具有抗骨质疏松活性的酚苷类化合物

摘要

本发明涉及医药技术领域，是仙茅中分离得到的酚苷类化合物仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C，用于制备抗骨质疏松药物的用途，它们的化学结构通式如图：其中R

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从仙茅中提取分离到的酚苷类化合物仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C用于制备抗骨质疏松药物的用途。

背景技术

仙茅为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根茎，味辛、性热，具有补肾阳、强筋骨、祛寒湿的作用，用于阳痿精冷、筋骨痿软、腰膝冷痹和阳虚冷泻等症。有报道从仙茅中提取分离到仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C等酚苷类化合物(Kubo M.et.al.Journal of Medicinal Plant Research.1983，47：52-55；徐俊平等，药学学报，1992，27(5)：353-357；Fu Da-Xu.et al.Acta Botanica Sinica，2004，46(5)：621-624)，但未见它们有抗骨质疏松活性的报道。

发明内容

本发明提供酚苷类化合物仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C用于制备抗骨质疏松药物的用途。它们的化学结构通式如下：

其中

R₁表示-OCH₃或-OH；

R₂表示-H或OH。

当R₁为-OCH₃，R₂为-H时，化合物为仙茅苷；

当R₁为-OH，R₂为-H时，化合物为仙茅苷B；

当R₁为-OCH₃，R₂为-OH时，化合物为仙茅苷C。

制备方法如下：

1.制备仙茅提取物

将仙茅干药材粉碎后，按常规用30-90％乙醇冷浸或热提，得提取液，回收溶剂并浓缩成膏状，即为仙茅提取物。

2.分离纯化

将上述提取物用水稀释后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷∶甲醇60∶1～1∶1系统进行梯度洗脱，收集20∶1、15∶1和10∶1部分，分别进行葡聚糖凝胶柱层析，重结晶3-5次得到仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C。

3.结构鉴定

仙茅苷：无色针状结晶，分子式C₂₂H₂₆O₁₁，易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MSm/z：489[M+Na]⁺，484[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆)：6.977(1H，d，H-3)，6.645(1H，dd，H-4)，9.056(1H，s，OH-5)，6.816(1H，d，H-6)，5.316(2H，s，H-7)，3.773(6H，s，OCH₃-2’，6’)，6.717(2H，d，H-3’，5’)，7.367(1H，t，H-4’)，4.615(1H，d，1”)。¹³C-NMR(DMSO-d₆)：126.72(C-1)，147.43(C-2)，117.19(C-3)，114.74(C-4)，152.29(C-5)，114.33(C-6)，61.33(C-7)，104.25(C-1’)，156.63(C-2’，6’)，112.58(C-3’，5’)，131.31(C-4’)，165.46(C-7’)，55.86(OCH3-2’，6’)，102.55(C-1”)，73.36(C-2”)，76.99(C-3”)，69.81(C-4”)，76.55(C-5”)，60.84(C-6”)。以上数据与文献(Kubo M.et.al.Journal of Medicinal Plant Research.1983，47：52-55；徐俊平等，药学学报，1992，27(5)：353-357)报道一致，确定其为仙茅苷。

仙茅苷B：无色针状结晶，分子式C₂₁H₂₄O₁₁。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：475[M+Na]⁺，451[M-H]^-。¹H-NMR(DMSO-d₆)：6.972(1H，d，H-3)，6.635(1H，dd，H-4)，9.043(1H，s，OH-5)，6.839(1H，d，H-6)，5.312(2H，s，H-7)，9.993(1H，s，OH-2’)，6.524(1H，d，H-3’)，7.191(1H，t，H-4’)，6.495(1H，d，H-5’)，3.746(3H，s OCH₃-6’)，4.614(1H，d，1”)。¹³C-NMR(DMSO-d₆)：127.78(C-1)，147.39(C-2)，117.12(C-3)，114.64(C-4)，152.26(C-5)，114.32(C-6)，61.18(C-7)，102.03(C-1’)，155.52(C-2’)，110.94(C-3’)，131.08(C-4’)，108.51(C-5’)，157.26(C-6’)，166.07(C-7’)，55.66(OCH₃-6’)，102.52(C-1”)，73.33(C-2”)，76.97(C-3”)，69.77(C-4”)，76.53(C-5”)，60.81(C-6”)，以上数据与文献(徐俊平等，药学学报，1992，27(5)：353-357)报道一致，确定其为仙茅苷B。

