在非水极性溶剂中增加溶解度的10－羟基喜树碱类化合物的药物制剂

摘要

本发明涉及一种增加非水极性溶剂中10－羟基喜树碱类化合物溶解度的药物制剂，其中包含10－羟基喜制碱化合物以及pKa值为7.4或更高的胺类化合物，使用本发明制剂能增加10－羟基喜树碱化合物在非水极性溶剂中溶解度，同时还能维持10－羟基喜树碱化合物的活性内酯形式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物制剂，其中包含10-羧基喜树碱类化合物以及其pKa值为7.4或更高的胺类化合物，其在非水极性溶剂中增加10-羟基喜树碱化合物的溶解度。

背景技术

喜树碱；(S)-4-乙基-4-羟基-1H-吡喃[3’，4’：6，7]中氮茚[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮是原型物DNA拓扑异构酶I抑制剂，并且已知是一种强抗癌药物。喜树碱具有一个标准的结构，即在包含环A至环E的五个相连的环的中央结构的C20位上被羟基和乙基取代，如下图式1所示。

式1

喜树碱化合物在水和例如乙醇、二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂中的溶解度都很低，而这些溶剂均是制剂中常用的溶剂。此外，喜树碱能在酸性环境中被活化，因为其E环以内酯的形存在；反之其在碱性水溶液中喜树碱却是无活性的，因为此时其E环是以不活泼的羧基负离子的形式存在。非活化形式的羧基负离子在水中的溶解度是4mg/ml或者更高，但是活化的内酯形式在水中的溶解度不超过10μg/ml。

特别的是，在A环的10位有一个酚羟基的10-羧基喜树碱(式1a 化合物)在pH值为8到12的碱性溶液中发生电离，因而喜树碱化合物在极性溶剂中的溶解度得以增加。然而，如果前述碱性溶剂是水溶液的话，氢氧根离子会进攻喜树碱化合物的内酯环，从而形成式2结构的羧基负离子形式的喜树碱化合物，被转化成非活性形式(见反应方程式1)：

[反应方程式1]

如上所示，喜树碱化合物具有很强的抗癌活性，但是其在抗癌治疗中的应用因活化形式的喜树碱化合物在水中的溶解度很低而受到限制。因此，为了将喜树碱化合物用作一种治疗疾病的药物，这就需要增加喜树碱化合物在溶剂中的溶解度同时又保持其内酯结构，即活化的形式。

例如，7-乙基-10-羟基喜树碱(式1b化合物)也被称为SN-38，它是市场上已有的抗癌剂依利替康(CPT-11)的一个活性代谢产物。

[式1b]

已知SN-38杀灭细胞是通过结合参与细胞分裂过程的拓扑异构酶I，并在细胞分裂中抑制DNA的合成来实现的。然而，SN-38在水中的溶解度不超过10μg/ml，所以很难将SN-38开发成临床产品。因此，人们通过开发SN-38的前药从而增大SN-38在水中的溶解度得到的CPT-11已经商品化。在施用于人体后，CPT-11被肝脏或癌细胞中的羧基酯酶代谢，转化成具有抗癌效应生理活性的SN-38。然而，CPT-11在人体中转化成具有活性的SN-38的转化率只有大约2％至8％。

另一方面，人们发现SN-38抑制拓扑异构酶I的活性高过CPT-11约1000倍，SN-38的体外细胞毒性也高过CPT-11约2000倍。并且，SN-38抑制能导致腹泻的乙酰胆碱的效果远低于CPT-11，因而其导致腹泻的可能性是很低的，而腹泻是CPT-11的主要副作用。

