不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法

摘要

本发明涉及不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，属于分子生物学领域。用标记引物DBC16扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩出252bp的晚抽薹LB片段，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。本发明对不结球白菜晚抽薹系Y5及早抽薹系P120进行SSR分子标记的筛选，获得不结球白菜晚抽薹基因的一个标记晚抽薹LB。通过本发明提供的分子标记，可有效开展不结球白菜晚抽薹品种的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程，生产上可用于对不结球白菜晚抽薹品种的纯度鉴定。

说明书

一、技术领域

本发明涉及不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，属于分子生物学领域，涉 及不结球白菜晚抽薹系的分子育种，专用于不结球白菜晚抽薹基因品种的筛选和鉴 定。

二、技术背景

不结球白菜(Brassica campestris.ssp.chinensis.Makino)又名小白菜、青菜、油菜，是 我国长江中下游及其以南地区的一种四季栽培的蔬菜，近年来在我国北方也有较大 面积的引种栽培和推广。但由于抽薹早，其产量和质量都有明显的下降，因此，晚抽薹 成为不结球白菜的重要育种目标。

Hidetoshi等利用分离组群法BSA(bulked segregant analysis)对散叶大白菜的抽薹 性状进行QTL鉴定和定位，发现了1个与控制抽薹性状紧密连锁的RAPD标记- RA1255(530bp)，并将该基因定位于BN007-1上。

SSR标记是以SSR多态性为基础的遗传标记，已广泛应用于遗传图谱构建、品 种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域。本发明采用BSA 方法和SSR技术，筛选与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的标记，以实现不结球白 菜晚抽薹性状的标记辅助育种，加速我国不结球白菜晚抽薹性品种的选育进程。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是：筛选出一个或几个与不结球白菜晚抽薹基因紧密 连锁的分子标记，这些分子标记用于不结球白菜辅助选择育种和品种鉴定，可大大 提高不结球白菜晚抽薹系的选择鉴定效率。

技术方案本发明的实施方案如下：

不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，其特征在于：

用标记引物DBC16，

DBC16+：5’-AAAGTCGTGGGAAGTATCGT-3’，

DBC16-：5’-AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT-3’

扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩增出252bp的晚抽薹 LB片段，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。

有益效果：本发明选用的是不结球白菜晚抽薹系和早抽薹系为材料开展不结球 白菜晚抽薹分子标记的筛选。与目前技术相比，其优点是：

(1)标记稳定。本研究采用标记稳定的SSR，其标记带型简单，记录的条带一 致，还具有实验程序简单等优点。

(2)辅助选择方便，节约成本。不结球白菜晚抽薹系的常规选育方法周期长， 成本高，费时又费力。通过本发明筛选出的与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的分 子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜晚抽 薹系的选择效率，从而加快育种进程。

(3)本发明提供的分子标记，生产上可用于对不结球白菜晚抽薹品种的纯度鉴 定。

四、附图说明

图1父母本及F₁、F₂代DNA的提取

泳道1～3分别为P₁、P₂、F₁，泳道4～6为F₂单株。

图2亲本间的多态性筛选

M为分子量marker，A为引物DBC1，B为引物DBC12，C为引物DBC18，→ 代表亲本间的差异条带。

图3特异引物的扩增结果

M为分子量marker，A为母本，B为父本，C为F₁代。

图4连锁标记对F₂代单株的扩增结果

M为分子量marker，1～18为晚抽薹单株，19～36为早抽薹单株，→代表特异 带。

五、具体实施方式

利用SSR等分子标记技术寻找与晚抽薹基因连锁的标记，为定位及克隆这些 基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标记辅 助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。目前 国内外在不结球白菜晚抽薹基因分子标记方面研究较少。

本发明的实施程序是：

(一)材料与方法  不结球白菜晚抽薹系Y5，即上海四月慢和早抽薹系P120， 即南京矮脚黄，(见参考文献：曹寿椿，李式军.白菜地方品种的初步研究II.主要生 物学特性的研究.南京农学院学报，1981，(1)：1～11)，这两个自交系来自南京农业 大学白菜课题组。晚抽薹系、早抽薹系和杂交F₁代及自交F₂代148株进行田间抽薹 期调查、分子标记的筛选及连锁分析。

(二)分子标记分析  主要利用SSR标记。

采用CTAB法(见参考文献：M.G.Murray，W.F.Thompson.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321～4325)，提取(提 取方法见参考文献：史公军，侯喜林.不结球白菜RAPD反应体系的优化.江西农业大 学学报，2004，26(1)：1～5)不结球白菜晚抽薹系Y5和早抽薹系P120及F₁、F₂的单株 DNA(见图1)。

首先用182对特异引物(引物序列105对来源崔秀敏，侯喜林，董玉秀.ISSR-PCR和 链亲和素磁珠吸附法开发白菜SSR引物.园艺学报，2006，33(1)：155～157；引物54对来 源Suwabe K，Tsukazaki H，Iketani H et al.Identification of two loci for resistance to clubroot(Plasmodiophora brassicae Woronin)in Brassica rapa L.2003，107：997～1002 等，由上海英骏生物技术有限公司合成)对不结球白菜晚抽薹系和早抽薹系的DNA 多态性进行初步分析。在PTC-100^TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL， 其中10×PCR buffer 1.0μL，引物(100ng/μL)1.0μL，dNTP(2.5mmol/L)0.8μL， Mg²⁺(25mmol/L)0.8μL，DNA(60ng)0.5μL，Taq酶(2.5U/μL)0.1μL，ddH₂O 5.8μ L。PCR反应程序为：95℃2min；94℃ 40S，57℃45S，72℃1min；32个循环；72℃ 延长7min。PCR产物在8％的的变性聚丙烯酰胺凝胶200V电压电泳2h左右。电泳后， 用含10％乙醇、0.5％乙酸200ml的ddH₂O固定12-20min；然后用ddH₂O洗一次，放入 200ml0.2％AgNO₃中银染12-20min；用ddH₂O洗两次，倒入200ml(1.5％NaOH+0.4％甲 醛+1％NaS₂O₃)ddH₂O中显色10-12min，显色后可进行拍照，筛选出在不结球白菜晚抽 薹基因系和早抽薹系间的多态性片段(见图2)。

(三)结果与分析

分子标记筛选结果表明，1个SSR标记与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁，扩 增出(252bp)的片段晚抽薹LB(见图3)。

该标记引物为DBC16

DBC16+：5’-AAAGTCGTGGGAAGTATCGT-3’，

DBC16-：5’-AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT-3’

即用引物DBC16扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩增出 (252bp)的片段晚抽薹LB，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。通过对不结 球白菜晚抽薹系、早抽薹系杂交和自交得到的F₂代148个单株田间调查结果和分子 标记图谱数据进行连锁分析(分析软件MAPMAKER(Version 3.0))，发现所筛选到的 标记与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁(见图4)，连锁距离为5.7cM。筛选到的不 结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可有效开展不结球白菜晚 抽薹系的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程，生产上可用于对不结球白 菜晚抽薹品种的纯度鉴定。