分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法及装置

摘要

分枝杆菌快速培养药敏及鉴定的微量检测法，①标本处理后，接种于培养基，经过培养，在生物安全橱内将生长出的抗酸分枝杆菌取出，并制成规定浓度的菌悬液；②在生物安全橱内，将设有的专用微量培养板上盖打开，板内各孔预先加好培养基和相应药物，向各孔内加入0.1ml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，并将盖和底间封好；③将各个板放入密封湿盒内，置于37±2℃恒温培养箱内培养；④每天或隔天取出培养板，放置在活体细菌直视放大系统上观察；从专用培养板各孔底部的观察窗，通过光学放大系统，采集细菌生长图象，并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。在加样后通过自然沉降，使细菌集中于孔底观察窗口，在底部成像，连续观察细菌增殖状况。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对微生物的培养和医学检验的方法及专用装置。尤其是分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法及装置。

背景技术

第四次全国结核病流行病学抽样调查，对59个点进行全人口感染率调查结果：实验人口为365,097人，活动性肺结核患病率367/10万、菌阳肺结核患病率为160/10万，全国的结核病疫情仍很严重。在卫生部公布的27种重点传染病中，结核的发病数居第二位，死亡数居第三位，均排在SARS之前。

结核病的实验室检查是结核病的临床诊断和流行病调查的主要手段，其中细菌学检查是结核病诊断的金标准。当前结核病治疗仍然以抗结核药物化学疗法为主，但是目前对一种或多种抗结核药物同时耐药的菌株(多耐药菌)明显增多，还有一些依赖菌(即对某药有依赖性，该药存在时甚至生长更好)，因此及早检出哪些药物是敏感，哪些耐药以指导治疗十常重要。

结核的病原体是抗酸分枝杆菌。大多数分枝杆菌，特别是迟缓生长分枝杆菌菌群，例如结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌等，生长十分缓慢。目前分枝杆菌培养药敏试验仍多采用传统方法(以下简称《规程》法)，即绝对浓度法和比例法(全国临床检验操作规程第三版2006 916～917)。在传统改良罗(L-J)氏固体培养基上，要经4～8周培养才能生长出菌落，再经4周才能获得药敏结果，不能满足临床化疗的需要。因此抗酸杆菌培养药敏检查的发展，主要集中于快速试验的研究。

近年来国内外学者都努力寻找快速的培养和药物敏感试验方法。BACTEC 460^TB快速分支杆菌自动检测装置，可将传统培养时间提早10天以上，药敏时间平均7天(林健雄，郑崇辉BACTEC460-TB自动快速检测结核菌的临床应用及评价国际医药卫生导报2001V N994)，但此法由于使用¹⁴C同位素棕榈酸作基质，放射性物质造成环境污染，在使用多年后，现在已被许多发达国家和我国禁用。

近20年来国内外着重对非放射性方法进行了研究，发表了许多这方面方法文章：

(1)生物发光法：ATP是细菌能量代谢的指标，生物半衰期短，当细菌生长抑制或死亡后，胞内ATP含量即明显下降，因而可作为活菌的标志。结核分支杆菌培养一段时间后，抽提菌内ATP，然后加入生物发光试剂，通过光度计进行定量检测。可在5-7天内获得结果，但同时存在无法区分致病菌和非致病菌，ATP抽提烦琐等缺点，培养后取菌样抽提过程易造成污染，需进一步完善才能用于临床。

(2)噬菌体生物发光检测方法：采用生物发光技术检测可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体phage40，对不同细菌的发光反应和药敏试验进行测定。在含抗结核药物的培养基中，耐药结核菌的发光强度比非耐药结核菌强，其强度差异有显著性意义。phage40的药敏试验结果与常规罗氏培养基法符合率一致，可在72h内得到结果。(吕斌，徐顺清，陈志飞用重组噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性  中华检验医学杂志2000V23N3 144-147)

