用于从稳定剂中纯化核酸的组合物和方法

摘要

本发明涉及用于从样品中纯化RNA、DNA或两者的试剂、方法和试剂盒。

说明书

优先权声明

本专利申请要求2004年11月5日提交的美国申请系列号60/625513和 2005年9月13号提交的美国申请系列号60/716451作为优先权。本申请要求 获得所列出的这些申请的利益，这些申请的全文被纳入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及从样品中分离RNA、DNA或两者的材料和方法。

背景

核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)被广泛应用于分子生 物学领域，用于研究和临床分析。存在大量的从生物学样品中分离DNA和RNA 的方法，这些方法需要分裂细胞，将核酸释放到溶液中。RNA对降解高度敏感。 因此，也存在保护RNA不被RNA降解酶(如RNA酶)降解的方法。然后可 从DNA、蛋白质和其它污染物中分离出RNA。这些分离方法通常以逐步的方 式实施，其中细胞在已知RNA酶活性的条件下裂解，接着在分开的步骤中被 进一步纯化。也已开发了在采集时稳定化RNA的各种方法，以允许在进一步 纯化该RNA前存储该样品。

目前的核酸稳定化产品系统仅允许有限的纯化选择。例如，这些稳定化产 品系统和它们的试剂使使用者的选择限制于采集管制造商特别涉及的纯化产 品。这些方法受限于它们的多功能性，即它们要么需要专用的主要涉及、要么 难以使用，要么受限于从相同样品中分离RNA和DNA两者的能力。因此，使 用者需要选择用于RNA或DNA的“稳定化”试管，并需要为它们分别购买单 独的核酸分离试剂盒。

概要

本发明的制剂和方法允许从相同样品中抽提和纯化RNA、DNA或两者， 从而为使用者提供了方便。此外，本发明的制剂和方法适用于许多制造商的采 集管，从而为使用者提供了简单、灵活和成本节省的方案，不论他们选用了何 种采集管。

随着用于保存和稳定生物样品中核酸的的采集管和试剂的开发，需要能使 终端用户的选择能够从相同样品中有效分离RNA、DNA或两者的方法。目前， 使用者必须购买分别用于DNA和RNA的试剂盒和采集管。可从商业途径获得 几种用于样品保存和稳定的方法。但是，没有能够从同一试管中抽提DNA和 RNA两者的材料、方法和试剂盒。

本发明提供一种从含有RNA的测试样品中分离RNA的方法，该方法包括： 从稳定化的样品中制备粗裂解物；将该粗裂解物与含有pH约为7-9的缓冲液、 碱和两亲试剂的增溶溶液接触；使该样品与pH缓冲为约大于7的裂解溶液(pH 约大于7的缓冲裂解溶液)接触，产生分离样品，其中该裂解溶液含有络合盐； 使该分离样品与固相载体接触，使得分离样品中含有基本上未降解RNA的核 酸结合到该固相载体上；用一种或多种洗涤溶液洗涤该固相载体，除去结合于 该固相载体的核酸之外的物质，该结合的核酸含有基本上未降解的RNA；和从 该固相载体上将所述结合的基本上未降解的RNA洗脱，获得基本上纯且未降 解的RNA。

本发明还提供一种从含有DNA的测试样品中分离DNA的方法，该方法包 括：从稳定化的样品中制备粗裂解物；将该粗裂解物与含有pH约为7-9的缓 冲液、碱和两亲试剂的增溶溶液接触；使该样品与pH缓冲为约大于7的裂解 溶液接触，产生分离样品，其中该裂解溶液含有络合盐；使该分离样品与(i) 含有缓冲液、锂盐和两亲试剂的结合溶液，或(ii)含有锂盐和醇的洗涤溶液 接触，得到结合样品；使该结合样品与固相载体接触，使结合样品中含有基本 上未降解DNA的核酸结合到该固相载体；用一种或多种洗涤溶液洗涤该固相 载体，除去结合于该固相载体的核酸之外的物质，该结合的核酸含有基本上未 降解的DNA；和从该固相载体上将所述结合的基本上未降解的DNA洗脱，获 得基本上纯且未降解的DNA。

本发明还提供一种从样品中分离DNA和RNA两者的方法，该方法包括： 将所述样品分装到第一试管和第二试管中(或在将增溶溶液加到该样品中后再 分装)；根据上述分离RNA的方法分离第一试管中的样品中的RNA；和根据 上述DNA分离方法分离第二试管中的样品中的DNA。

本发明还提供一种从含有RNA的测试样品中分离基本上纯且未降解的 RNA的方法。该方法涉及：使经胍盐(guanidinium)稳定剂如Tempus^TM稳定 剂(参见如美国专利5972613和WO 99/29840)稳定的测试样品与醇接触；离 心该测试样品，形成粗裂解物沉淀和上清液；除去上清液；使该粗裂解物沉淀 (pellet)与pH缓冲在大于约7的裂解溶液接触，获得分离样品，其中该裂解 溶液含有络合盐；使该分离样品与固相载体接触，使得分离样品中含有基本上 未降解RNA的核酸结合到该固相载体；用一种或多种洗涤溶液洗涤该固相载 体，除去结合于该固相载体的核酸之外的物质，其中该结合的核酸含有基本上 未降解的RNA；和从该各种载体洗脱结合的基本上未降解的RNA，获得基本 上纯和未降解的RNA。可用于此方法的醇可以是乙醇或甲醇或甲醇和乙醇的混 合物。醇的浓度约为30-100％，或70-95％。应注意的是，当在离心步骤后 从测试样品除去上清液时，来自稳定剂的胍盐也基本上被除去，这样，该粗裂 解物沉淀基本上不含有胍盐。术语“基本上不含”指低于1％(如低于0.5％或 0.1％，甚至低于0.01％)的最初起始体积的稳定剂留存在该粗裂解物中。可能 残留的任何残余胍盐将不会对接下来的纯化工艺的化学性质产生影响。

本发明提供一种增溶含核酸材料的制剂，其中该制剂含有浓度为约10- 20mM、pH约为7-9的Tris-HCl，浓度约为20-50mM的Tris碱，浓度约为5- 15％的Triton-X，和浓度约为1-20mM的EDTA。

