一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法

摘要

本发明提出了一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。构建RNA干扰载体步骤为：1)插入致死基因ccdB表达单元，改造RNA干扰骨架载体；2)设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物；3)反向PCR、转化及筛选重组质粒，得到针对目的基因特异性的RNA干扰载体。构建RNA干扰验证载体步骤为：1)插入致死基因ccdB表达单元，改造RNA干扰验证的骨架载体；2)设计一对部分重叠，且含有需验证的靶序列的寡核苷酸引物，3)反向PCR扩增、转化及筛选得到靶序列和报告基因融合的RNA干扰验证质粒。本发明实验周期短、成本低；是一个非常有效地构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及的是基因克隆表达技术，特别是一种快速高效构建哺乳动物细 胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。特别适合用于大规模的表达针对哺乳动 物细胞的不同基因的RNA干扰单元，并对其干扰效果进行测定，用于基因功能 研究。

背景资料

后基因组时代，发展能够高通量，并有效的研究基因功能的方法和策略受 到人们的迫切关注。RNA干扰技术具有特异性高，操作简便，重复性好的优点， 是基因功能研究中的重要手段之一。

目前，常用的构建表达哺乳动物细胞RNA干扰单元载体的方法主要有两种。 第一种是寡核苷酸退火法，由化学合成的部分互补，含有干扰目的基因的靶序 列的两条寡核苷酸单链，体外条件下退火形成双链DNA，退火产物两端突出的粘 性末端，能与处理好的载体的突出末端互补，经连接转化后，得到表达RNA干 扰单元的重组质粒。常用的寡核苷酸为一反向重复序列，从这样一个载体转录 而来的单链RNA能够回折互补配对，形成发夹结构，在细胞内经处理后形成小 干扰RNA(siRNA)而引发RNA干扰效应。第二种是PCR扩增法，设计一对扩增 控制RNA干扰单元表达的启动子的PCR引物，正向引物与启动子特异性匹配， 反向引物5’末端加上额外针对目的基因的干扰序列，将PCR产物克隆到相应的 载体上，得到表达RNA干扰单元的载体。这些方法在一定程度上提高了实验效 率，降低了实验成本，但这些方法存在不足，主要表现在以下两方面：

一、步骤繁琐，克隆效率低。这两种方法都需要对克隆的目的片段和载体 特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。两种方法中，载体都需要经过合 适的酶切、纯化处理。第一种方法需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火， 得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应。由于待克隆的目的 片段通常小于100bp，因此难以纯化，得率低，而且要鉴定正确的重组质粒较困 难，假阳性率高。第二种方法需要在PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列， 通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反应，扩增后的PCR产 物也需要与处理好的载体进行连接反应。这个过程不仅花费时间，而且增加了 载体自连背景，使后续的筛选阳性克隆的过程复杂化。

二、不适合高通量的操作。两种方法都需要预先处理纯化好待克隆的目的 片段，都依赖于载体与片段的连接反应。这些操作对于克隆单个或少数的目的 片段可能有效，但要大规模的构建RNA干扰载体却是非常困难的，且效率低下。 此外，第一种方法需要使用的寡核苷酸单链通常为60-100nt，第二种方法中使 用的引物通常大于70nt，合成这些长的寡核苷酸单链不仅实验成本高，而且碱基 合成错误率高。这样就使得筛选正确RNA干扰表达质粒的步骤繁琐，费时费力。

RNA干扰技术已经在生物学众多领域中广泛应用，但是，现在还没有非常合 适的方法来设计有效的干扰靶点。对于某一目的基因，一般是选择若干个靶点， 平行设计一系列的干扰RNA分子，然后分析测定其干扰的效果。常用的检测RNA 干扰水平的方法有实时定量PCR、Northern Blot、Western Blot检测等，为 了克服这些方法费时费力且难以大规模使用的不足，有人发展出一种新的方法， 即将全长的或部分靶基因与报告基因融合表达，通过检测报告基因的表达量变 化而评价目的基因被干扰的程度。但是，这一方法的缺点在于需要有全长或部 分的cDNA序列。Quan Du等提出了一种利用含有RNA干扰靶序列的短寡核苷酸 与报告基因融合来有效筛选RNA干扰单元的方法，此方法不依赖于cDNA的实物 序列，适于高通量的验证RNA干扰效果。目前，构建这种新型RNA干扰验证载 体采用的都是寡核苷酸退火法，其主要缺点有以下两点：