SN-38在酸性环境中以内酯的活性形式存在，在碱性环境中以羧基负离子的非活性形式存在，这取决于水溶液的pH值。已知羧基负离子形式的SN-38在水中的溶解度是4mg/ml或更高，但是SN-38的内酯活性形式在水中溶解度不超过10μg/ml。因此，如果能将喜树碱化合物以高于临床上有效的浓度溶解同时还能维持其内酯活性形式，人们就能开发出一种优良的抗癌剂。所以，人们做了广泛的研究来增溶喜树碱化合物。例如，美国专利号US5,447,936、5,859,023、5,674,874、5,958,937和5,900,419公开了在极性有机溶剂中增溶包括SN-38在内的喜树碱化合物的组合物，如二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基异山梨醇等。然而，因为存在一些缺点，即可用于人体的溶剂的量有限以及药物会在与水混合时析出，所以将这些极性有机溶剂注射进入血管受到极大限制。同时，美国专利号US2003-215492公开了一种通过SN-38与脂质络合制成脂质体配制的组合物。其中所用的方法是通过使SN-38在pH值为8～10的水溶液中形成羧基负离子的形式并配制成脂质体，然后再使SN-38在酸性pH值的环境中形成内酯的形式。同时，张等[国际药剂学杂志(International Journal ofPharmaceutics)，270(2004)，第93-107页]公开了含有SN-38的LE-SE-38脂质体制剂，Williams等[控释杂志(Journal of Controlled Release)，91(2003)，第167-172页]公开了含有SN-38的纳米微粒制剂。

然而，仍需要开发一种以高于临床上有效浓度增溶10-羧基喜树碱同时维持其活性形式的方法。

本发明公开的内容

技术主题

本发明对开发一种以高于临床上有效浓度增溶10-羧基喜树碱同时维持其活性形式的方法进行深入研究。结果，他们证实，如果将一种pKa值为7.4或更高的胺类化合物加入10-羟基喜树碱中，碱对喜树碱化合物内酯基团的亲核进攻没有发生，因此内酯集团被保留，维持药物的活性，并且10-位羟基电离成酚负离子，使其在极性有机溶剂中的溶解度增加。因此，本发明人完成了本发明。

本发明的目标是提供一种提高10-羟基喜树碱化合物溶解度的制剂，其中包含10-羟基喜树碱化合物和pKa值为7.4及更高的胺类化合物，对非水极性溶剂而言。

实现本发明的最佳方式

首先，本发明涉及一种在非水极性溶剂中提高10-羟基喜树碱化合物溶解度的制剂，其中包含10-羟基喜树碱化合物和pKa值为7.4或更高的胺类化合物，对非水极性溶剂而言。

在本发明中，10-羟基喜树碱化合物是指所有的在喜树碱A环的10位有一个酚羟基的喜树碱化合物，如下式1a所示：

[式1a]

根据本发明的10-羧基喜树碱化合物还可以在A环9或11位、或B环7位被例如低级烷基、烷氧基、酰氧基、羟基、酰基、卤素、酰胺基、腈基等取代。本发明所述的10-羧基喜树碱化合物包括但不限于，10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)。在本发明中，10-羟基喜树碱优选SN-38。

根据本发明，如果10-羟基喜树碱化合物，例如SN-38，加入到非水极性溶剂中，同时再加上一种在碱性化合物中具有特别低的亲核性和高碱性的胺类化合物，即其pKa值为7.4或更高，，碱对喜树碱化合物内酯基团的亲核进攻没有发生，因此其内酯基团得以保留，如下反应方程式1所示。于是，在药物的活性得以保持的同时，10位羟基电离成酚负离子以增加在非水极性溶剂中的溶解度(见反应方程式2)。

[反应方程式2]

本发明中的胺类化合物能使10位羟基阴离子化，这些胺类化合物可以是任何伯胺、仲胺、叔胺，其pKa值为7.4或更高，优选为9或更高。优选的，胺类化合物选自C₁至C₂₀的羟基烷基胺、C₁至C₂₀的烷基胺、或其混合物。这些胺类化合物包括羟基烷基胺，例如：单、双或三乙醇胺，单、双或三异丙醇胺，氨基丁三醇(三(羟甲基)氨基乙烷)等；叔烷基胺，例如：三乙胺、三丙胺、三丁胺等；仲烷基胺，例如，二乙基胺、二丙基胺、二丁基胺等；或它们的混合物。优选地，羟基烷基胺，例如二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇等。

