检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头及其制备方法

摘要

本发明涉及一种检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头及其制备方法，属于环境监测技术领域。探头包括套管、发光细菌凝胶和光纤，所述的发光细菌凝胶置于套管内的端部，所述的光纤插入发光细菌凝胶中。制备方法为首先将发光细菌接种于细菌培养基中，将经培养的菌液加入已经溶解的凝胶溶液中，将含有菌业的凝胶溶液填充入套管，将套管浸入固化液中，得到圆柱型发光细菌凝胶块待用；沿套管中心插入光纤，将圆柱型发光细菌凝胶推入套管中。本发明探头采用价格低廉的塑料光纤作为传光元件和套管式结构，由探头构建的发光细菌光纤传感器，可用于湖泊、河流、水厂等有毒化学污染的快速监测，结构简单，操作方便，成本低，可快速进行野外分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头及其制备方法，属于环境监测技术领域。

背景技术

生物毒性检测是利用活的生物体来检测环境中的有毒化学污染情况，该方法比一般的化学、物理检测更能得到一个直接的检测结果。经过几十年不断的完善，生物毒性试验方法是目前可普遍接受的经典的毒性检测方法。其中，发光细菌测试法具有生长迅速、周期短、费用低等特点，能在短时间内得到可靠的毒性资料而被用作毒性检测的指示生物。发光细菌生物传感器是根据这一原理建立的分析器件。

为了能够针对野外现场随机分布采样点实现即时检测，研究者们开发了一些微型化集成检测系统，使得传感器结构更加紧凑和小巧。如1998年美国的橡树林国家实验室和田纳西大学联合研制了一种生物发光集成电路，将整个仪器缩小到了电路板上。韩国的研究机构2002年研制了一种微腔式发光细菌传感器，该传感器采用冻干法把发光细菌储存于微腔中，检测时需要复苏冻干的细胞。2006年开发了一种带有微型流动池的发光细菌芯片，利用PVA-SbQ凝胶通过长波紫外线照射法将发光细菌固定于微通道上。法国南特大学开发的卡片式发光细菌传感器，将发光细菌利用琼脂固定于一个可拆卸的卡片中。使用时将卡片安装于流动注射系统和微弱光检测仪上。研究者将不同类型的发光细菌通过冻干法固定于96孔微量滴定板上，检测时将微孔板置于水中反应30分钟，检测各个孔的发光强度来反映毒性。

上述结构的发光细菌探头在使用中存在成本高或者需要复杂配套仪器等问题。为了能够实现野外使用的便携式发光细菌传感器，必须满足以下几个要求：1、细菌必须在储存和运输到现场的过程中不丧失活性；2、该探头检测必须具有较短的检测时间；3、在检测结构中对毒性响应产生的生物发光与环境中的光之间的互相影响必须最小化；4、对于缺少预处理的真实样品检测，便携式传感器的操作必须简单。

发明内容

本发明的目的是提出一种检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头及其制备方法，将发光细菌的活化与毒性响应过程结合在一起，在毒性测试中可以直接把探头放入待测水样，使毒性测试操作简单、方便。

本发明提出的检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头，包括套管、发光细菌凝胶和光纤，所述的发光细菌凝胶置于套管内的端部，所述的光纤插入发光细菌凝胶中，光纤的光纤芯端部与发光细菌凝胶端部之间的距离L＝C×D/T，其中D为水在发光细菌凝胶中的扩散系数，T为发光细菌凝胶的透光率，C为修正系数，其取值范围为：0.8～1.2。