本发明提供一种用于分离RNA、DNA或两者的试剂盒，该试剂盒包括包 装容器，其中包含(分别包装的)增溶溶液、裂解溶液、洗涤溶液I或结合溶 液、洗涤溶液II、和用于从样品中分离RNA、DNA或两者的方案说明书。

从下文的详细描述以及权利要求书中将更明显地看到本发明的其它特征 和优点。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属 领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。文中提及的所有出版物、专利申 请、专利和其它文献都全文纳入作为参考。在出现抵触的情况下，将以本说明 书(包括各定义)为准。所公开的材料、方法和实施例仅仅是阐述性的，而非 限制性的。熟练的技术人员将理解与本文所述类似或相当的方法和材料也可用 于实施本发明。

附图简述

图1是一流程图，它描述用本发明从采集于PAXgene Blood RNA采集管 中的样品中分离DNA、RNA或两者的流程，或者从采集于Tempus Blood RNA 采集管中的样品中分离RNA的流程。

图2-4显示了使用不同的稀释剂和离心条件从Tempus Blood RNA采集 管制备粗裂解物的效果。

详细描述

核酸纯化或分离

生物学、医学和药理学的发展增加了研究基因的兴趣，强化了对从各种样 品中获得核酸的复杂方法的需求。例如，核糖核酸提供了广泛的关于遗传起源 和细胞功能活性的信息。这些信息可用于例如临床实践，用以针对感染、检测 表达致癌基因的存在、检测遗传病、监控宿主防御机制的状态、研究和诊断代 谢疾病、研究药物对患者基因表达的影响，以及研究药物的毒副作用。

所存在的各种核酸纯化方法可分成两大类：液相纯化和固相纯化。在液相 纯化中，核酸维持为液体状态，而杂质通过沉淀和/或离心被除去。或者，核酸 被沉淀出来，而杂质被保留。在固相纯化中，核酸被结合到固相载体上，而杂 质被选择性洗脱。例如，采用液相纯化来分离的RNA保留在液相中，而杂质 被通过诸如沉淀和/或离心之类的方法除去。在固相纯化中，RNA结合到固相 载体上，而杂质如DNA、蛋白质和磷脂等被选择性洗脱。两个纯化大类都利用 常规的方法以及更快速的方法，所述常规的方法需要大量的步骤，且通常用到 有害的试剂，而所述更快速的方法需要较少的步骤，且通常较少的有害试剂。 在RNA纯化中，如果起始材料(如生物材料)包括细胞，液相方法和固相方 法都需要细胞或病毒共破裂，或裂解步骤。破裂或裂解步骤产生与污染物如 DNA、脂质、碳水化合物、蛋白质等混合的RNA。这种混合物还含有降解RNA 的必须被除去和/或灭活以不感染产生基本上未降解的RNA的RNA酶。

传统上，液相RNA分离方法使用液-液抽提(即酚-氯仿)和醇沉淀。一种 常规采用的液-液RNA抽提法是Chomczynski和Sacchi(Chomczynski P.，Sacchi N.，“用酸性硫氰酸胍-酚-率抽提单步分离RNA的方法”，Anal Biochem 162： 156-9〔1987〕；美国专利5945515、5346994和4843155)描述的“酸-胍盐- 酚”法。该方法包括：(1)用异硫氰酸胍(GITC)溶液抽提样品，该溶液中 连续地加入了酸性介质、酚和氯仿；(2)离心该混合物，分离各相，这样可 将被酚变性的蛋白质从中间层中的核酸除去；(3)加入醇，沉淀，从而浓缩 该RNA；和(4)洗涤和再水合该纯化的RNA。虽然已证明此方法能确保RNA 的纯化，但是它使用到有害的试剂，如氯仿和酚，需要大量工作，而且有机试 剂被携带到纯化的样品中。

采用阳离子去污剂沉淀核酸是另一液相技术例子(美国专利5985572、 5728822和5010183(MacFarlane))。例如，美国专利5985572公开了一种使 用季胺表面活性剂从生物学样品中分离RNA的方法。Heath(美国专利5973137) 公开了一种无害液相纯化法，该方法使用低pH裂解和沉淀试剂。但是，液相 方法存在严重的缺点，他们涉及冗长的沉淀步骤，结果是难以自动化。因此， 对高通量RNA纯化的需求促进了固相方法的发展。在一些实施例中，RNA分 离涉及在异硫氰酸胍中将细胞匀浆，接着连续加入乙酸钠和酚，以及氯仿/异戊 基醇。一些裂解细胞和已知RNA酶的方法是已知的，他们使用到胍的离液盐 (chaotropic salt)。离心后，加入醇，RNA从上层中沉淀出来。其它方法包括 将热的酚加到细胞悬液中，接着加入醇，进行沉淀。这些方法对使用者是有害 的，而且处理所使用的试剂代价可能很高。

从采用本领域普通技术人员熟知的各种液相和固相方法来分离基本上未 降解的DNA。例如，可采用常规的技术，如Maniatis等(1989，Molecular Cloning， A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY)或Persing等(编 辑)(1993，Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications， American Society for Microbiology，Washington D.C.)描述的方法来分离DNA。

对于固相DNA纯化，已使用了多种固相载体，包括薄膜滤器、磁珠、金 属氧化物和胶乳沉淀。可能最广泛使用的固相载体是二氧化硅基沉淀(参见例 如美国专利5234809(Boom等)；国际出版物WO 95/01359(Colpan等)； 美国专利5405951(Woodard)；国际出版物WO 95/02049)；WO 92/07863(Qiagen GmbH))。例如，么张利刚5234809(Boom等)中公开的方法使用了高浓度 的chaotropic溶液来将DNA结合到二氧化硅沉淀上，该方法需要六个离心步骤 和5种试剂来从全血中纯化DNA。这种方法的缺点是沉淀悬浮液的使用、许多 离心步骤的使用、以及有害试剂如异硫氰酸胍和丙酮的使用。

在另一例子中，美国专利5496562(Burgoyne)描述了一种纯化含有干燥 的血液的纤维素滤纸的方法，该方法在4次酚洗涤和5次异丙醇洗涤中使用了 4种试剂。干燥后，从滤纸片上切下一小块滤纸，直接用作PCR扩增的底物。 尽管使用了结合的DNA来分析，但是这些方法仍需要多个步骤和有害的试剂。