一、步骤繁琐，克隆效率低，不适合高通量的操作。化学合成的两条寡核 苷酸单链通常小于50nt，体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好 的载体连接反应。因此，存在难以纯化，得率低，要鉴定正确的重组质粒较困 难，假阳性率高，不适合高通量的操作的缺点。

二、难以构建同时含有多个(大于3个)需验证靶序列的载体。由于针对 同一个基因常常设计多个干扰RNA，为了简化实验步骤，可将多个需验证的靶序 列构建在同一个验证载体上。利用寡核苷酸退火法，若对于4个以上的RNA干 扰靶位点进行验证，所需要的寡核苷酸就会大于80nt，对于更多的靶位点，所 需要的寡核苷酸长度就会相应增加。这样，实验成本高，而且寡核苷酸合成的 碱基错误率会升高。

(参见刊物“Science 2002年第296卷550-553页”；“FEBS Letters 2003 年第548卷113-118页”；“Biochemical and Biophysical Research Communications 2004年第325卷243-249页”)

发明内容

本发明的目的是提供一种新的构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载 体的技术。在构建的过程中，通过一对带有部分重叠区的PCR引物，反向扩增 骨架载体，利用PCR产物在大肠杆菌体内同源重组自环化而得到重组质粒。整 个过程不需要酶切、连接反应，也不需要长的PCR引物或对引物进行特殊修饰； 只需要PCR和大肠杆菌常规转化，就能方便迅速的得到RNA干扰表达载体及验 证载体；真正能做到高通量、零背景、高效的克隆。

所述的构建哺乳动物细胞RNA干扰载体方法为(如图1所示)：

1)对RNA干扰载体进行改造，在载体的控制RNA干扰单元表达的启动子与 终止信号之间克隆一ccdB基因表达单元(ccdB为条件致死基因，在特殊的大肠 杆菌菌株中，表达ccdB具有致死效应)，得到RNA干扰骨架载体。

2)引物设计。根据在线软件或相关运算规则，设计针对目的基因进行RNA 干扰的靶序列。根据1)所述的RNA干扰骨架载体的控制RNA干扰单元表达的启 动子和终止信号序列，设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核 苷酸引物，此引物应满足以下条件：a)在引物与骨架载体特异性退火的序列5’ 末端依次加上前述设计的靶序列和发夹环的序列，同时使正反向引物含有 10-15nt的同源序列；b)利用该引物扩增得到的产物含有完整的控制RNA干扰 单元表达的启动子和终止信号序列、针对目的基因的干扰序列和发夹环的序列， 同时PCR产物缺失了骨架载体的ccdB基因表达单元。

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒。利用2)所述的引物，以1)所 述的RNA干扰骨架载体为模板，进行PCR扩增；PCR产物转化大肠杆菌感受态细 胞，PCR产物经同源重组自环化，得到表达目的基因特异性的RNA干扰载体。

对于表达类microRNA的RNA干扰载体的构建为：

1)对RNA干扰载体进行改造，是在载体的控制RNA干扰单元表达的启动子 与终止信号之间的microRNA 5’与3’侧翼序列之间克隆一ccdB基因表达单元， 得到表达类mi croRNA的RNA干扰骨架载体；