(3)流式细胞仪法：乙酰乙酸荧光素是一种非极性荧光物质，能够通过主动转运和被动扩散的方式透过分支杆菌的细胞壁和细胞膜。活的分支杆菌胞质中非特异性脂酶能迅速水解外来的FDA为游离的荧光素，而死菌因活性脂酶大量减少，水解FDA的作用弱，游离荧光素产生很少。流式细胞仪可以检测带荧光的分支杆菌，用于结核分支杆菌的活菌诊断，24h得出药敏试验结果(Norden Ma，Kurzynsik TA，Bownds SE，etal.Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis(流式细胞仪快速检测带荧光的分支杆菌H37Ra)by Flow Cytometry[J].J.ClinMicrobiol，1995，33(5)：1231-1237.)。由于FDA也可以进入其他细菌而被菌内脂酶水解而发荧光，影响检测结果的特异性。乙酰乙酸荧光素可以自然水解，导致假阳性。培养样品导入流式细胞仪过程为开放操作，易于造成污染。加之流式细胞仪设备昂贵，技术要求高，因而很难在临床推广。

(4)耐药基因的测定：目前PCR、探针杂交、DNA测序等分子生物学方法已用于分枝杆菌的直接检测，极大缩短了诊断时间。DNA测序是基因突变检测的金标准，能够确定突变的部位和性质。但对每一株菌株来说，要测定各种抗结核药物所有已知的突变部位需多次反应，费用十分昂贵，因此无法用于临床。DNA芯片检测原理是将多种探针固定在基片上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，获取信息。由于该法同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对样品大量序列进行检测和分析。理论上十分诱人，但尚无可适用于临床检查的DNA芯片供应。基因检测方面，必须指出的是并不是每一种药物的耐药基因只有一种或仅与一种突变、耐药机制有关，尽管几种常用的抗结核药物都找到了至少一个与耐药相关的基因，但目前成功应用于临床药敏试验的只有与利福平耐药相关的ropB基因的检测，其与传统的药敏试验结果符合率在80％以上，且95％以上的耐利福平菌株同时对其它抗结核药物耐药，因而可作为MDR-TB的初筛试验(程绍基，严碧涯，马屿PCR-冷SSCP快速检测结核菌rpoB基因突变结核病与胸部肿瘤1996V N3 117-121)。

综上所述，各种新的方法均比传统的方法快速，但也存在许多不足之处，因此还。不管那一种方法，只有朝着快速、准确、灵敏、防污、特异和经济的方向发展和完善，才有望取代传统的方法在临床推广应用。

目前在国内临床使用较多的快速方法有以下几种：

(1)Becton Dickinson公司BACTEC MGIT960仪：在国内外已经应用，BACTEC-TB960利用对氧敏感的荧光钌复合物作为荧光探头，检测培养基中氧的含量。当细菌生长良好时，培养基中氧含量下降，即可激发荧光，荧光增强表示细菌生长或耐药(王巍，李洪敏，王安生BAC TEC-M GIT960快速培养药敏对肺结核诊治的应用和评价中国防痨杂志  2003年12月第25卷第6期·379·)。但其仪器和专用培养管价格昂贵(仪器在百万元左右，每个试验药管在70元左右)，试剂必须依赖进口，在国内特别在基层难于普及。另外提供的抗结核菌药物仅4～5种。

(2)阿克苏公司的BacT ALERT 3D培养系统：BacT ALERT 3D仪是利用颜色感应器来监测分支杆菌生长过程中释放的CO2，随着CO2浓度的升高，培养基中H⁺浓度也直接升高，从而使感应器的颜色由墨绿色变为金黄色(Thorpe TC，Wilson ML，Turner JE，et al.Bact/Alert：an automated colorimetric microbial detection system J.Clin Microbiol，1990，28(7)：1608-1612；廖传玉蒋克珉高万痰分支杆菌快速培养和药敏试验的评价临床肺科杂志2005年1月第10卷第1期115)。

(3)DIFCO公司的ESP系统：是利用压力感应器，检测密封培养瓶中，在培养过程细菌生长代谢产生CO₂、H₂、N₂和消耗O₂引起培养瓶内气体压力的改变。目前，国外由Ddifco公司研制的ESP全自动快速培养系统II，可以快速进行结核分枝杆菌培养和药敏试验。它们均可在7-12天获得药敏结果，但需进口的特殊仪器设备，且所用试剂完全依赖进口，价格昂贵，难于在基础推广。