样品

可采用各种方法采集样品，例如生物学样品。例如，使用样品采集容器来 采集和保存样品。在一些实施例中，采集容器是具有弹性塞子的玻璃或塑料管。 在其它实施例中，使用血液采集管，其中该管被抽真空，从而可以将一定体积 的血液抽吸到该管中。在一些实施例中，采集管可含有各种添加剂，如含于其 中的乙二胺四乙酸(EDTA)，以制备用于特定测试的血液样品。在其它实施 例中，添加剂是抗凝剂。在一些例子中，抗凝添加剂是经缓冲的柠檬酸盐或肝 素的水溶液。在其它例子中，该柠檬酸盐水溶液以指定量与血液样品混合，以 测定实施特定测试所需的抗凝剂的量。但这些经处理的采集管主要用于血清学 测试，因为这些添加剂不能使样品中的核酸稳定。

样品采集容器被用来采集和/或保存各种各样的样品。在某些实施例中，样 品采集容器被用来采集和/或保存生物液体或样品(如全血，骨髓，血斑，血液 血清，白细胞层(buffy coat preparation)，唾液和脑脊髓液，颊抽取液(buccal swab)，培养的细胞，细菌的细胞悬浮液，固体的动物组织如心脏、肝和脑， 身体废弃物如粪便和尿，从空气、水、沉积物或土壤获取的环境样本，植物组 织，酵母，细菌，病毒，支原体，真菌，原生动物，立克次氏体，以及其它小 的微生物细胞)。在其它实施例中，样品采集容器被用来采集和/或保存生物材 料的裂解物、匀浆物或部分纯化样品。在其它例子中，生物材料包括未加工的 或部分纯化的核酸混合物。

近年来上市的几种市售产品将生物样品(如血液)保存在采集管中，并且 还将核酸“稳定化”。“稳定化”对于保护RNA不降解和保存样品以备之后 的核酸纯化之用特别有用。PreAnalytiX^TM(Valencia，CA)提供了用于稳定DNA 或RNA的血液采集管(美国专利6617170)。这些管的商品名是Paxgene^TM DNA 采集管和Paxgene^TM RNA采集管。这些管使用草酸十四烷基-三甲基铵和酒石 酸制剂。Paxgene^TM Blood管是塑料真空管，用于采集全血，并稳定血液样品中 的RNA。PreAnalytix^TM还另外提供试剂盒，用于从这些采集管中纯化DNA或 RNA。

Applied Biosystems(Forster City，CA)销售用于稳定RNA的血液采集管。 这些管的商品名是Tempus^TM RNA采集管。这些管使用含有盐酸胍的制剂。此 产品的溶液可在室温下保持全血中的总RNA室温稳定达5天。

Ambion(Austin，TX)提供了一种稳定RNA的试剂(美国专利6528641)。 该试剂的商品名是RNAlater溶液。该试剂使用硫酸铵制剂。RNAlater是水 性的组织和细胞保存试剂，它能够保护包含在完整且非经冷冻的组织或细胞内 的细胞RNA。RNAlater不需要立即加工样品或在液氮中冷冻样品以用于随后 的加工。使用者切下要保存的组织样品，这些样品在至少一个维度上小于 0.5cm，接着将这些样品浸没在5体积的RNAlater中，直到他们直接被用于从 样品中纯化核酸。

Omega Bio-Tek销售一种稳定RNA的试剂。这种试剂的商品名是 RNAsafer稳定剂。将这种试剂施用于样品后，它将渗入细胞和组织中，并在 室温下将RNA酶灭活。样品可在RNAsafer稳定试剂中于-20℃保存达12个月。

本发明的方法

试剂

本发明包括这几类试剂：稀释溶液、增溶溶液、裂解溶液、蛋白酶K溶液、 结合溶液、洗涤溶液和洗脱溶液。

(i)稀释溶液：在一些实施例中，在稳定剂的存在下将稀释剂加到生物材 料中以便制备粗裂解液。Tempus^TM溶液的制造商(Applied Biosystems，Inc.) 指定使用PBS。PAX系统不要求稀释溶液。在下文实施例4所述的实施方式中， 使用醇来增强方法的效果(robustness)。

(ii)增溶溶液：使用增溶溶液来使离心后的样品沉淀增溶，以制得粗裂 解液。在一些实施例中，增溶溶液制剂包含缓冲液、碱、两亲试剂如去污剂或 表面活性剂或它们的混合物，以及任选的螯合剂。例如，增溶溶液可含有缓冲 液如pH为7-9(如pH7.1、7.3、7.5、7.8、8.0、8.2、8.6、8.8、8.9和9)的 Tris HCl。在一些实施例中，缓冲液浓度可以在10-20mM(如10.5mM、11mM、 11.7mM、12mM、12.5mM、13mM、13.6mM、14mM、14.2mM、14.8mM、15mM、 16mM、17mM、18mM、19mM或19.5mM)。碱的浓度可以是20-50mM(例如 21mM、25mM、27mM、31mM、35mM、38mM、42mM、47mM或49mM)。 在一些例子中，增溶溶液还可含有两亲试剂。两亲试剂包含具有连接于疏水官 能团如烃链的亲水基团且具有表面活性剂性质的化合物或分子。在一些例子 中，两亲试剂是去污剂。可使用阴离子、阳离子和两性离子去污剂。有时，核 酸分离可采用非离子去污剂。在另一些例子中，使用Tween类非离子去污剂(如 Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80等)。在一些例子中，使用Triton 类去污剂(如X-100、X-114、XL-80N等)。在另一些例子中，使用Tergitols (如XD、TMN-6)、Nonidets或Igepal(如NP-40)去污剂。在一些实施例中， 非离子去污剂以5-15％(如约5％、7％、8％、10％、12％或14％的Triton-X) 的浓度使用。在其它实施例中，以1-20mM(如5-10mM、6-9mM、7-8mM、8mM 或7.5mM)的浓度加入螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)。