对于1当量的喜树碱化合物来说，胺类化合物可以使用的量为多于1当量，优选1至100当量，更优选为1至50当量，最优选为5至20当量。

本发明中所使用的非水极性溶剂包括被批准用于人体的有机溶剂，优选的，乙醇、丙二醇、分子量为200至1000道尔顿的液体聚乙二醇、甘油、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基异山梨醇或它们的混合物。上述非水极性溶剂的用量为能使10-羟基喜树碱的浓度优选达到0.1至5mg/ml，更优选为0.5至2mg/ml。

本发明的制剂组合物可以包括表面活性剂，用于防止当组合物被用水稀释或用水溶液例如注射用水、生理盐水、或5％右旋糖溶液复溶时，药物发生沉淀；以及通过延迟喜树碱化合物的内酯基团暴露于水溶液从而延缓内酯集团向羧基负离子的转化。

作为本发明中的表面活性剂，当本制剂组合物溶于有机溶剂中时，任何表面活性剂不论其性质和外观都是可以的。这些表面活性剂的例子包括嵌段共聚物表面活性剂，例如聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯如吐温20、吐温40、吐温80等，聚氧乙烯蓖麻油衍生物如聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL(cremophore EL)、聚氧乙烯蓖麻油甘油醚RH40(cremophore RH40)、聚氧乙烯蓖麻油甘油醚RH60(cremophore RH60)；聚氧乙烯烷基醚如聚氧乙烯20 cetosteryl醚、聚氧乙烯20鲸蜡基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯2鲸蜡基醚、聚氧乙烯2油基醚、聚氧乙烯2硬脂基醚、聚氧乙烯4月桂基醚、聚氧乙烯100硬脂基醚等；d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素ETPGS)，聚乙二醇硬脂酸酯15(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)；泊洛沙姆类如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等，优选聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，聚乙二醇硬脂酸酯15(solutol HS 15)等。

另一方面，当本制剂组合物制成冻干形式时，本发明可以使用室温下为固体的聚合物表面活性剂，嵌段共聚物如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等，或将亲水性聚合物嵌段(A)和疏水性聚合物嵌段(B)以A-B、A-B-A、B-A-B等形式连接制备的两亲性嵌段共聚物。在两亲性嵌段共聚物中，亲水性共聚物嵌段(A)是一种溶于水的聚合物，例如聚亚烷基二醇或其衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺等，优选的为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯-共-聚丙烯二醇共聚物中的一种。疏水聚合物嵌段(B)是不溶的、极好的可生物相容的和可生物降解的聚合物，这样的例子包括聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯或聚磷腈等，优选聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二氧六环-2-酮、聚丙交酯-共-乙交酯、聚丙交酯-共-二氧六环-2-酮、聚丙交酯-共-己内酯、聚乙交酯-共-己内酯等。如前述的共聚物，优选使用平均分子量为200至60,000的化合物。

相对于10-羟基喜树碱所用表面活性剂的重量比为1000或更少，优选重量比为1至500，更优选重量比为10至250。

当该制剂组合物制成冻干制剂时，还可以加入诸如甘露醇、山梨醇或乳糖等用于冷冻干燥的结块剂。

该制剂组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂，和疏水性油如生育酚、苄基苯甲酸酯、芝麻籽油、蓖麻油、大豆油、棉花籽油、甘油三酸酯等，用来在当该组合物被注射用水稀释时延缓该组合物暴露于水溶液。