(4)噬菌体裂解法：分支杆菌噬菌体只能够感染相应的活的分枝杆菌，并在菌体内繁殖，使指示菌菌体裂解，出现噬菌斑。通过观察噬菌斑的有无，可判断细菌的耐药性。该法与其它方法比较有如下优点：快速，平均48h获得药敏结果；准确，与传统方法比较一致性达90％；简单，无需特殊仪器设备(胡忠义，庞茂银，靳安佳等.应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌，中华结核和呼吸杂志，2001，24：611-613；McMerney R，TB：the return of the phage，A review of fifty years of mycobaterphageresearch，Int J Tuberc Lucg Dis，1999，3：179-184；黄海荣，马屿，噬菌体在结核分支杆菌研究中的应用，中华结核和呼吸杂志.2002，25(8)：797-799)。但分支杆菌噬菌体感染分支杆菌具有特异性，仅能用于结核分支杆菌，对其它结核或非结核抗酸分枝杆菌不敏感，使用这种方法检测不能检出。另外鉴定药物很有限，对多数抑菌药物无法检出，目前仅有利福平可以应用，而且价格昂贵，每一试验的试剂价为70元，即便将来扩大了药敏种类，如果做10种常用药，光试剂成本就要700元，因此这种方法目前缺乏实用价值。以上方法有的速度不够快如3D法，药敏时间平均要12天。有的速度虽然快如噬菌体法，但因能做的药太少不能进入临床实用阶段。所有这些方法都非常昂贵，为国内大多数人不能承担，特别是结核病高发的西部贫困地区，因此无法在基层推广。因此建立一个快速、简便、高效、防污又经济的药敏试验方法非常必要。

发明内容

发明目的：本发明目的是提出分枝杆菌快速培养药敏及鉴定超千倍放大连续微量检测法及装置；尤其由电脑控制、无级超千倍放大、连续微量培养直视观察和即时图象采集报告组成的分枝杆菌超快速培养药敏及鉴定系统。快速检测从结核病人分离培养出的抗酸分枝杆菌，对各种抗菌药物的敏感性，为临床治疗提供依据。建立一种快速、简单、直观、经济、安全防污和更接近人体内环境状态的培养药敏方法。

技术方案：分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法：

①标本处理后，接种于培养基，经过培养，在生物安全橱内将生长出的抗酸分枝杆菌取出，并制成规定浓度的菌悬液；

②在生物安全橱内，将设有的专用微量培养板上盖打开，板内各孔预先加好培养基和相应药物，另有阳性对照孔(含有培养基无药)和阴性对照孔(无培养基无药)，向各孔内加入0.1ml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，并将盖和底问封好；以上均根据培养规程进行；

③将各个板放入密封湿盒内，置于37±2℃恒温培养箱内培养；

④每天或隔天取出培养板，放置在活体细菌直视放大系统上观察；从专用培养板各孔底部的观察窗，在底部成像，连续观察细菌增殖状况。通过光学放大系统，采集细菌生长图象，并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。

本发明的专用观察装置是：微量培养板的培养孔为圆柱锥型台体，孔底直径仅有1±0.3mm，具有镜面平整和载玻片样透光性，作为采集图象的观察窗口。在加样后通过自然沉降，使细菌集中于孔底观察窗口，可提高细菌增殖时观察效率。板盖对应每一孔上方，有一突出的密封圈，盖合后嵌入孔口内，有效的防止孔内液外溢。

图象采集放大检测：通过光学显微镜或和光学放大CCD图象采集系统一道构成，通过镜头将图像进行显微放大，经CCD图象采集系统放大可直接从监视器观察，例如可直接从微量培养板底部连续观察细菌增殖状态，放大倍数可进行无级调节。清晰可见。由于设计的观察方向可以从培养板底部进行，因此可以在活体培养条件下连续观察细菌的增殖过程。