(iii)裂解溶液：裂解溶液能有效裂解(如生物样品中的细胞的裂解)， 以释放出核酸，可有效抑制核酸降解酶的活性，并使得核酸结合到选定的固相 载体上。本发明的裂解溶液含有缓冲液(如Tris-HCl)、碱金属盐(如钠盐如 氯化钠，或锂盐如氯化锂或溴化锂)、两亲试剂(如去污剂或表面活性剂或其 混合物)，以及任选的螯合剂(如EDTA或CDTA)。本发明的裂解溶液的独 特之处在于它不需要加入强的离液(chaotropic)物质如胍盐、脲等。胍盐和脲是 强离液盐，它们破坏水的结构，通常降低疏水相互作用的强度，因此严重影响 其它溶质分子。例如，当溶解于水中时，脲破坏蛋白质的二级、三级和四级结 构，结果引起蛋白质从RNA中解离。胍盐和脲通过吸热反应溶解于水中。如 Hofmeister系列(一种广泛使用的系统，用于根据相对离液强度给阳离子和阴 离子排序，F.Hofmeister，“关于盐的作用的理解”，Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.， (Leipzig)24(1888)247-260)所定义的，胍盐和脲两者都被认为是强离液 盐。

与强离液盐不同，碱金属盐(如氯化钠、氯化锂和溴化锂)在水中的反应 是放热反应，是强烈的离子-偶极相互作用的反映，如强向渗性(kosmotropic)锂 离子所表现出的那样，由此得到很大的溶解度。上述区别反映出本发明强离 液性物质(如胍盐)和碱金属盐(尤其是氯化锂)之间的区别。

裂解溶液的第一组分是维持溶液pH的缓冲液(如Tris缓冲液或任何已知 的缓冲液)。例如，缓冲液的pH可以至少约为8、至少约为8.5，或者甚至可 以至少约为9(如8.1、8.4、8.6、8.7、8.9、9.1或9.5)。缓冲液的pKa可为 至少约8(如8.1、8.3、8.5、8.6、8.8和8.9)，且可以50-150mM(如60mM、 70mM、80mM、90mM、100mM、120mM或140mM)的浓度使用。在一些实 施例中，Tris缓冲液是适当的缓冲液。在一些例子中，使用pH为8.0、浓度为 100mM的Tris缓冲液。在其它一些实施例中，可使用碱来调节裂解溶液的pH 值。碱可以是可将溶液的pH值调高至不低于7(如pH7.5、8、8.5或9.0)的 碱。在一些例子中，碱可以是碱金属氢氧化物。这些碱金属氢氧化物包括但不 限于氢氧化钠、氢氧化钾以及氢氧化锂。

裂解溶液的另一组分是络合盐(如RNA-络合盐)，它赋予核酸独特的结 合特性，使得核酸优先结合到固相载体而非其它污染物如蛋白质、磷脂等。在 一些实施例中，这样的络合盐可以是任何已知的络合盐，如钠盐或锂盐，如氯 化锂或溴化锂。盐可以3-10M(如4M、5M、6M、7M、8M或9M)的浓度存 在，因为DNA和RNA与固相载体的优先结合可通过高浓度的碱金属盐而增加。 在某些实施例中，在裂解溶液中使用氯化锂，浓度为4M。

裂解溶液还可包括一种或多种两亲试剂。两亲试剂包括具有连接于疏水官 能团如烃链的亲水基团且具有表面活性剂性质的化合物或分子。在一些例子 中，两亲试剂是去污剂。虽然阴离子、阳离子和两性离子去污剂都可用，但是 使用非离子去污剂最有利于核酸分离。虽然可使用任何非离子去污剂，但是非 离子去污剂的离子是Tween类(如Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween- 80等)、Triton类(如X-100、X-114、XL-80N等)、Tergitols(如XD、TMN-6 等)以及Nonidets或Igepal(如NP-40等)。非离子去污剂以5-15％(如约10 ％、11％、12％、13％或14％)的浓度使用。在其它实施例中，两亲试剂是表 面活性剂，如二甘醇一乙醚(DGME)。可以5-15％(如约6％、10％、11％、 12％、13％或14％)的浓度使用表面活性剂。在一些例子中，可使用去污剂和 表面活性剂的组合。在某些例子中，使用去污剂Triton-X和表面活性剂DGME 的组合。可以5-15％(如约10％、11％、12％、13％或14％)的浓度使用该 组合。例如，该组合是5％Triton-X加5％DGME。

为防止核酸如RNA降解，在裂解溶液中使用无核酸酶的水。在一些实施 例中，还可使用螯合剂来防止污染性核酸的降解。使用螯合剂可防止核酸聚合 物降解成较小的片段，以免造成更多的污染问题。螯合剂的浓度可以是1- 100mM(如2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、35mM、45mM、 50mM、65mM、75mM、85mM或95mM)或是1-10mM(如1.5mM、2mM、 3mM、4mM、6mM、7mM或9mM)。在一些例子中，使用螯合剂EDTA。在 其它例子中，使用螯合剂CDTA。

本发明的裂解溶液具有独特优点。高浓度的络合盐与高浓度的去污剂在中 性至高pH缓冲液中的独特组合将对核酸有害的酶(如RNA酶)灭活，而不需 使用诸如酚、氯仿以及胍盐之类的试剂。此外，该溶液赋予核酸强结合特性， 使得它们紧紧地与所选固相载体结合。

(iv)任选的蛋白酶K溶液：在一些实施例中，在RNA纯化期间，使用 者还进行了蛋白酶K步骤。在一些实施例中，在DNA纯化期间，使用者还进 行了蛋白酶K步骤。合适的蛋白酶K溶液含有约10-25mg/mL的蛋白酶K(如 10mg/mL、15mg/mL或25mg/mL)。在某些实施例中，合适的蛋白酶K溶液 具有浓度为20mg/mL的蛋白酶K。

(v)结合溶液：当从稳定的样品中纯化DNA时，为了改善DNA与固相 载体的结合，可使用结合溶液。通过显著提高盐浓度或脱水或两者来增强结合。 本发明的结合溶液具有以下组分：缓冲液、碱金属盐和两亲试剂(如去污剂或表 面活性剂或其混合物)。