制备溶液或冻干制剂形式的本制剂组合物的方法的一个具体实施方案如下所述。

将1至10mg的10-羟基喜树碱和一种胺类化合物加入到相对于喜树碱化合物1至100的比例的非水溶剂中并溶解，然后加入表面活性剂制得溶液。使用200nm孔径的过滤器过滤溶液，去除不溶物后密封。如在一个具体的例子中，将1mg SN-38和10mg氨基丁三醇加入到1ml无水乙醇中制得纯的橙色溶液。然后，加入500mg聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL制得纯溶液。该溶液用乙腈稀释，然后采用HPLC分析，确认100％的SN-38以内酯形式存在，SN-38的溶解度为98％重量或更高。同时，制得的溶液保存于冰箱中一周后以0.9％的生理盐水稀释制成5ml溶液。其后，HPLC测定SN-38并确认SN-38的浓度为220μg/ml，95％或更多的SN-38以内酯形式存在，盐水稀释后溶液的pH值为8.7。

可选地，一种10-羟基喜树碱化合物和一种胺类化合物溶于非水极性溶剂中，并加入聚合物表面活性剂后制得溶液。其后，加入一种用于冻干的结块剂制得一种冻干制剂。作为一个具体的例子，250mg聚乙二醇(分子量：2000道尔顿)和聚乳酸(分子量：1800道尔顿)的共聚物(mPEG-PLA)加入前述由SN-38和氨基丁三醇溶于无水乙醇制得的溶液中，制得纯溶液，然后加入作为用于冻干的结块剂的4ml甘露醇水溶液(100mg/ml)，用2 00nm孔径的过滤器过滤后冷冻干燥。该冻干制剂用4ml注射用水复溶后，经HPLC分析后确认SN-38的浓度为205μg/ml，92％或更多的SN-38以内酯的形式存在，水溶液的pH值为8.4。

在该制剂组合物中，喜树碱化合物能够保持活性内酯形式且该化合物在非水极性溶剂中的溶解度得到增加。作为一个具体的例子，不加入胺类化合物将SN-38混悬于无水乙醇中后测定SN-38的溶解度，只有几个μg/ml的范围。然而，当在无水乙醇中加入10当量的三乙醇胺后测定SN-38时，SN-38的溶解度大约是1mg/ml，增加了500倍或更多。同样，经HPLC分析，SN-38为内酯的形式，没有观察到羧基负离子的形式。

根据本发明所述的药学制剂能用作抗癌剂，并能在1ml溶液中含有1至40mg喜树碱化合物。具有此种浓度的溶液制剂或冻干制剂可口服或注射以治疗癌症病人。以胶囊或片剂的形式口服该制剂时，优选使用浓缩溶液，此时该制剂以未稀释的初始溶液或冻干形式使用。在注射的情况下，优选喜树碱化合物在稀释液中的浓度为约0.001至约1.0mg/ml，更优选为将该制剂组合物用水溶液如注射用水、生理盐水或5％右旋糖溶液等稀释或复溶成0.1至0.5mg/ml，pH为3至12。

下面，本发明将通过实施方案具体描述，但本发明的范围不被它们以任何形式限制。

实施例1：存在胺类化合物时SN-38在极性有机溶剂中溶解度的改善

在六个容器中分别加入1mg SN-38(制造商：Abatra Co.，中国)，用1ml无水乙醇混悬。对于1当量SN-38，分别以0、1、5、10、20和100当量向每个容器中加入二乙醇胺，加热至60℃，室温下保存12小时。12小时之后，用200nm孔径滤器过滤溶液。加入1当量或更多二乙醇胺的溶液显橙色。用HPLC分析滤液并测定SN-38的溶解度，条件如下：

[表1]

    项目    描述    柱子    VYDAC C18多环(CAT，#218MR54)    柱温    25℃    A(缓冲液)    3％v/v三乙胺(TEAA)水溶液    B(有机溶剂)    乙腈    A/B    80/20，v/v    pH调节剂    5，5(乙酸)    流动相的迁移    等度洗脱(isocratically)    流动速率    1ml/min    波长    Ex 318nm，Em515nm

SN-38以100至4000ng/ml的浓度溶于二甲亚砜(DMSO)中，从而得到标准曲线，然后定量SN-38。在二乙醇胺存在时SN-38的溶解度结果如表2所示。

[表2]