本发明的有益效果：快速：通过连续超千倍放大系统可将培养中的细菌放大1900～4000倍，可以在培养过程早期，观察到单个细菌的增殖和微小菌簇的增殖形态，因此可以早期判断药物作用的结果。而经典的方法是要在细菌经过大量繁殖，长出肉眼可见的菌落，才能判断结果，故《规程》规定要4周才报告结果。此外，通过培养基的改进(使用改良7H9培养基内加入适当量的药物)，使其更适合抗酸分枝杆菌的生长，与其他培养基相比，加快生长速度，因此可以提前获得药敏结果(施旭东，刘正华，吴晓渊等.结核分枝杆菌培养和药敏试验及菌群鉴定快速法方法的研究.中华检验医学杂志2005 28(8)790-792)。

本法对80例的临床菌株测定，药敏测定时间平均5.2天，71.3％在5天内，90.3％在7天内获得结果。比目前任何一种培养药敏方法都快(如3D法药敏时间平均要12天；BACTEC-MGIT960快速培养药敏时间平均要6.5天)。

简单：在微量培养板各个微量培养孔内，预先已加入配置好的含一定药量的培养基(可以作成冻干试剂使商品化)，直接加入从初培养来的菌悬液，置于37℃恒温培养箱，隔天或每天置活体细菌直视连续超千倍放大系统上观察，根据监视器显示的细菌生长的数量和微小菌簇的形态，与阳性对照孔比较判定结果，通过电脑采集图象储存记录，结果可打印图文报告。方法简单，凡具有一定经验的临床检验人员，经过一周培训即可学会操作。而进口的大型仪器结构复杂，需要较高的技术和外文水平。

直观：通过活体细菌直视连续超千倍放大系统，可以直接观察到细菌在药物作用下的生长状态，观察是在密闭生活状态下，可以根据细菌个体的数量和微小菌簇的形态来判断，该菌株对该药是敏感、耐药或依赖(即该菌株在该药存在下生长更好)，并可以根据形态判断是否有霉菌或一些杂菌污染。《规程》方法虽然也属于直视观察法，但它是用肉眼观察菌落，无法看到每一个细菌，因此需要的时间长，而且不能看到细菌在生长过程中的微细变化；而其他方法(如BACTEC MGIT960仪、ESP系统、BacT ALERT3D仪等)，都是间接的以测定生物的生命现象为指标(如氧的消耗、产生气体的压力改变和二氧化碳产生等)，并不一定与抗酸分枝杆菌生长完全相关，常出现假阳性。

经济：使用的活体细菌直视连续超千倍放大系统和专用微量培养板是完全用国产原材料构建和制造的，成本很低，专用微量培养板每块五元(含40个检测孔板)。微量板使用的培养基很少，每个检测孔板(test)仅0.1ml，(仅为常法的1/25～1/40)。因此本法每test的成本价仅一元，因此节约了大量试剂成本。

安全防污：将已装好培养基和相应药物的培育板置于生物安全橱内，打开上盖加入菌悬液后将盖盖上，用透明胶带密封后置于37℃培养箱培养，在以后观测检查时不再开盖，一直到结果报告后整体培养板高压消毒或微波消毒。而有些快速法(如噬菌体法和流式细胞仪法)，需要反复开盖、取出、转管和开放测定，增加了污染风险。

更接近人体内环境：使用液体培养基，使细菌在液体内部生长，与《规程》使用的固体培养基，细菌在培养基的表面直接与空气接触的环境下生长相比，更接近于人体内环境。因为结核菌是寄生于细胞内，所以在液体内培养的结果更接近临床状态。

特别适合抗菌药物的MIC和混合药敏试验：无论是MIC或混合药敏试验，其对每一种药物都需要多个不同浓度的管或多个不同药物和浓度搭配的管，不论成本上还是在操作上，在其他快速法都不可能在临床检验中实施。本法由于使用多孔微量培养板，培养基用量很少，很容易进行倍比稀释和药物搭配混合，成本低操作简便，因此可以实现临床意义上是MIC或混合药敏试验。