结合溶液的第一组分是维持溶液pH的缓冲液。例如，pH值可以至少约为 7(如7.5、8、8.5、8或9.5)。可以50-150mM(如60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM、120mM或140mM)的浓度使用缓冲液。在一些实施例中， Tris缓冲液是合适的缓冲液。任选的，可使用碱来调节结合溶液的pH值。碱 可以是将该溶液的pH值调高到不低于7(如pH7.5、pH8、pH8.5或pH9.0)的 碱。在一些实施例中，碱可以是碱金属氢氧化物。这类碱金属氢氧化物包括氢 氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂。

结合溶液的另一组分是络合盐，它赋予核酸独特的结合特性，使得核酸优 先结合到固相载体而不是其它污染物如蛋白质、磷脂等。例如，这种络合盐可 以是任何已知的络合盐，如钠盐或锂盐，如氯化锂或溴化锂。盐可以5-15M(如 约6M、7M、8M、9M、10M、11M、12M、13M或约14M)的浓度存在，因 为DNA与固相载体的优先结合可通过高浓度的碱金属盐来增强。

结合溶液的另一组分是两亲试剂。两亲试剂包括具有连接于疏水官能团如 烃链的亲水基团且具有表面活性剂性质的化合物或分子。在一些例子中，两亲 试剂是去污剂。虽然阴离子、阳离子和两性离子去污剂都可用，但非离子去污 剂最利于核酸分离。虽然可使用任何非离子去污剂，但是非离子去污剂的例子 是Tween类(如Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80等)、Triton类 (如X-100、X-114、XL-80N等)、Tergitols(如XD、TMN-6等)以及Nonidets 或Igepal(如NP-40等)。非离子去污剂可以5-15％(如约10％、11％、12％、 13％或14％)的浓度使用。在另一些实施例中，两亲试剂是表面活性剂，如二 甘醇一乙醚(DGME)。可以5-15％(如约6％、10％、11％、12％、13％或 14％)的浓度使用表面活性剂。在一些例子中，可使用去污剂和表面活性剂的 组合。在某些例子中，使用去污剂Triton-X和表面活性剂DGME的组合。可以 5-15％(如约10％、11％、12％、13％或14％)的浓度使用所述组合。例如， 所述组合可以是5％Triton-X加5％DGME。

去污剂或表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性离子型或非离子型。在 一个实施例中，使用非离子去污剂。已发现，一些荷电的去污剂如SDS在较高 浓度的盐溶液中溶解度降低，实际上，它们会迅速沉淀。但是，也可能会在某 些实验条件下用这些荷电的去污剂来预处理固相载体，此类条件包括但不限于 本发明一个实施例中所描述的那些条件。非离子型去污剂的例子包括Tween、 Triton、Tergitol和Nonidet或Igepal类的去污剂。在一实施例中，表面活性剂 是DGME(二甘醇一乙醚)。在某些DNA纯化实施例中，为了通过减少试剂 数量来简化试剂盒，可将洗涤溶液I用作结合溶液。

(vi)洗涤溶液：本发明还公开一种或多种洗涤溶液，它们用于洗涤结合 了核酸的固相载体，以使除去非核酸的污染物如蛋白质、磷脂等。洗涤溶液可 含有浓度大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％或100％)的醇。醇可 以是例如乙醇或甲醇。些实施例使用75％浓度的乙醇。另一些实施例使用65 ％浓度的甲醇。洗涤溶液I含有高浓度碱金属盐，例如如钠盐或锂盐，如氯化 锂或溴化锂，，浓度例如4-10M之间(如5-6M、4-7M、5-8M、6-9M、6-10M、 7-10M、5M、6M、7M、8M、9M或10M)。对于本发明的目的，高盐浓度指 盐浓度高到足以抑制酶活性、足以与核酸络合、足以发生盐析作用而使核酸与 固相载体结合。洗涤溶液I还含有醇(如乙醇或甲醇)。醇浓度为25-80％(如 30-40％、40-50％、35-45％、55-65％、60-70％、65-75％、70-80％、30％、40 ％、55％、60％、70％或75％)。在某些实施例中，洗涤溶液I含有浓度为70 ％的乙醇。在其它实施例中，洗涤溶液I含有浓度为80％的甲醇。

洗涤溶液II含有缓冲液、醇和任选的螯合剂(如EDTA或CDTA)。对于 本发明的目的，由洗涤溶液II最后洗去所有残留的生物物质。在一些实施例中， 缓冲组合物可以是pH例如为6-8(如pH6.5、7或7.5)的Tris-HCl。缓冲液 浓度可以为50-150mM(如60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM 或140mM)。洗涤溶液II还可含有醇(如乙醇或甲醇)。醇浓度为50-90％(如 55-65％、60-70％、65-75％、70-80％、55％、60％、60％、75％、80％或85 ％)。EDTA浓度为1-20mM(如5-10mM、7-15mM、10-17mM、15-20mM、 2mM、4mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、15mM、 17mM或19mM)。在某些例子中，洗涤溶液II含有浓度为80％的乙醇和浓度 为8mM的EDTA。另一些例子中，洗涤溶液II含有浓度为70％的甲醇和浓度 为10mM的EDTA。另一些实施例中，洗涤溶液II含有浓度为60％的甲醇和浓 度为12mM的EDTA。另一些实施例中，洗涤溶液II含有浓度为75％的甲醇和 浓度为9mM的EDTA。

对于需要分离RNA的某些应用来说，DNA的去除可能是需要的甚至是关 键性的。使用本发明的DNA酶洗涤溶液进行的DNA酶消化已被证明是一种从 RNA样品中除去DNA污染物的有效方法。该DNA酶洗涤溶液含有醇(如乙 醇或甲醇)、盐和螯合剂(如EDTA或CDTA)。醇浓度可以为10-50％(如 10-30％、20-40％、30-50％、15％、20％、25％、30％、35％或45％)。在一 些实施例中，醇是浓度为50％的甲醇。在某些实施例中，DNA酶洗涤溶液可 含有盐，如锂盐(如氯化锂、溴化锂)。锂盐浓度可以是2-5M(如3-4M、2M、 3M、4M或5M)。在一些例子中，DNA酶洗涤溶液可含有浓度为4M的氯化 锂。在某些实施例中，该制剂还可含有螯合剂。在某些例子中，螯合剂可以是 EDTA。在其它例子中，螯合剂可以是柠檬酸盐。螯合剂的浓度可以为25-100mM (例如30-70mM、40-80mM、50-90mM、35mM、45mM、50mM、60mM、75mM、 85mM或95mM的柠檬酸三钠)。在一些实施例中，DNA酶洗涤溶液含有浓度 为30％的乙醇、浓度为4M的LiCl和浓度为50mM的EDTA。另一些实施例 中，DNA酶洗涤溶液含有浓度为40％的乙醇、浓度为5M的LiCl和浓度为65mM 的EDTA。