上述光纤探头中的套管，可以采用避光耐腐蚀材料。

本发明提出的检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头的制备方法，包括以下步骤：

(1)将发光细菌接种于细菌培养基中，生长10～12小时，生长温度为20～25℃；

(2)取上述经培养的菌液，在20～25℃下加入已经溶解的凝胶溶液中，加入比例为：菌液∶凝胶溶液＝1∶5～10，混合均匀；

(3)将上述含有菌业的凝胶溶液填充入套管，将套管浸入固化液中，在20～25℃下保持15～20分钟，将套管中的圆柱型发光细菌凝胶取出，清洗后置于室温下待用；

(4)在光纤的顶端剥离保护层，沿套管中心插入光纤，并固定光纤根部；

(5)将上述待用的圆柱型发光细菌凝胶推入套管中，直到顶部与套管端面平行。

本发明方法中，发光细菌为费氏弧菌或明亮发光杆菌中的任何一种。所用的凝胶溶液为海藻酸钠。所用的固化液为氯化钙溶液。

本发明提出的检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头及其制备方法，其优点是可以对不同离子强度的水样进行检测，并不需要常规方法中预先调节待测水样离子强度的操作步骤。本发明的光纤探头采用价格低廉的塑料光纤作为传光元件，采用套管式结构，套管内灌注发光细菌凝胶。采用该探头可以构建发光细菌光纤传感器，用于湖泊、水库、河流、污水处理厂等的有毒化学污染的快速监测，也可以用于土壤、食品中有毒化学污染物农药残留的快速检测。本发明的光纤探头结构简单，操作方便，成本低，可快速进行野外分析。

附图说明

图1是本发明提出的发光细菌光纤探头的结构示意图。

图2是利用本发明的探头进行水质毒性测试的一个实施例的结构示意图。

图3是利用本发明的费氏弧菌探头进行水质毒性测试的实时响应曲线。

图4是利用本发明的费氏弧菌探头进行水质毒性测试的剂量-效应曲线。

图5是利用本发明的明杆发光杆菌探头进行水质毒性测试的剂量-效应曲线。

图1中，1是发光细菌凝胶，2是套管、3是光纤芯保护层，4是光纤芯，L是发光细菌凝胶端面到套管端面的距离。

具体实施方式

本发明提出的检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头，其结构如图1所示，包括套管1、发光细菌凝胶2、光纤芯保护层3和光纤芯4。发光细菌凝胶2置于套管1内的端部，光纤芯4插入发光细菌凝胶2中，光纤芯4端部与发光细菌凝胶2的端部之间的距离L＝C×D/T，其中D为水在发光细菌凝胶中的扩散系数，T为发光细菌凝胶的透光率，C为修正系数，其取值范围为：0.8～1.2。

上述光纤探头中的套管，可以采用避光耐腐蚀材料。

本发明提出的检测水质毒性的套管式发光细菌光纤探头的制备方法，包括以下步骤：

(1)将发光细菌接种于细菌培养基中，生长10～12小时，生长温度为20～25℃；

(2)取上述经培养的菌液，在20～25℃下加入已经溶解的凝胶溶液中，加入比例为：菌液∶凝胶溶液＝1∶5～10，混合均匀；

(3)将上述含有菌业的凝胶溶液填充入套管，将套管浸入固化液中，在20～25℃下保持15～20分钟，将套管中的圆柱型发光细菌凝胶取出，清洗后置于室温下待用；

(4)在光纤的顶端剥离保护层，沿套管中心插入光纤，并固定光纤根部；

(5)将上述待用的圆柱型发光细菌凝胶推入套管中，直到顶部与套管端面平行。

本发明方法中，发光细菌为费氏弧菌或明亮发光杆菌中的任何一种。所用的凝胶溶液为海藻酸钠。所用的固化液为氯化钙溶液。

本发明的一个实施例的结构如图1所示，其中发光细菌凝胶为海藻酸钠凝胶，包埋的指示微生物是费氏弧菌或者明亮发光杆菌等发光细菌。发光细菌凝胶块呈圆柱体状，直径为2～2.5mm，长度为6～7mm。套管是包裹发光细菌凝胶块的管状体，材料是黑色聚氯乙烯塑料，套管的后端直径略大于光纤直径。光纤为阶跃型塑料光纤，光纤芯的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，其光折射率为1.492。光纤裸露出10mm区域没有保护层覆盖。光纤芯顶端距离发光细菌凝胶端面距离为2～4mm。L大小由凝胶的透光率和水在凝胶中扩散系数决定，L＝C×D/T。其中D为扩散系数的单位mm²/s，典型值是0.67，透光率为无量纲单位，典型值21.1％，C为修正系数，单位是s/mm，典型值是1。根据这个经验公式，L的典型值是3.18mm。

