保藏在KCCM(保藏号No.KCCM-10632)。

实施例4：使用重组质粒构建重组质粒和失活hprt基因

使用从例3中得到的E.coli QKO-udhp中提取的基因组DNA作为模板和在SEQ ID NOS：7和8中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增含有hprt基因ORF的大约1.7kb DNA片段。PCR在94℃下30秒钟变性，69℃下30秒钟退火，72℃下1分30秒延伸35个循环。

在PCR产物被0.1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级后，含有500bpDNA片段的带被纯化。DNA片段被结合到pETBlue-1克隆载体(NovagenCo.)中16℃下过夜(见图4A)。产生的重组质粒pHPRT被转化到E.coli DH5α中，得到的转化体被涂布到含有氨苄西林(50mg/L)的固体培养基上，并在37℃下培养过夜。

在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林的液体培养基上并培养过夜。然后，质粒DNA使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)分离并使用限制性内切酶HindII消化以鉴别克隆的hprt基因片段的存在。鉴别的pHPRT质粒使用限制性内切酶HindII消化并且大约4.0kb的带显示在0.7％琼脂糖凝胶上。包含在带中的DNA片段通过平末端连接与T4聚合酶连接。同时，质粒pUG6用限制性内切酶EcoRV和HincII消化以得到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。平末端连接的DNA被结合到含有loxp位点的卡那霉素抗性基因片段中以得到重组质粒pThprt∷loxpCAT(大约5.3kb)  (见图4B)。

在pThprt∷loxpCAT重组质粒被转化到E.coli DH5α中之后，得到转化体被涂布到到含有氨苄西林和卡那霉素(每个50mg/L)的固体培养基上，并在37℃下培养过夜。在固体培养基上生长的菌落通过环形转移针接种到3mL含氨苄西林和卡那霉素的液体培养基上并培养过夜。然后，使用QIAGEN mini prep试剂盒(QIAGEN)提取质粒DNA。含有hprt基因的开放阅读框和loxpKAT位点的大约2.1kb DNA质粒DNA作为模板和在SEQ ID NOS：7和8中阐明的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增。PCR在94℃下1分钟变性，60℃下1分钟退火，72℃下1分钟延伸35个循环。将得到的DNA片段Δhprt∷loxpCAT电转化到在实施例3中得到的E.coli QKO-udhp中，得到的转化体被涂布到含有氯霉素的固体培养基上以选择菌落。菌落被命名为QIKO并于2004年11月30日保藏在KCCM(保藏号No.KCCM-10630)。

实施例5：例4中的E.coli OIKO的GMP产量

在实施例4中涂布到含有氯霉素的固体培养基上之后选择的E.coliQIKO菌落中，30个菌落在含有具有下面表1中的培养基成分的GMP生产培养基的锥形瓶中培养，并评估GMP的产量。首先，30个单菌落在含有GMP生产固体培养基的培养箱中在32℃下培养过夜。然后，用接种环将每个单菌落接种在50mlGMP生产培养基上并在37℃下在250rpm摇瓶中培养7小时。然后，给细胞培养物补充2％二甲苯以增加细胞培养物中酶、底物以及产物的细胞膜透性。产生的培养物被加入到酶反应溶液中并在42℃下，在250rpm摇瓶中培养15分钟。GMP的浓度通过HPLC(高效液相色谱)测定并且结果显示于下面的表2中。

表1：用于GMP生产的培养基成分

成分浓度(g/L)细菌蛋白胨16NaCl5酵母提取物10PH7.0

表2：重组菌株的烧瓶检测结果

菌株GPU1114DKO-udTKO-udhQKO-udhpQIKOGMP(U/mL)4646464749

如表2所示，亲本菌株GPU1114产生46U/mL的GMP，而其中核酸降解性被失活的重组菌株QIKO产生49U/mL的GMP。从上述结果可以看出，本发明的重组菌株QIKO表现了高于亲本菌株6％的GMP产量。

实施例6：在锥形瓶中的重组菌株的GMP副产物(鸟嘌吟和鸟苷)的比较

在实施例4中涂布到含有氯霉素的固体培养基上之后选择的E.coliQIKO菌落在含有具有上述表1中的培养基成分的GMP生产培养基的锥形瓶中培养。培养物被加入到具有下表3的成分的GMP副产物的反应溶液中并评估副产物。

首先，E.coli QIKO单菌落在含有GMP生产固体培养基的培养箱中32℃培养过夜。然后，用接种环将每个单菌落接种在50mlGMP生产培养基上并在37℃下250rpm摇瓶中培养7小时。然后，细胞培养物被补充2％二甲苯以增加细胞培养物中酶、底物以及产物的细胞膜透性，并在37℃下250rpm摇瓶中培养20分钟。产生的培养物与具有表3中的成分的用于GMP副产物的反应溶液混合，并在42℃下250rpm摇瓶中培养8小时。两种类型的副产品鸟嘌呤和鸟苷相对于时间由HPLC测定，结果显示于下面的表4中。