(vii)洗脱溶液：可使用洗脱溶液洗经分离过程结合于固相载体的基本上 未降解的核酸(如DNA或RNA)。本发明裂解生物材料、将核酸结合到固相 载体和洗涤固相载体所用都是简单试剂，洗脱溶液因此也是简单的。本领域技 术人员已知许多种洗脱溶液。在一些实施例中，可使用Versagene^TM DNA洗脱 溶液(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN)来洗脱结合的基本上未降解的 DNA。在一些例子中，可使用Tris-EDTA(TE)来洗脱结合的基本上未降解的 DNA。

可使用RNA洗脱溶液来洗脱结合于固相载体的基本上未降解的RNA。在 一些例子中，可使用Versagene^TM RNA洗脱溶液(Gentra Systems，Inc.， Minneapolis，MN)来洗脱结合的基本上未降解的RNA。在某些实施例中，可 使用无RNA酶的水来洗脱结合的基本上未降解的RNA。在其它实施例中，可 用灭活RNA酶的物质如焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)来处理 水，并将其用于洗脱RNA。也可使用本领域技术人员已知的其它RNA洗脱溶 液。例如，可使用Gentra固定相RNA洗脱液(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis， MN)。

固相载体

多种固相载体可用于本发明中。合适的固相载体包括例如基于二氧化硅的 固相载体如玻璃纤维，或其它材料如纤维素、纤维素乙酸酯、硝基纤维素、尼 龙、聚酯、聚醚砜、聚烯烃、聚偏二氟乙烯、以及它们的组合。在一些实施例 中，固相载体可装入或固定在容器中，以便进行塞状流式(plug-flow)或连续流 式DNA分离。在其它实施例中，可将固相载体材料集成为独立自持的固相载 体，如膜、盘或柱，然后将它们固定或装入适当的容器如管或平板中。在一些 实施例中，固相载体可以是纤维状或微粒状，以优化其与生物材料的接触。适 合与本发明的试剂联用的固相载体的尺寸可根据材料(如生物材料)的量而改 变。例如，可将玻璃纤维膜切成不同的大小，以用于不同量DNA的结合、纯 化和洗脱。

适合与本发明的试剂联用的固相载体的形状可以是例如片状、按规格裁剪 的圆盘、圆柱体、单根纤维或由颗粒组成的固相载体。可将固相载体的材料集 成为独立自持的固相载体，如膜、盘、或柱，然后将它们固定或装入适当的容 器中。根据需要，将固相载体装入适当的容器，如纸样形式(如Guthrie卡)、 微离心管、离心管、96孔板、腔室或筒体。一个例子是置于2mL微离心管内 的筐(basket)内Whatman D玻璃纤维膜。如果固相载体具有纤维，可将它装 入合适的容器以适当地包扎纤维以利于核酸的结合和洗掉污染物如蛋白质、磷 脂等。

在一些例子中，可使用RNA酶溶液预处理固相载体，以将样品(如生物 样品)中存在的RNA降解。在其它例子中，可使用经RNA酶处理的柱(如 Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN提供的那些)来改善纯化。经RNA酶 处理的柱将样品(如生物样品)中存在的RNA降解。此外，使用预处理的柱 不需要某些DNA分离方法中所必需的另外的RNA酶消化步骤。在一些RNA 分离实施例中，可直接将DNA裂解溶液加到用于制作固相载体的材料(如纤 维等)中，并让其干燥，然后将所述材料制成最终的使用者可直接使用的状态 (如纸、拭子(swab)、圆盘、塞子、柱等)。

纯化/分离方法

本发明还提供从已保存在稳定剂中的材料(如生物材料)(“稳定化的样 品”)中纯化DNA、RNA或两者的方法，其中所述稳定剂包括商品名为 Paxgene^TM、RNAsafer、RNAlater和Tenpus^TM溶液的试剂。本发明的试剂和 固相载体适用于交相改变的多种分离方法。

在一些实施例中，在稳定剂的存在下将稀释剂加到生物材料中，以便在进 一步纯化经稳定化的样品之前制得裂解物。

在一些实施例中，在将稳定化的样品与裂解溶液接触之前，先将它与增溶 溶液接触。在其它例子中，当稳定剂完全裂解和溶解样品中的核酸时，可能不 再需要增溶溶液。

在一些实施例中，可将裂解溶液和增溶溶液合并。

在一些例子中，在稳定化的样品与固相载体接触前，先将裂解溶液与该样 品接触。裂解溶液用来裂解材料(如生物材料)，将核酸释放到裂解物中，然 后将裂解物加到固相载体上。此外，裂解溶液防止有害的酶如核酸酶的有害作 用。裂解溶液的体积可根据稳定化样品的量增加或减少。待稳定化的样品被裂 解后，就将裂解物加到固相载体上。在其它例子中，可直接将裂解溶液加到固 相载体上，从而减少了一个步骤，进一步简化了该方法。在这种实施方式中， 可将裂解溶液施加到固相载体上，让其干燥，然后将稳定化的样品与经过如此 预处理的固相载体接触。

可直接将酶如RNA酶或DNA酶直接加到固相载体以预处理该柱，或者加 到裂解溶液中以降解样品中存在的RNA或DNA污染物。使用含裂解溶液和/ 或RNA酶或DNA酶的经预处理的柱可不必进行常规方法通常必需的另外的裂 解和/或核酸酶消化步骤。