2)引物设计，根据5’侧翼序列和3’侧翼序列设计一对部分重叠，且带有针 对目的基因靶序列的寡核苷酸引物，此引物应满足以下条件：a)同时在两条引 物5’末端依次加上干扰目的基因的靶序列和microRNA特异性的环序列，并使 得两条引物末端带有10-15nt的重叠区，b)利用该引物扩增得到的产物含有完 整的控制RNA干扰单元表达的启动子和终止信号序列、microRNA侧翼序列、针 对目的基因的干扰序列和发夹环的序列，同时PCR产物缺失了骨架载体的ccdB 基因表达单元。

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒。利用2)所述的引物，以1)所 述的RNA干扰骨架载体为模板，进行PCR扩增；扩增的产物，缺失了模板的ccdB 基因表达单元，在microRNA的两侧翼序列之间引入了靶序列和环，通过转化 大肠杆菌感受态细胞，PCR产物通过同源区重组自环化，得到的重组质粒能够 表达类microRNA的RNA干扰单元。其构建过程见图2。

所述的哺乳动物细胞RNA干扰载体可以是表达类microRNA、表达小干扰 RNA(small interference RNA，siRNA)、表达发夹RNA(shRNA)的干扰载体；

或者用于构建由不同启动子控制RNA干扰单元表达的载体，可以是RNA 聚合酶III型启动子或者RNA聚合酶II型启动子控制的，组成型或者是诱导型 启动子控制的干扰载体，细胞或组织特异性启动子。

所述的用于构建在哺乳动物细胞中表达RNA干扰单元的多种载体，包括质 粒表达载体和病毒载体。

所述的构建RNA干扰验证载体的方法为(如图3所示)：

1)载体改造。对于已有的表达报告基因的载体，在报告基因与加尾信号(或 启动子)之间引入ccdB基因表达单元，得到进行RNA干扰验证的骨架载体。

2)引物设计。根据1)所述的报告基因和终止信号(或启动子)序列，设 计一对部分重叠，且含有需验证的靶序列的寡核苷酸引物，此引物应满足以下 条件：a)在引物与骨架载体特异性退火的序列5’末端加上需验证的靶序列， 同时使正反向引物含有10-15nt的同源序列；b)利用该引物扩增得到的产物含 有完整的报告基因、终止信号序列和需验证的靶序列，同时PCR产物缺失了骨 架载体的ccdB基因表达单元。

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒。利用2)所述的引物，以1)所 述的RNA干扰验证的骨架载体为模板，进行PCR扩增；PCR产物转化大肠杆菌感 受态细胞，PCR产物经同源重组自环化，筛选得到正确的RNA干扰验证质粒。

所述的RNA干扰验证的骨架载体的可验证的靶序列包括来源于载体表达的 和化学合成的siRNA；对于每一个RNA干扰靶位点，与之融合的报告基因是荧 光素酶基因，或者是β-半乳糖苷酶基因，或者是氯霉素酰基转移酶(CAT)基 因，或者是碱性磷酸酯酶基因，或者是绿色荧光蛋白基因，或者是其它报告基因。

本发明以一个含有报告基因的载体为骨架，可构建出同时含有多个待检测 的RNA干扰靶序列的验证载体。

本发明的PCR过程中所使用引物的重叠区长度可以根据实际需要，在5nt～ 30nt之间调整。

由于反向PCR过程中，ccdB基因表达单元缺失，重组质粒和原始模板可以 通过琼脂糖凝胶电泳有效区分；ccdB为条件致死基因，在合适的筛选菌株中， 原始模板表达ccdB致死，可排除模板污染而产生的背景。

本发明与现有技术相比具有明显的优势：

一、本发明利用一对部分重叠的PCR引物，通过在引物中加上针对目的基 因的靶序列及环序列，以RNA干扰骨架载体为模板进行反向PCR扩增，扩增后 的产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过在大肠杆菌中的同源重组以实现PCR产 物的自环化而得到重组表达RNA干扰单元的质粒。整个过程不需要酶切连接反 应，也不需要对载体或目的片段特殊处理，PCR产物可直接转化感受态细胞。整 个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，能高效快速的构建各种不同 类型的RNA干扰载体。