表3：GMP副产品的反应溶液成分

成分浓度(g/L)800mM tris-马来酸盐24.20MgSO₄4.92(NH4)₂SO₄6.60XMP15.65GMP11.54pH7.0

表4：重组菌株的副产品检测结果

菌株GPU1114DKO-udTKO-udhQKO-udhpQIKOGMP降解(mmol)2.542.112.001.701.37GMP降解(％)10083776753

如表4所示，亲本菌株GPU1114的降解GMP的浓度为2.54mmol，而其中核酸降解性被失活的重组菌株QIKO的降解GMP的浓度为1.37mmol。也就是说，本发明的重组菌株QIKO的GMP降解相对于亲本菌株GMP的降解减少了大约47％。

如上所述，本发明的GMP产生菌株表现了XMP到GMP的高转化效率和低的GMP降解活性。

根据本发明的在细胞中富积GMP合成酶的方法，GMP合成酶可在细胞中被高浓度富积。

根据本发明的生产GMP、GDP或者GTP的方法，GMP、GDP或者GTP可以被高效生产。

序列表

<110>CJ株式会社

<120>能够将XMP转化成GMP并保持与GMP降解有关的基因为失活状态的Escherichia菌株及其使用方法(Escherichia strain capable of converting XMPto GMP and maintaining the inactivated state of gene(s)associated with GMP degradation and methods ofusing the same)

<130>FP07KR359

<150>KR10-2005-0005863

<151>2005-01-21

<150>PCT/KR2006/000221

<151>2006-01-20

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>1

atggctaccc cacacattaa t    21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>2

ctttatcgcc cagcagaacg g    21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>3

tcaacatact gactatttag g    21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>4

ctctgtcagt attctgaatt g    21

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>5

cggcgcatta gcatcgca    18

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>6

ttcaggtaac tgaatgctct t    21

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>7

atggttagag atatgaaa    18

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>8

ttactcgtcc agcagaatca c    21

PCT/RO/134表

中请人或代理人的中请卷号国际中请号

有关保藏微生物和/或其他生物材料说明

(PCT细则第13条)

A.在说明书段落号：21中记载了有关保藏微生物和/或其他生物材料说明。B.保藏证明    此外保藏证明在附加页上□保藏机构名称KCCM(韩国微生物保存中心)保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国首尔市西大门区弘济1洞361-221Yurim大厦保藏日期2004年11月30日保藏编号KCCM-10630C.补充说明(不需要此栏可不填)    此信息续在附加页上□D.说明适用的指定国(如果说明不适用于所有的指定国)E.单独提交的说明(不需要此栏可不填)以下证明将提交国际局(指明说明的一般类别如“保藏编号”)

表PCT/RO/134(1998.7)

申请人或代理人的申请卷号国际申请号

有关保藏微生物和/或其他生物材料说明

(PCT细则第13条)

A.在说明书段落号：15中记载了有关保藏微生物和/或其他生物材料说明。B.保藏证明    此外保藏证明在附加页上□保藏机构名称KCCM(韩国微生物保存中心)保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国首尔市西大门区弘济1洞361-221Yurim大厦保藏日期2004年11月30日保藏编号KCCM-10631C.补充说明(不需要此栏可不填)    此信息续在附加页上□D.说明适用的指定国(如果说明不适用于所有的指定国)E.单独提交的说明(不需要此栏可不填)以下证明将提交国际局(指明说明的一般类别如“保藏编号”)

表PCT/RO/134(1998.7)

申请人或代理人的申请卷号国际申请号

有关保藏微生物和/或其他生物材料说明

(PCT细则第13条)

A.在说明书段落号：18中记载了有关保藏微生物和/或其他生物材料说明。B.保藏证明    此外保藏证明在附加页上□保藏机构名称KCCM(韩国微生物保存中心)保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国首尔市西大门区弘济1洞361-221Yurim大厦保藏日期2004年11月30日保藏编号KCCM-10632C.补充说明(不需要此栏可不填)    此信息续在附加页上□D.说明适用的指定国(如果说明不适用于所有的指定国)E.单独提交的说明(不需要此栏可不填)以下证明将提交国际局(指明说明的一般类别如“保藏编号”)

表PCT/RO/134(1998.7)

申请人或代理人的申请卷号国际申请号

有关保藏微生物和/或其他生物材料说明

(PCT细则第13条)

A.在说明书段落号：12中记载了有关保藏微生物和/或其他生物材料说明。B.保藏证明    此外保藏证明在附加页上□保藏机构名称KCCM(韩国微生物保存中心)保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国首尔市西大门区弘济1洞361-221Yurim大厦保藏日期2004年11月30日保藏编号KCCM-10633C.补充说明(不需要此栏可不填)    此信息续在附加页上□D.说明适用的指定国(如果说明不适用于所有的指定国)E.单独提交的说明(不需要此栏可不填)以下证明将提交国际局(指明说明的一般类别如“保藏编号”)

表PCT/RO/134(1998.7)