在二乙醇胺存在时SN-38在乙醇中的溶解度

分组SN-38(mg)无水乙醇(ml)对SN-38所用的二乙醇胺当量    溶解度    (mg/ml)  内酯含量  (％)对照组    2    1    0    0.008    100成分(component)1    2    1    1    0.87    99成分2    2    1    5    1.2    100成分3    2    1    10    2    100成分4    2    1    20    2    99成分5    2    1    100    2    98

如表2所示，SN-38在乙醇中的溶解度是0.008mg/ml，但是加入二乙醇胺后溶解度增加，当存在5个当量或更多二乙醇胺时其溶解度为1mg/ml或更高。

实施例2：根据胺类化合物的种类的SN-38在乙醇中的溶解度

如实施例1中所描述，将1mg SN-38混悬于1ml无水乙醇中。将下表3中所述的几种胺类化合物以10当量加入到SN-38，加热到60℃后室温保存12小时。在12小时后，用200nm孔径的滤器过滤溶液，用HPLC测定SN-38的溶解度。结果示于表3。

[表3]

根据胺类化合物的种类的SN-38在乙醇中的溶解度

分组  SN-38  (mg)  无水乙醇  (ml)    胺(10当量)  溶解度  (mg/ml)  内酯含量  (％)成分3    1    1    二乙醇胺    ＞1    100成分6    1    1    三乙醇胺    ＞1    100成分7    1    1    氨基丁三醇    ＞1    100成分8    1    1    三乙胺    ＞1    100成分9    1    1    二乙胺    ＞1    100成分10    1    1  N，N-二甲基乙醇胺    ＞1    100

如表3所示，不论是何种胺，当将10当量胺类化合物加入SN-38时，能溶解1mg/ml或更多的SN-38，100％的SN-38以内酯形式存在。

实施例3：SN-38在极性有机溶剂中的溶解度

如实施例1中所描述的，将1mg SN-38混悬于1ml如表4所示的几种有机溶剂中。加入10当量的氨基丁三醇于SN-38，加热到60℃，然后室温保存12小时。12小时后，用200nm孔径的滤器过滤溶液，HPLC测定SN-38的溶解度。结果示于表4。

[表4]

有机溶剂中SN-38的溶解度

分组  SN-38  (mg)    有机溶剂(ml)  氨基丁三醇  (当量)  溶解度  (mg/ml)内酯(％)成分3    1    无水乙醇    10    ＞1    100成分11    1    丙二醇    10    ＞1    100成分12    1    甘油    10    ＞1    100成分13    1    PEG 300    10    ＞1    100成分14    1    N-甲基吡咯烷酮    10    ＞1    100成分15    1    N，N-二乙酰胺  10    ＞1    100

如表4所示，当加入到SN-38中10当量的氨基丁三醇时，1mg/ml或更多的SN-38能溶解于所有种类的有机溶剂中，100％的SN-38以内酯形式存在。

实施例4：含表面活性剂的SN-38制剂组合物的制备

几种如表5所示的表面活性剂被加入到实施例2的成分7中，其用量为SN-38的200倍重量，制得溶液，各个成分如表5所示。

[表5]

含有表面活性剂的SN-38组合物

分组SN-38(mg)无水乙醇(ml)胺类化合物(10当量)  表面活性剂(200mg)成分16    1    1    氨基丁三醇    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL成分17    1    1    氨基丁三醇    吐温80成分18    1    1    氨基丁三醇    聚乙二醇硬脂酸酯15成分19    1    1    氨基丁三醇    维生素E TPGS成分20    1    1    氨基丁三醇    泊洛沙姆188

实施例5：根据表面活性剂含量的SN-38制剂组合物在水中的溶解度

将聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL加入到实施例2成分7中，其用量为SN-38的10至500倍重量，然后用注射用水稀释至总体积为5ml。用200nm孔径的滤器过滤该溶液后，在室温下保存该溶液的同时，测定不同时间的SN-38的含量、内酯与羧基负离子的比例、氢离子含量变化。前述制剂组合物的成分示于表6，测定结果示于表7。