仙茅苷C：无色针状结晶，分子式C₂₇H₃₄O₁₇，易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MSm/z：500[M+Na]⁺；¹HNMR(CD₃OD，500MHZ)δ：7.07(1H，d，J 8.82Hz，H-3)，6.71(1H，dd，J 8.79Hz，2.95Hz，H-4)，6.92(1H，d，J2.89Hz，H-6)，6.63(1H，d，J 8.935Hz，H-4)，6.86(1H，d，J 8.9135z，H-5′)，5.4(2H，AB体系，J12.98Hz，H-7)，3.50(6H，s，OCH₃-2′，6′)，4.76(1H，d，J7.34Hz，H-1″)，3.15(1H，brs，H -2″)，3.31-3.51(3H，m，H-3″5″)，3.71(1H，dd，J12.07，5.24，H-6a″)，3.85(1H，t，J4.13)；¹³CNMR(CD₃OD，500MHZ)δ：128.304(C-1)，149.679(C-2)，118.968(C-3)，116.834(C-4)，146.469(C-5)，116.659(C-6)，62.532(C-7)，119.144(C-1′)，151.106(C-2′)，144.987(C-3′)，119.946(C-4′)，108.865(C-5′)，153.689(C-6′)，168.078(C-7′)，57.17(OCH₃-6′)，61.872(OCH₃-2′)，104.096(C-1″)，74.924(C-2″)，77.905(C-3″)，71.340(C-4″)，77.912(C-5″)，63.384(C-6″)。以上数据与文献(Fu Da-Xu.et al.ActaBotanica Sinica，2004，46(5)：621-624)报道一致，确定其为仙茅苷C。

经体外药理学实验，仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C均可显著增加成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和骨胶原合成，抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收作用，显示出显著的抗骨质疏松活性。因此，可用于制备防治骨质疏松药物。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述。

实施例1.制备仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C

仙茅药材10kg，粉碎后，按常规用70％乙醇进行回流提取，提取液回收溶剂并浓缩成膏状，即为仙茅提取物。将提取物用水稀释后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷∶甲醇60∶1～1∶1系统进行梯度洗脱，分别收集20∶1、15∶1和10∶1部分，进行葡聚糖凝胶柱层析，再分别用甲醇重结晶3次得到仙茅苷18.6g、仙茅苷B 22.5g和仙茅苷C 3.2g。

体外试验：骨质疏松是老年人常见的多发病。骨量的快速丢失所造成的低骨量是骨质疏松症发生的最主要因素。老年阶段的骨量丢失，一方面是由于成骨细胞的形成减少和成骨功能的减退，另一方面是由于破骨细胞的形成和募集增加，破骨作用增强。由于成骨细胞和破骨细胞之间出现负平衡，使骨量减少。本发明通过观察仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞和破骨细胞的作用，说明其抗骨质疏松活性。

(一)仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞的作用

在骨代谢和重建过程中，成骨细胞通过分泌碱性磷酸酶、骨钙素和胶原等基质蛋白，参与骨质的形成。UMR-106细胞为大鼠成骨性骨肉瘤细胞，具有成骨细胞的特性和表型特征。通过观察药物对UMR-106细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和骨胶原合成的影响，可以明确它们对骨形成的作用。

实验方法：UMR-106细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，传代后进行下列试验。

MTT试验  将细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，24小时后，换含不同浓度仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C的DMEM培养液，继续培养48小时和72小时，在培养结束前4小时，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，培养结束后，弃上清液，每孔加入150μl DMSO，放置，使形成的甲臜颗粒完全溶解，于550nm处测吸收值。

碱性磷酸酶的活性测定  将UMR-106细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，培养24小时，细胞贴壁后，换含不同浓度仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C的DMEM培养基，继续培养。仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C作用一定时间后，用PBS洗涤细胞3次，加入50mmol/L的二乙醇胺200μl及2.5mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠100μl 37℃反应30分钟后，用0.3mol/L的NaOH 100μl终止反应，取150μl加入96孔板，于405nm处测其吸光度。标准曲线为不同浓度的对硝基苯酚溶液在405nm处的吸收值与浓度所作的标准曲线。

³H-proline掺入试验  将UMR-106细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，种植于96孔培养板，每孔100μl，培养24小时后，换含不同浓度仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C的含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48小时，并于结束培养前12h，每孔加入1μci的³H-proline，培养结束时，弃上清液，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，使其脱壁。用自动细胞收集器收集细胞于玻璃纤维素滤纸上。用液体闪烁计数仪测其放射性。