本发明提出的套管式发光细菌光纤探头的制备方法的第一个实施例是：取明亮发光杆菌，细菌菌种为明亮发光杆菌T3小种(Photobacterium phosphorem T3)冻干粉(南京土壤所)。接种于酵母培养基中，培养基(质量浓度)：胰蛋白胨(0.5％)，酵母浸出汁(0.5％)，氯化钠(3％)，磷酸氢二钠(0.5％)，磷酸二氢钾(0.1％)，甘油(0.3％)，pH7.0，生长10～12小时，取菌液2mL，在20℃下加入20mL已经溶解的海藻酸钠凝胶溶液中，混合均匀，并且使海藻酸钠的最终混合浓度达到3％。将混合液注入套管内，浸入浓度为3％的CaCl₂溶液中，并保持在20℃下，固定15～20分钟。此后将套管中的圆柱型发光细菌凝胶取出，清洗后置于室温下待用。在光纤的顶端剥离10mm的保护层，露出光纤芯，清洗并氮气吹干。沿套管中心插入光纤芯，使用环氧树脂固定光纤根部，使其不会上下移动。将保存待用的圆柱型发光细菌凝胶推入套管中，直到顶部与套管端面平行。则得到制备好的发光细菌光纤探头。

利用本发明的光纤探头构建的发光细菌传感器的一个实施例结构示意图如图2所示，包括发光细菌光纤探头、传光光纤、光电倍增管、预放大电路，信号调理电路，数据采集与实时显示。其中传光光纤采用直径1mm的塑料光纤，光电倍增管是北京滨松光子技术股份有限公司的R105，数据采集模块采用北京中泰公司的USB7310采集卡，为避免外界环境中光信号和电磁信号干扰，将光电倍增管置于不锈钢屏蔽罩中。监控程序采用LabVIEW(美国NI公司)组态化语言编写。其中采样频率100Hz，内置Butterworth滤波器截止频率1Hz。

利用上述发光细菌传感器进行毒性检测的流程如下：把发光细菌光纤探头避光置于待测水样中，在设定检测参数之后，开始检测。检测30分钟后，得到相对发光强度，也即毒性抑制率。

其中相对发光强度(RBL)的计算方法为：

待一次检测结束后，取出光纤，更换发光细菌光纤探头，可以进行下一次毒性检测。

本发明的第二个实施例中，取费氏弧菌作为敏感细菌，其培养基的质量浓度为：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.05％，甘油3％，(NH₄)₂HPO₄ 0.05％，NaH₂PO₄·H₂O 0.61％，K₂HPO₄·3H₂O 0.275％，MgSO₄·7H₂O 0.0204％，NaCl3％。其制备过程与

用上述第二个实施例制备的光纤探头，用3％NaCl溶液配制甲酚物质作为被测溶液的水质毒性测试，其相对发光强度实时响应曲线如图3所示，标定检测实验结果即剂量-效应曲线如图4所示。采用第一个实施例的明亮发光杆菌作为敏感细菌制备的传感器，并用3％NaCl溶液配制甲酚物质作为被测溶液。标定检测结果即剂量-效应曲线见图5。

其中图3是典型的有毒物质抑制发光细菌活性的过程。结果显示，在5～10分钟内发光强度降低到95％以上，得到稳定的信号值。这意味着该发光细菌光纤探头的响应时间小于10分钟。图4和图5都是检测甲酚毒性的剂量-效应曲线，在10～1000ppm之间具有很好的线性关系。图4和图5表示采用相同的方法制备发光细菌光纤探头，仅仅更换探头中的发光细菌种类，制备条件一致。