二、本发明在RNA骨架载体上引入条件致死基因，反向PCR将此单元缺失，因 此，可利用转化合适的大肠杆菌将模板淘汰，且最终的RNA干扰载体与模板大 小有一定差异，也能通过简单的琼脂糖凝胶电泳区分开来。利用本方法能有效 去除模板污染，真正做到零背景的构建RNA干扰载体。

三、本发明构建RNA干扰载体的方法，由于将靶序列和环序列分摊在两条 引物上，且引物与载体特异性退火的引物长短可调整，所以本发明中构建RNA 干扰载体所用的引物可控制在50nt以内，不仅节省了实验成本，而且大大降低 了引物合成中碱基错误率。

四、本发明构建RNA干扰验证载体的方法，整个过程不需要酶切连接反应， 也不需要对载体或目的片段特殊处理，PCR产物可直接转化感受态细胞。整个过 程操作简单方便，实验周期短，重组效率高。

五、本发明构建RNA干扰验证载体的方法，利用条件致死基因淘汰模板， 能做到零背景克隆。

六、本发明利用基于PCR的方式构建RNA干扰验证载体，引物短，实验成 本低，能有效构建同时含有多个靶序列的验证载体。

附图说明

图1：RNA干扰载体的构建过程。

其中E表示基于shRNA的RNA干扰骨架载体，promoter2为控制shRNA表达 的启动子，ccdB表示ccdB基因表达单元，terminator表示终止信号。F表示根 据控制shRNA表达的启动子和terminator序列设计的反向PCR扩增骨架载体的 引物，FP2表示正向引物，RP2表示反向引物，HR2表示正反向引物末端的重叠 区，TS2表示针对目的基因的靶序列，SP2表示载体序列特异性退火的区段。G 表示PCR扩增得到的线性化产物，H表示重组后得到的表达shRNA的RNA干扰单 元的质粒。

图2：表达类microRNA的RNA干扰载体的构建过程。

其中A表示表达类microRNA的RNA干扰骨架载体，promoterl为控制 microRNA-RNA干扰单元表达的启动子，ccdB表示ccdB基因表达单元，pA表示 终止信号，5’Flank和3’Flank分别表示microRNA的侧翼序列。B表示根据 microRNA的侧翼序列设计的反向PCR扩增骨架载体的引物，FP1表示正向引物， RP1表示反向引物，HR1表示正反向引物末端的重叠区，TS1表示针对目的基因 的靶序列，SP1表示和侧翼序列特异性退火的区段。C表示PCR扩增得到的线性 化产物，D表示重组后得到的表达类microRNA-RNA干扰单元的质粒。

图3：RNA干扰验证载体的构建过程。

其中VO表示作为模板的报告基因表达载体，promoter为控制报告基因表达 的启动子，RG为报告基因，ccdB表示ccdB基因表达单元，pA表示加尾信号。 FP，RP分别表示以VO为模板，反向PCR扩增该载体的引物，SP表示和模板的 报告基因及pA特异性退火的引物，HR表示与另一条引物同源的10-15nt区段， R表示需验证的靶序列，它可以为一个或多个不同的需验证的靶序列。

具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明：

实施例1：

利用该方法构建基于microRNA30，针对萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰载 体以及相应以绿色荧光蛋白为报告系统的验证载体。

构建一个由RNA聚合酶II启动子控制的表达类microRNA30的RNA干扰载 体，在载体的microRNA30的5’侧翼序列和3’侧翼序列之间引入一ccdB基因 表达单元，得到RNA干扰骨架载体。针对RNA干扰骨架载体microRNA30的5’ 侧翼序列和3’侧翼序列设计反向扩增载体的PCR引物，根据Invitrogen公司 在线软件设计针对萤火虫荧光素酶的RNA干扰靶序列(选取基因200-220bp序 列为例)，在正反向引物5’末端分别依次加上靶序列和microRNA30特异性的环 序列，同时使两引物带有10nt同源区，设计好的序列为：1-F：5’gaagccacagatgta tgaaacgatgggctgaata TGCCTACTGC 3’，2-R：5’cgtggcttc acta tgaaacgatatgggct gaatac CGCTCACTGTCA 3’，其中大写为与骨架载体特异性 退火序列，小写斜体为靶序列，小写正体为环序列，横线标注的为10nt同源区。 以RNA干扰骨架载体为模板，利用引物1-F，2-R进行PCR扩增，得到的产物直 接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选得到重组质粒，表达干扰萤火虫荧光素 酶的单元，实验结果表明，阳性克隆率大于90％。

