白眉蝮蛇去整合素定点突变体cDNA的克隆、表达及其蛋白质制法与应用

摘要

本发明涉及生物领域。白眉蝮蛇去整合素定点突变体cDNA的克隆、表达及其蛋白质制法与应用，白眉蝮蛇蛇毒突变体蛋白质的cDNA序列将白眉蝮蛇去整合素cDNA序列中A145、T146、G148突变成C145、C146和A148，得cDNA含219个碱基对，与相应的蛋白质序列及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达，制备方法简单易操作，从白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT－PCR的方法反转录出总cDNA，对其进行定点突变得到一条长度为219bp的多核苷酸序列。还提供一个大肠杆菌BL21和毕赤酵母菌中成功表达的分子量约为8000的小分子量蛋白质。此蛋白质具有显著的抗血管生成作用，而无抑制血小板聚集作用。其在抗肿瘤的药物中的应用，具有较高的安全性及较低的副作用，具有更高的应用价值。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别涉及到白眉蝮蛇去整合素。

背景技术：

抑制恶性肿瘤血管生成是抑制肿瘤生长和肿瘤转移的关键步骤。肿瘤在1mm³以上时，其营养来源不能单靠周围体液的渗透，必需依赖血管的供应，否则肿瘤将退化。如果用药物抑制肿瘤的血管生成，则肿瘤便不再生长，并进一步发生凋亡，不能对机体造成危害。抗肿瘤血管生成治疗有诸多优点，主要是①肿瘤发生时，血管形成已被启动，故具有较高的特异性；②血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，剂量小、疗效高、不良反应小；③内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。国内外虽有一些抑制恶性实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前国内仅有内皮抑素问世。内皮抑素的作用机制是通过抑制内皮细胞的增殖。中国专利CN1487081公开了一种白眉蝮蛇的毒腺中克隆出具有抗肿瘤血管生成的去整合素，此蛋白质含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性，但也抑制血小板的聚集。目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系研究的Saxatilin、我国台湾学者从Calloselasna rhodostoma提取纯化(不是基因重组)出的rhodostomin均具有抗肿瘤血管生成和抗血小板聚集的双重作用。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为albolabrin，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接从蛇毒中提取的。抗血小板聚集作用可以引起出血倾向，是蝮蛇去整合素用于抗肿瘤血管生成时的副作用，此副作用对于人体影响较大，需设法去除其抗血小板聚集作用，使之专一具有抗肿瘤血管生成作用，增加此蛋白质作为药物治疗的安全性，但目前的蛋白质难以实现。

发明内容：

本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA克隆，以及由其表达的蛋白质，此蛋白质仅具有抗血管生成作用而无抗血小板聚集作用；另外涉及蛋白质的制法，方法简单易操作，蛋白质应用效果较佳。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA序列，将白眉蝮蛇去整合素cDNA序列中A145、T146、G148突变成C145、C146和A148，得cDNA含219个碱基对，核苷酸序列为：

GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA  50

TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT 100

GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGCCAACA 150

AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC 200

CAGAAATCCC TTCCATGCC                                   219

所述白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质由73个氨基酸组成，其中Ile49和Ala50被Pro49和Thr50所取代，氨基酸顺序如下：

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys Asp

  1              5                  10                  15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly Leu Cys

         20                 25                  30

Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg Pro Thr Arg

35                  40                  45                  50

Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala Gly Cys Pro Arg

            55                  60                  65

Asn Pro Phe His Ala

    70

白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质的制备：将白眉蝮蛇去整合素cDNA的A145、T146、G148突变成C145、C146和A148，将带有定点突变的cDNA分别构建于质粒pET23b和pPIC9K，将质粒转化入微生物，得到其编码的蛋白质。

白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质的制备，具体步骤为：

第一步：制备含有白眉蝮蛇野生型去整合素cDNA的重组质粒pET23b-dis

a.将活白眉蝮蛇断头处死，分离毒腺，迅速打碎，提取总RNA；

b.反应液中加入RNA PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA，采用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR反应；

c.以反转录反应得到的cDNA为模极进行PCR反应：反应混合物中含有PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合物、MgCl₂、Taq酶和引物，引物为：