附图说明

图1是阴性对照显示图像

图2是阳性对照显示图像

图3是异烟肼敏感显示图像

图4是利福平耐药显示图像

图3是乙胺丁醇耐药显示图像

图4是左旋氧氟沙星敏感显示图像

图5是链霉素耐药显示图像

图8是丁胺卡那敏感显示图像

图9是本发明培养活体细胞(细菌)和直视放大观察检测流程图

图10是细菌微量培养板(或称微量培养板)的单元结构示意图，

具体实施方式

①病人的标本(痰、胸腹水、脑脊液、尿、便或灌洗液等)按卫生部《规程》规定方法处理后，接种于培养基，经过培养(L-J法或其他快速法)，在生物安全橱内将生长出的抗酸分枝杆菌取出，并制成规定浓度的菌悬液。

②在生物安全橱内，将专用微量培养板上盖打开，板内各孔已经预先加好培养基和相应药物，另有阳性对照孔(含有培养基无药)和阴性对照孔(无培养基无药)，向各孔内加入0.1ml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，用透明胶带将盖和底间封好。

③将各个板放入密封湿盒内，置于37℃恒温培养箱内培养。

④每天或隔天取出培养板(不要打开盖)，放置在活体细菌直视连续超千倍放大系统上观察。从专用培养板各孔底部的观察窗，通过超千倍放大系统，采集细菌生长图象，并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。

材料与设备：

(1)改良米氏(Middleblook)7H-9液体培养基。

(2)专用微量培养板：每孔容积3.5ml，具有样品浓集光学孔底和密闭盖。该板无菌处理后，预先在各个孔内分别加入含有各种不同抗菌药物的培养基。

(3)培养中活体细菌连续直视超千倍放大系统。该系统可将培养中的细菌放大1000～4000倍(放大倍数无级可调)显示在监视器上，结果由计算机控制采集图象储存并可打印图文报告。

(4)生物安全柜(一级或二级)，无菌吸液头，无菌滴管，无菌蒸馏水，细菌浓度标准比浊管等。

(5)菌种来源：

分枝杆菌临床菌株：来自门诊及住院病人标本，按《规程》经过前处理后，接种培养分离后获得。

具体培养方法：

(1)在生物安全柜内，将临床标本分离菌株，从培养基上取出、经研磨加无菌蒸馏水稀释，制成适当浓度菌悬液，每孔0.1ml。

(2)将专用微量培养板上盖打开，板内各孔已经预先加好培养基和相应药物，另有阳性对照孔(含有培养基无药)和阴性对照孔(无培养基无药)，向各孔内加入0.1ml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，用透明胶带将盖和底间封好。

(3)将各个板放入密封湿盒内，置于37℃恒温培养箱内培养。

(4)结果观察：每间隔24h或48h，将专用培养板从37℃恒温培养取出，在细菌连续直视超千倍放大系统下观察一次，从专用培养板各孔底部，通过超千倍放大系统，采集细菌生长图象，并与阴、阳对照孔图象比较，与阳性对照孔生长数量和微小菌簇形态相似判为耐药，反之为敏感。并将采集记录观察结果，制成图文报告。

细菌微量培养板：

微量培养板具有圆柱锥形微量培养孔，孔底直径仅有1mm，具有镜面平整和载玻片样透光性，作为采集图象的观察窗口。板盖对应每一孔上方，有一突出的密封圈，盖合后嵌入孔口内，有效的防止孔内液外溢。见图10微量培养板具要圆柱锥形微量培养孔，培养板的培养孔为圆柱锥型台体，在加样后通过自然沉降，使细菌集中于孔底观察窗口，可提高细菌增殖时观察效率。微量培养板1的培养孔为圆柱加一锥型台体2，孔底即锥型台底是纯平面3。图10只是微量培养板的一个单元，一般是一块板上排列有多排多列，微量培养板的板盖上4设有一突出的密封圈5。

直观放大检测仪(可以光学放大在7百倍以上即能观测)可做到无级超千倍放大，由置于微量培养孔上部的光源和光学放大CCD图象采集系统构成，通过微量培养板下部物镜成像光路经放大后可直接从微量培养板底部连续观察细菌增殖状态，放大倍数可无级调节。使非染色的活体标本呈立体图象，清晰可见。由于设计的观察方向是从培养板底部进行，因此可以在活体培养条件下连续观察细菌的增殖过程。