构建一个由启动子CMV控制的表达绿色荧光蛋白的质粒pSC-EGFP。在绿色 荧光蛋白基因和加尾信号中间克隆-ccdB基因表达单元，得到RNA干扰验证骨 架载体。根据绿色荧光蛋白基因和加尾信号序列，设计反向扩增该载体的PCR 引物，在反向引物5’末端加上上述的靶序列，正向引物5’末端加上10nt与 反向引物同源的区段，设计好的序列为：3-F：5’tatcgtttcaTGATCATAATCAGCCATA CCACATTTGTA3’，4-R：5’tgaacgata tgggctgaata TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC GA 3’，其中大写的碱基表示与骨架载体特异性退火序列，反向引物的小写碱基 为靶序列，横线标注的为10nt同源区。以RNA干扰验证骨架载体为模板，利用 引物3-F，4-R进行PCR扩增，得到的产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α， 筛选得到重组质粒，实验结果表明，阳性克隆率大于90％。

实施例2：

利用该方法构建基于microRNA30，针对p53基因的RNA干扰载体及其验证 载体的构建。

按实施例1类似的方法，设计针对p53基因的干扰靶序列。根据RNA干扰骨架 载体microRNA30的5’侧翼序列和3’侧翼序列设计反向PCR扩增载体的引物， 根据Invitrogen公司在线软件设计针对p53基因的RNA干扰靶序列(选取基因 591-611bp序列为例)，在正反向引物5’末端分别依次加上靶序列和microRNA30

特异性的环序列，同时使两引物带有10nt同源区，设计好的序列为：

5-F：5’gaagccacag atgta ggaaggaattgcgtgtgga TGCCTACTGC 3’，6-R： 5’Ctgtggcttc acta ggaaggaaatttgcgtgtgga CGCTCACTGTCA 3’。其中大写为 与骨架载体特异性退火序列，小写斜体为靶序列，小写正体为环序列，横线标 注的为10nt同源区。以实施例1中构建的RNA干扰骨架载体为模板，利用引物 5-F，6-R进行PCR扩增，得到的产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选 得到重组质粒，表达干扰p53基因的单元，实验结果表明，阳性克隆率大于90 ％。

根据绿色荧光蛋白基因和加尾信号序列，设计反向PCR扩增该载体的引物， 在反向引物5’末端加上上述的靶序列，正向引物5’末端加上10nt与反向引 物同源的区段，设计好的序列为：7-F：5’aattccttcc TATCATAATCAGCCATA CCACATTTGTA 3’，8-R：5’ggaaggaatt gcgtgtgga TTACTTGTACAGCTCGTCCAT GCCGA 3’。其中大写的碱基表示与骨架载体特异性退火序列，反向引物小写序 列为靶序列，横线标注的为10nt同源区。以实施例1中构建的RNA干扰验证骨 架载体为模板，利用引物7-F，8-R进行PCR扩增，得到的产物直接转化大肠杆 菌感受态细胞DH5α，筛选得到重组质粒，实验结果表明，阳性克隆率大于90％。

用于转化的大肠杆菌感受态细胞DH5α和含有ccdB基因的原始质粒购置于 Invitrogen公司，含有绿色荧光蛋白基因的原始质粒购置于美国BD公司。由 RNA聚合酶II启动子控制的表达类microRNA30的RNA干扰载体为本实验室构 建，载体上的microRNA30的侧翼序列是利用PCR方式全合成的。本发明中所用 的引物由上海生工合成。