P1：5’-TTATGCATATGGAGGCCGGAGAAGAATG-3’

P2：5-TTATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3’

d.PCR扩增产物克隆入载体pET23b：将Nde I和Hind III双酶切片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中，并在大肠杆菌DH5α中扩增；

第二步：对野生型去整合素进行定点突变，获得带有突变点的cDNA片段，并构建于载体pET23b中

a.设计引起点突变的引物：

P3：5’-AGTATGCCGGCCAACAAGGGGTGATG-3’

P4：5’-ACCCCTTGTTGGCCGGCATACTGTTC-3’

b.以T7启动子/引物P4，引物P3/T7终止子为引物分别进行PCR扩增，得到片段长度分别约270bp和170bp的两个片段，

T7启动子：5’-TAATACGACTCACTATA-3’

T7终止子：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

c.以两个PCR产物为模板，以T7启动子/T7终止子为引物进行PCR扩增，得到的产物约420bp；

d.将420bp片段和载体pET23b质粒分别进行Nde I/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收相应片段，再用连接酶连接，得到含有定点突变目的基因的质粒pET23b-mutant；

第三步：将突变体构建于毕赤酵母表达载体pPIC9K中

a.设计引物以获取含有定点突变的目的基因片段，设计引物：

P5：5’-CGGAATTCGAGGCCGGAGAAGAATGTGA-3’

P6：5’-TTGCGGCCGCGGCATGGAAGGGATTTCTGG-3’

以上述得到的pET23b-mutant为模板，利用引物P5/P6进行PCR扩增，反应混合液中含有PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合液、Taq DNA多聚酶，PCR产物为约220bp；

b.分别对PCR扩增的约220bp片段和载体pPIC9K进行EcoR I/Not I双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用连接酶进行连接，得到含有目的基因突变体的酵母表达质粒pPIC9K-mutant。

第四步：载有目的基因突变体的质粒向微生物的转化

(1)pET23b-mutant向大肠杆菌BL21的转化

a.利用氯化钙法将pET23b-mutant转化入大肠杆菌BL21中；

b.阳性转化子的筛选采用双酶切法进行；

c.细菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养，以IPTG为诱导剂进行诱导表达，表达的蛋白质为可溶性产物；

d.重组蛋白质的纯化采用Novagen公司的组氨酸亲和层析法，得到电泳均一的蛋白质；

(2)pPIC9K-mutant向毕赤酵母GS115的转化

a.利用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K-mutant质粒转化入毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115；

b.在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选；得到对G418有抗性的菌株，对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的蛋白质；

c.对甲醇诱导产生并分泌到培养液中的蛋白质进行纯化：先后用DEAE-Sepharose FF和Butyl Sepharose FF对表达产物进行纯化，得到电泳纯产品。

白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质在抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果是，从白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT-PCR的方法反转录出总cDNA，利用我们设计的引物，得到了一条特异的cDNA序列，重要的是，对其进行定点突变得到一条长度为219bp的多核苷酸序列。还提供一个大肠杆菌BL21和毕赤酵母菌中成功表达的分子量约为8000的小分子量蛋白质。此蛋白质具有显著的抗血管生成作用，而无抑制血小板聚集作用。在其抗肿瘤的药物应用中，具有很高的安全性及极低的副作用，具有更高的应用价值。

附图说明：

图1为不同剂量本发明蛋白质作用于鸡胚绒毛尿囊膜，血管变化图。

图2为本发明蛋白质对C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤B16生长的抑制图。

图3为本发明蛋白质对bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞管样物形成的抑制作用图。

图4为本发明蛋白质对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的抑制作用图。

图5为人体血小板聚集曲线图。

具体实施方式：

实施例

白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA序列，将白眉蝮蛇去整合素cDNA序列中A145、T146、G148突变成C145、C146和A148，得cDNA含219个碱基对，核苷酸序列为：

GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA  50

TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT 100

GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGCCAACA 150

AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC 200

CAGAAATCCC TTCCATGCC                                   219

白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质由73个氨基酸组成，其Ile49和Ala50被Pro49和Thr50所取代，氨基酸顺序如下：

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys Asp

 1               5                  10                  15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly Leu Cys

        20                  25                  30

Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg Pro Thr Arg

35                  40                  45                  50

Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala Gly Cys Pro Arg

            55                  60                  65

Asn Pro Phe His Ala

        70

上述蛋白质是按下述方法克隆与表达：

第一步：制备含有白眉蝮蛇野生型去整合素cDNA的重组质粒pET23b-dis。

a.将旅顺产的活白眉蝮蛇断头处死，分离毒腺并放入液氮中冻存，迅速打碎，按常规方法，如宝生物工程公司提供的方法提取总RNA。

b.采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR：其基本要点是：反应液中加入RNA PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA，反应总量20μl，进行反转录反应。

c.以反转录反应得到的cDNA为模板进行PCR反应：反应混合物中含有PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合物、MgCl₂、Taq酶和引物，反应总体积60μl，引物为：

P1：5’-TTATGCATATGGAGGCCGGAGAAGAATG-3’

P2：5-TTATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3’

d.PCR扩增产物克隆入载体pET23b：将Nde I和Hind III双酶切片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中，并在大肠杆菌DH5α中扩增。

第二步：对野生型去整合素进行定点突变，获得带有突变点的cDNA片段，并构建于载体pET23b中：

a.设计引起定点突变的引物。

P3：5’-AGTATGCCGGCCAACAAGGGGTGATG-3’

P4：5’-ACCCCTTGTTGGCCGGCATACTGTTC-3’

b.以T7启动子/引物P4，引物P3/T7终止子为引物分别进行PCR扩增，得到片段长度分别约270bp和170bp的两个片段。

T7启动子：5’-TAATACGACTCACTATA-3’

T7终止子：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

c.以两个PCR产物为模板，以T7启动子/T7终止子为引物进行PCR扩增，得到的产物约420bp。

d.将420bp片段和载体pET23b质粒分别进行Nde I/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收相应片段，再用连接酶连接，得到含有定点突变目的基因的质粒pET23b-mutant。

第三步：将突变体构建于毕赤酵母表达载体pPIC9K中：

a.设计引物以获取含有定点突变的目的基因片段，设计引物：

P5：5’-CGGAATTCGAGGCCGGAGAAGAATGTGA-3’

P6：5’-TTGCGGCCGCGGCATGGAAGGGATTTCTGG-3’

以上述得到的pET23b-mutant为模板，利用引物P5/P6进行PCR扩增：反应混合液中含有PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合液、Taq DNA多聚酶，PGR产物为约220bp。

b.分别对PCR扩增的约220bp片段和载体pPIC9K进行EcoR I/Not I双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用T4连接酶进行连接，得到含有目的基因突变体的酵母表达质粒pPIC9K-mutant。

第四步：载有目的基因突变体的质粒向微生物的转化：

(1)pET23b-mutant向大肠杆菌BL21的转化

a.利用氯化钙法将pET23b-mutant转化入大肠杆菌BL21中；

b.阳性转化子的筛选采用双酶切法进行；

c.细菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养，以IPTG为诱导剂进行诱导表达，表达的蛋白质为可溶性产物；

d.重组蛋白蛋白质的纯化采用Novagen公司的组氨酸亲和层析法。得到电泳均一的蛋白质。

(2)pPIC9K-mutant向毕赤酵母GS115的转化：

a.首先通过酶切将pPIC9K-mutant线性化，然后利用电穿孔技术将含有目的基因的线性化pPIC9K-mutant质粒转化入毕赤酵母菌Pichia pastorisGS115。

b.在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选。得到对G418有抗性的菌株，对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的蛋白质。

c.对甲醇诱导产生并分泌到培养液中的蛋白质进行纯化，先后用DEAE-Sepharose FF和Butyl Sepharose FF对表达产物进行纯化，得到电泳纯产品。