[表6]

用于测定SN-38在水溶液中浓度随时间变化的组合物

分组SN-38(mg)    无水乙醇    (ml)  氨基丁三醇  (当量)聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL(mg)成分21    1    1    10    10成分22    1    1    10    50成分23    1    1    10    100成分24    1    1    10    250成分25    1    1    10    500

[表7]

在水溶液中表面活性剂对SN-38的内酯形式与羧基负离子形式比率的随时间变化的影响

分组  SN-38  (μg/ml)  稀释溶液  (pH)            内酯/羧基负离子之比    0.5hr    3hr    6hr    24hr成分21    200    8.7    99/1    90/10    48/52    43/57成分22    200    8.7    100/0    99/1    57/43    54/46成分23    200    8.6    100/0    99/1    95/5    65/35成分24    200    8.5    100/0    100/0    99/3    70/30成分25    200    8.4    100/0    100/0    100/0    70/30

如表7所示，内酯形式随时间转换成羧基负离子形式。另外，从内酯形式向羧基负离子形式转化的时间随表面活性剂含量的增加而延缓。

实施例6：可溶SN-38组合物的制备

根据表8所示的成分，SN-38混悬于有机溶剂中，然后加入胺类化合物制成橙色纯溶液。随后加入表面活性剂，用200nm孔径滤器过滤溶液，贮存于玻璃瓶中。

[表8]

可溶SN-38组合物

 SN-38胺类化合物    表面活性剂  有机溶剂 1mg氨基丁三醇10mg    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL 200mg  乙醇1ml 1mg氨基丁三醇10mg    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL 100mg  丙二醇1ml 1mg氨基丁三醇5mg    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL 100mg  PEG 300 1ml 1mg氨基丁三醇1mg    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL 250mg  N，N-二甲基酰胺  0.25ml 1mg二乙醇胺10mg    聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL 500mg  乙醇0.5ml 1mg二乙醇胺15mg    吐温80 200mg  乙醇1ml 1mg二乙醇胺20mg    维生素E TPGS 100mg  乙醇1ml 1mg三乙醇胺10mg    聚乙二醇硬脂酸酯15    50mg  乙醇1ml 1mg二乙基胺2mg    泊洛沙姆18810mg  乙醇1ml

实施例7：可溶SN-38组合物的扩大生产

500mg氨基丁三醇溶于50ml无水乙醇中，再加入50ml聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL制备纯混合溶液。在该溶液中，加入100mgSN-38并加热到60℃得到橙色纯溶液。溶液在室温下保存1小时，然后用200nm孔径的滤器过滤，每个玻璃小瓶中灌装2ml溶液，制得每瓶浓度为1mg/ml的含2mgSN-38的制剂。

实施例8：冻干的SN-38可溶组合物的制备

12mg氨基丁三醇溶于1ml无水乙醇中，再加入1mgSN-38后将该溶液加热到60℃制得橙色纯溶液。随后，加入200mg甲氧基聚乙二醇和聚乳酸的嵌段共聚物(mPEG-PLA)(mPEG分子量：2,000道尔顿，PLA分子量：1,800道尔顿)制得纯溶液。然后，加入5ml甘露醇水溶液(50mg/ml)，混合，用200nm孔径的滤器过滤，冷冻干燥得到冻干制剂。

在冻干小瓶剂中加入4ml注射用水复溶该冻干制剂。其中，水溶液pH值为8.4，经HPLC检测药物含量为242μg/ml，SN-38的内酯形式为97％。

工业实用性

本发明中的制剂用于增加10-羟基喜树碱在非水极性溶剂中的溶解度，同时能使大部分10-羟基喜树碱以其活性内酯形式存在。同时，当使用还含有表面活性剂的本发明的制剂时，在用注射用水或生理盐水稀释或复溶时该制剂中药物向非活化形式的转换被延缓。