在一些DNA纯化实施例中，裂解后，可用结合溶液来增强核酸与固相载 体的结合。可通过显著提高盐浓度、脱水或两者来增强结合。

裂解和核酸结合后，可以任选地采用离心、移液操作、加压、真空等合适 方法或这些方法的组合和洗涤溶液将所有残留的生物物质除去，并使核酸留在 固相载体上。在一些例子中，可根据不同类型样品的难分离程度和样品中非核 酸生物物质的量重复该洗涤步骤。可首先通过离心除去包括蛋白质、磷脂等非 核酸类残留生物物质。这些可从固相载体上分离出未结合的污染物。洗涤步骤 除去固相载体上基本上所有的污染物，并将优先与该固相载体结合的核酸保留 下来。

接着，可使用足量的本领域技术人员周知的洗脱溶液洗脱结合的核酸。然 后可离心该固相载体，或对其进行加压或真空处理，将核酸从固相载体上释放， 然后收集到适当的容器中。

图1是描述采用本发明从样品中分离DNA、RNA或两者的流程图。在一 些实施例中，使用者可根据本发明所述的方法从样品中仅分离DNA。在另一些 实施例中，使用者可根据本发明所述的方法从样品中仅分离RNA。在一些例子 中，选择从相同样品中分离RNA和DNA两者的使用者可在样品采集后将样品 分装。在另一些例子中，选择从相同样品中分离RNA和DNA两者的使用者可 在实施增溶步骤后将样品分装。

制造品

本发明所述的试剂、方法和试剂盒提供了污染杂质极少的基本上纯且未降 解的核酸，这样该核酸可用于各种本领域技术人员周知的下游工艺。本发明内 容之一是一种试剂盒，该试剂盒包括具体的操作方案，该方案结合了本文所述 的试剂以及可选的固相载体，可用于按照本发明所述的方法从样品中纯化 DNA、RNA或两者。基本上纯且未降解的核酸是适用于后续分析的核酸，所述 分析包括但不限于核酸定量，限制性酶消化，DNA测序杂交技术如Southern 印迹等，扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基 于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(SSR或3SR)、链置换扩增(SDA)、 和转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析、以及RT-PCR、 体外翻译、Northern印迹、微阵列分析和其它RNA分析。

以下将结合本文公开的详细的实施例进一步描述本发明。提供这些实施例 来进一步产生各种特定的和阐述性的实施例和技术。但应理解，在维持在本发 明范围之内的情况下可做出许多的改变和修改。

实施例

实施例1——从PreAnalytix^TM Paxene^TM血液采集管纯化RNA

将捐献者的血液样品采集到Paxgene^TM采集管(PreAnalytiX^TM，Valencia， CA)中。基本上按照制造商的指导处理样品。在3000xg离心样品10分钟。离 心Paxgene^TM RNA采集管后所得的样品沉淀是总核酸、带负电蛋白质以及阳离 子表面活性剂Catrimox^TM的水不溶性沉淀物。洗涤该沉淀，除去主要血液产品 污染物。将5毫升的水加到沉淀中，快速涡流搅拌该样品。接着再次在3000xg 离心该管10分钟，倾去上清液，获得更纯净的沉淀。

所得样品沉淀不易于溶解在裂解溶液(6M LiCl，5％Triton X-100，5％ DGME，10mM EDTA，100mM TRIZMA，pH8.8)中，因此使用增溶溶液。将 150微升增溶溶液(38mM TRIZMA碱，12ml MTRIZNA HCl，10mM EDTA， 5％Triton X-100)加到样品中。将沉淀重悬于水或Tris中有助于尽可能地使 该沉淀溶解在裂解溶液中，但并不是所有情况都如此。例如，如果血液提供者 的蛋白质水平高或异常，此RNA分离将由于高蛋白质污染而失败。但是，将 非离子的充分相容的去污剂(Triton X-100)加到增溶溶液中将能够完全溶解该 沉淀。当将此悬浮液加到裂解溶液中时，它将使得RNA结合到固相载体上， 而不会因蛋白质污染而失败。已发现增溶溶液的缓冲液组分起到关键的作用。 Paxgene^TM RNA采集管用低pH组分保存RNA从而抑制酶性降解。本发明的 裂解溶液中RNA与固相载体的结合最佳在pH8.5-9.5之间发生。在此实施例中， 沉淀的低pH降低了增溶溶液的总pH，在一些实施方式中跌出上述最佳范围 之内，这将增加蛋白质的结合。因此，加入一定体积具有正确的结合pH的缓 冲液将吸收掉沉淀所附带的所有微量酸性残留物，确保分离成功。据此认为， 根据为了获得稳定样品而由沉淀附带的pH，增溶溶液中缓冲液的pH可能需要 调整。

将300微升的裂解溶液加到样品中，并将其与各样品混合。在此情况中， 沉淀不需要裂解，但是裂解溶解制剂(6M LiCl，5％Triton X-100，5％DGME， 10mM EDTA，100mM TRIZMA，pH8.8)有助于靶分子结合到固相载体。将10 微升的蛋白酶K溶解加到各样品中，在冰上孵育各样品15分钟。将全部样品 加到结合柱(置于2mL微离心管中的筐内Whatman D玻璃纤维膜)，以＞13000xg 离心1分钟。将400微升洗涤溶液I(5M LiCl，55％乙醇)加到各样品中，以 ＞13000xg离心各样品2分钟。接着，加入50微升DNA酶洗涤溶液，在室温孵 育各样品15分钟。加入200微升DNA酶洗涤溶液(30％乙醇，3.5M LiCl，50mM 柠檬酸三钠)，＞13000xg离心1分钟。再加入200微升DNA酶洗涤溶液， ＞13000xg离心各样品1分钟，接着加入200微升洗涤溶液II(70％乙醇，5mM EDTA，100mM Tris，pH7)，＞13000xg离心1分钟。重复最后这一步骤一次。 最后，将50微升DEPC处理的水加到柱中，洗脱RNA。

为了测试采用上述方法获得的RNA的品质，将纯化和重悬浮的RNA加载 到1％琼脂糖凝胶上进行分离。采用上述方法获得的RNA是完整的，基本上不 含DNA。

实施例2——从PreAnalytix^TM Paxene^TM血液采集管纯化DNA

将捐献者的血液样品采集到Paxgene^TM采集管(PreAnalytiX^TM，Valencia， CA)中。基本上按照制造商的指导处理样品。在3000xg离心样品10分钟。离 心Paxgene^TM RNA采集管后所得的样品沉淀是总核酸、带负电蛋白质以及阳离 子表面活性剂Catrimox^TM的水不溶性沉淀物。洗涤该沉淀，除去主要血液产品 污染物。将5毫升的水加到沉淀中，快速涡流搅拌该样品。接着再次在3000xg 离心该管10分钟，倾去上清液，获得更纯净的沉淀。