下面结合具体的实验模型来证明本发明蛋白质的显著特性(对肿瘤血管生长显示出显著的抑制作用)：

实验1.体内血管生成实验采用7日龄鸡胚绒毛尿囊膜模型：

首先用bFGF绣导血管新生24小时后，用不同剂量蛋白质作用于鸡胚绒毛尿囊膜，实验结果如图1所示，图中所示血管明显的减少和断裂，说明本发明蛋白质具有显著的抑制血管生成的作用。

实验2.蛋白质对C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤B16生长的抑制作用：

向小鼠背部注射2×10⁵的黑色素瘤细胞，4天后皮下主射本发明蛋白质1mg/kg体重，如图2及下表所示，对各组瘤体大小与重量的方差分析表明，荷瘤对照组(生理盐水)与环磷酰胺阳性对照组及注射蛋白质组差异显著；而环磷酰胺阳性对照组及注射蛋白质组的差异不显著，表明本发明蛋白质对接种于C57BL/6小鼠的黑色素实体瘤的生长具有显著的抑制作用，并且有效程度与传统抗肿瘤药物环磷酰胺相当。存活实验结果表明，注射环磷酰胺与蛋白质的组别平均生存期比阴性对照组延长一周左右。

表  蛋白质对荷瘤小鼠肿瘤重量及体积的影响(平均值±标准差)

组别动物数    瘤重(g)  瘤体积(cm³)生理盐水对照组蛋白质治疗组1.25mg/kg环磷酰胺对照组1.00mg/kg 10 10 10  3.74±0.90  0.31±0.33^***▲  0.13±0.15^***  5.62±1.43  0.40±0.46^***▲  0.08±0.12^***

注：蛋白质组与NS对照组相比***p＜0.001；与环磷酰胺对照组相比▲p＞0.05

实验3.体外血管生成实验：

利用人工基质膜做支持物，检测蛋白质对bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞管样物形成的抑制作用，实验结果如图3所示，表明蛋白质可显著抑制ECV304细胞在人工基质膜上的血管样结构的形成。

实验4.蛋白质对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的抑制作用：

姬姆萨染色法测定本发明蛋白质对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的抑制作用。结果如图4所示，在本发明蛋白质作用下，细胞间连丝渐失、细胞发泡、染色质浓缩并靠近核膜，并呈致密浓染状。表明蛋白质可促进人脐静脉内皮细胞株ECV304的细胞凋亡。

实验5.人血小板聚集实验：

利用人富血小板血浆中加入致凝剂，血小板发生聚集，血浆浊度降低，透光度增加，仪器将此光浊度的变化记录在纸上，形成血小板聚集曲线，如图5、图6所示。从曲线图中可见，本发明蛋白质对血小板聚集无抑制作用。以上所有实验有效地证明，本发明经过定点突变的蛋白质具有显著地抑制肿瘤血管生成作用，且对血小板聚集无抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110>赵，宝昌

<120>白眉蝮蛇去整合素定点突变体cDNA的克隆、表达及其蛋白质制法与应用

<130>20071055

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>219

<212>DNA

<213>abdomen

<220>

<221>allele

<222>(145)..(145)

<220>

<221>allele

<222>(146)..(146)

<220>

<221>allele

<222>(148)..(148)

<400>1

gaggccggag aagaatgtga ctgtggctct cctggaaatc cgtgctgtga tgctgcaacc     60

tgtaaactga gacaaggagc acagtgtgca gaaggactgt gttgtgacca gtgcagattt    120

atgaaaaaag gaacagtatg ccggccaaca aggggtgatg acatggatga ttactgcaat    180

ggcatatctg ctggctgtcc cagaaatccc ttccatgcc                           219

<210>2

<211>73

<212>PRT

<213>abdomen

<220>

<221>MUTAGEN

<222>(49)..(50)

<400>2

Gly Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys

1               5                   10                  15

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg

        35                  40                  45

Pro Thr Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala

    50                  55                  60

Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala

65                  70