将100微升的增溶溶液(38mM TRIZMA碱，12mM TRIZMA，10mM EDTA， 5％Triton X-100，2μl 4mg/mL RNA酶A)加到样品中。涡流搅拌该样品以增 溶。将200微升的裂解溶液(6M LiCl，5％Triton X-100，5％DGME，10mM EDTA，100mM TRIZMA，pH8.8)和10微升蛋白酶K溶液加到样品中，涡流 搅拌混合，在冰上孵育15分钟。将300微升结合溶液(10M LiCl，10％DGME， 100mM Tris)或300微升洗涤溶液I(5M LiCl，55％乙醇)加到样品中。两种 溶液都使基因组DNA结合到玻璃纤维固相载体上。用400微升洗涤溶液I(5M LiCl，55％乙醇)洗涤结合的DNA一次，用洗涤溶液II(70％乙醇，5mM EDTA， 100mM Tris，pH7)洗涤两次。接着在TE缓冲液(Tris-EDTA)中洗脱DNA。

为了测试采用上述方法获得的DNA的品质，将纯化和重悬浮的DNA加载 到1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

总的来说，结果证明可采用本发明的方法从用PreAnalytiX^TM的Paxgene^TMRNA采集管采集的单管血液中制得DNA和RNA。

实施例3——从Applied Biosystems Tempus^TM血液采集管纯化RNA

从捐献者抽取3毫升血液到Tempus^TM管中，在＜25℃混合。按照制造商的 指导进行操作：将样品倒入50mL管中，用3毫升磷酸盐缓冲液(PBS)稀释， 涡流搅拌混合，然后4℃、2000xg离心30分钟。

所产生的沉淀不容易看到，但可直接溶解在裂解溶液中，并可被直接加到 玻璃纤维固相载体上而不要任何其它结合试剂。加入300微升的裂解溶液(6M LiCl，5％Triton X-100，5％DGME，10mM EDTA，100mM TRIZMA，pH8.8， 加3uL TCEP)溶解该沉淀，涡流搅拌60秒。将样品加到结合柱上，3000xg 离心60秒。将样品转移到新的管中。加入400微升洗涤溶液I于3000xg离心 30秒来洗涤RNA。Tempus^TM采集管技术不需要各种DNA酶处理。因此，加入 200微升的洗涤溶液II并在3000xg离心30秒洗涤样品。加入200微升洗涤溶 液II，在3000xg旋转样品120秒。加入50微升无RNA酶的水来洗脱RNA， 在3000xg旋转样品1分钟。

这一方案产生的总RNA得率等于或好于相同体积的血液用EDTA管或 Paxgene采集管采集、按实施例1和2的方法分离，或者用Paxgene^TM的用于 血液的RNA纯化方法所得的得率。

实施例4——用乙醇从Applied Biosystems Tempus^TM血液采集管纯化RNA

从捐献者抽取3毫升血液到Tempus^TM管中，在＜25℃混合，该管含有约6 毫升的Temous^TM稳定化试剂。在室温下孵育样品约2小时。然后将样品移注到 50mL管中，加入3毫升95％乙醇，得到约12毫升的总体积。涡流旋搅拌约 120秒，然后6000xg离心30-60分钟。倾去上清液，倒置该管约120秒，以 使细胞沉淀干燥。

加入300微升裂解溶液(6M LiCl，5％Triton X-100，5％DGME，10mM EDTA，100mM TRIZMA，pH8.8，加3μL TCEP)来溶解沉淀，涡流搅拌60 秒。将样品加到结合柱上，3000xg离心60秒。将样品转移到新的管中。加入 400微升洗涤溶液I，于3000xg旋转1200秒来洗涤RNA。加入50微升DNA 酶(25U/50μL)，在室温孵育约15分钟。接着加入200微升DNA酶洗涤溶液 (3.5M氯化锂、50mM柠檬酸钠和30％乙醇)，3000xg离心该管60秒。倾去 上清液，加入200微升洗涤溶液II，3000xg离心60秒。加入200微升洗涤溶 液II，3000xg离心样品120秒。加入50微升洗脱溶液(无核酸酶的水，或者 经焦碳酸二乙酯处理的水或10mM Tris、0.1mM EDTA，pH7.5)，洗脱RNA， 3000xg离心样品1分钟。

图2显示，在最初的稀释步骤中加入乙醇来代替PBS(实施例3)可以较 低的离心转速回收到产率高得多的RNA。PBS中的最大得率需要5500xg的离 心速度，而现在在乙醇中以3000xg的离心速度就可获得近似的产率。3000xg 的离心速度在实验室中普遍得多。

本发明还对在本方法中作为稀释剂的不同浓度的醇进行了测试。结果显示 在图3中。图中显示了使用不同浓度的醇作为稀释剂使所获得的产率。所有的 管都具有以下组分：

3毫升全血

6毫升Tempus^TM管稳定化试剂

3毫升稀释剂

以使用PBS和较快的5500xg离心的结果作为基线，可以看到，当稀释在 100％乙醇或100％甲醇中时，以较低的离心速度就可获得相似的RNA产率。 某些实施方式选用乙醇，因为它在生物技术实验室中更常见。高浓度的异丙醇 易于形成沉淀，因为不适用于本发明的分离。

许多试剂级的制剂掺以5％甲醇和/或5％异丙醇使之不成其为酒精饮料， 籍此避免申领酒牌和缴纳酒税(liquor licensing and taxation)。可购得的许多 乙醇制品也是95％浓度(其余是水)的而非100％。实验室常见的也是70％ 的乙醇。图4所示的图显示，任何这些微小的制剂差别都没有产生影响。

已描述了大量的本发明实施方式。然而，应理解的是在不偏离本申请的精 神和范围的情况下可做出各种变动。因此，其它实施方式也在本发明权利要求 的范围之内。