统计学处理  组间均值比较采用方差检验。

实验结果

1.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞增殖的影响，结果见表1。

表1仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞增殖的影响

(n＝6，x±SD)

    浓度(M)    OD值(550nm)    48h    72h    阴性对照    仙茅苷    10^-8    10^-7    10^-6    仙茅苷B    10^-8    10^-7    10^-6    仙茅苷C    10^-8    10^-7    10^-6    0.735±0.092    0.945±0.037^*    1.098±0.052^**    1.109±0.034^**    0.989±0.068^*    1.022±0.021^*    1.108±0.039^*    0.767±0.049    0.968±0.301^*    1.147±0.084^**    1.038±0.009    1.294±0.008^***    1.323±0.019^***    1.384±0.081^***    1.342±0.097^**    1.356±0.087^*    1.475±0.092^**    1.129±0.006^**    1.263±0.057^**    1.362±0.049^***

与阴性对照组相比，^*P＜0.05  ^**P＜0.01  ^***P＜0.001

在骨代谢过程中，成骨细胞主要参与骨质的形成。由表1可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-8-10^-6M浓度下，作用48h和72h对大鼠成骨性UMR-106细胞的增殖具有显著的促进作用，说明它们可通过增加成骨细胞的数目促进骨形成。

2.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，结果见表2。

表2仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

(n＝6，x±SD)

浓度(M)    碱性磷酸酶活性(nmol/孔)    2天    6天阴性对照仙茅苷10^-810^-710^-6仙茅苷B10^-810^-710^-6仙茅苷C10^-810^-710^-6 17.5±2.1 10.1±0.6 11.6±0.8 11.0±0.8 18.1±1.2 17.8±0.5 13.4±0.5 17.1±0.6 13.5±0.6 16.0±0.6    72.6±3.1    70.4±4.1    84.5±5.3    88.8±5.3^*    88.1±9.4    90.6±4.3^**    80.8±5.1    74.1±4.3    84.1±1.5^**    93.2±4.4^**

与阴性对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸脂的无机磷，增加其局部浓度，促使类骨质迅速钙化。由表2可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-8-10^-6M浓度下，在2天时对成骨细胞碱性磷酸酶的活性没有显著作用；在6天时，能显著促进对大鼠成骨性UMR-106细胞的碱性磷酸酶活性，说明它们可以通过增加碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的成骨作用。

3.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞胶原合成的影响，结果见表3。

表3仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对成骨细胞胶原合成的影响

(n＝6，x±SD)

浓度(M)    ³H-脯氨酸掺入(cpm) 仙茅苷仙茅苷B仙茅苷C阴性对照10^-810^-710^-6 3652.2±303.5 3686.5±384.1 4458.9±438.6^** 4895.2±342.5^**3652.2±303.54289.1±376.8^*4200.9±268.9^*4256.2±349.9^*3652.2±303.54618.9±346.9^**5521.2±154.1^**6786.4±315.9^**

与阴性对照相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

胶原是骨细胞外最丰富的基质蛋白，骨基质的90％由胶原组成，在维持纤维连接组织的结构及功能上起重要作用。由表3可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-8-10^-6M浓度下，作用48h时对大鼠成骨性UMR-106细胞的骨胶原合成具有显著的促进作用，说明它们可以促进骨形成过程中骨基质的形成。

(二)仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞的作用

在骨代谢过程中，破骨细胞的主要功能是进行骨吸收。溶酶体酶在破骨细胞中形成一个局部酸性的微环境，再由不同的酸性水解酶溶解骨的无机盐和有机质，使骨的局部形成陷窝。大鼠骨髓单核细胞与原代培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞共同培养，在1，25-二羟基维生素D₃和地塞米松诱导下，可以分化形成具有破骨细胞表型特征和骨吸收活性的破骨细胞，观察仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对由骨髓单核细胞诱导的破骨细胞的作用，可以明确它们在骨代谢过程中，对骨吸收的调控作用。

实验方法：将成骨细胞和骨髓单核细胞悬浮于含有10^-8M的1，25-二羟基维生素D₃和10^-7M的地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培养基中，使成骨细胞浓度为10⁵个/ml，骨髓单核细胞浓度为10⁶个/ml，以诱导骨髓单核细胞分化形成多核破骨细胞，进行以下实验。

抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定：将成骨细胞和骨髓单核细胞悬浮于含10^-8M1，25-二羟基维生素D₃，10^-7M地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，使成骨细胞的浓度为10⁵个/ml，骨髓单核细胞为10⁶个/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，8天后，破骨细胞分化成熟，换含不同浓度仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C的α-MEM培养基100μl，继续培养24，48及72小时，弃上清液，用PBS洗涤两次，用10μl 0.1％的区拉通破碎细胞，15分钟后，每孔加入反应液(反应液的配制：对硝基苯基磷酸二钠0.4g，用去离子水溶解，加入酒石酸钾2.0g，加水溶解至150ml，用1N HCl调节PH至3.5，再加去离子水至200ml)100μl，于37℃反应30分钟，迅速加入100μl1N的氢氧化钠溶液终止反应，于波长405nm处测定其吸收值，以对硝基苯酚溶液作标准曲线，以每孔生成的对硝基苯酚的纳摩尔数表示抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。

骨吸收陷窝面积的测定  将成骨细胞悬液和骨髓单核细胞悬浮在含10^-8M的1，25-二羟基维生素D3，10^-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度，使成骨细胞的浓度为10⁵个/ml，骨髓单核细胞的浓度为10⁶个/ml，取96孔培养板，每孔中放一无菌的牛皮质骨骨片和100μl的细胞悬液，培养24小时后，换含不同浓度的仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C及10^-8M的1，25-二羟基维生素D₃，10^-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基，继续培养10天，每2天换液一次，弃培养基，取出骨片，70％乙醇中固定，过夜，伊红染色，中性树胶封片。用计算机图像处理系统计算骨片上骨吸收陷窝的面积。

培养液中Ca²⁺的测定如前所述于96孔板的孔内放一无菌的牛皮质骨骨片，培养破骨细胞，8天后，换含仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C的α-MEM培养基，其中含10^-8M的1，25-二羟基维生素D₃，10^-7M的地塞米松和10％胎牛血清，分别培养48小时和72小时，收集细胞培养上清液，用去离子水稀释，用原子吸收光谱法测定上清液中Ca²⁺的浓度，以Ca²⁺的浓度表示仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞性骨吸收的抑制作用。

统计学处理  组间均值比较采用方差检验。

实验结果

1.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响，结果见表4。

表1仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响

(n＝6，x±SD)

浓度    抗酒石酸酸性磷酸酶活性(nmol/well) 24h    48h    72h阴性对照组仙茅苷10^-710^-610^-5仙茅苷B10^-710^-610^-5仙茅苷C10^-710^-610^-5 16.6±0.3 15.2±0.5 15.5±0.5^** 15.8±0.5 16.2±0.8 16.1±0.5^* 15.7±0.3^* 15.6±0.2^* 16.1±0.4 16.5±0.4    22.6±1.1    17.7±1.3    16.9±1.5^**    16.8±1.1^**    21.8±2.9    21.6±2.7    18.8±0.7^*    16.8±0.2^**    16.6±0.9^*    15.8±1.8^**    25.3±1.2    20.7±1.8    18.67±1.0^*    17.85±1.1**    24.69±2.2    23.87±1.1^*    21.40±1.0^*    19.41±1.1^**    17.59±1.0^*    16.49±0.9^**

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的标志酶之一，其活性与破骨细胞的骨吸收作用直接相关。由表4可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-7-10^-5M浓度下，作用24h、48h和72h均可显著抑制破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，说明它们可以通过抑制成熟破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，抑制破骨性骨吸收。

2.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞形成的骨吸收陷窝面积的影响，结果见表5。

表5仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞形成的骨吸收陷窝面积的影响

(n＝6，x±SD)

浓度  吸收陷窝面积(μm²)  抑制率阴性对照组仙茅苷10^-710^-610^-5仙茅苷B10^-710^-610^-5仙茅苷C10^-710^-610^-5  2084.5±178.2  1901.2±65.3  1790.5±61.5^*  1435.5±140.6^**  1768.9±179.6  1732.8±87.0^*  1551.2±246.4^*  1678.6±52.07^*  1656.7±59.82^*  1608.4±129.4^*  8.8％  14.10％  31.13％  15.14％  16.87％  25.58％  19.47％  20.52％  22.84％

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

破骨细胞的主要功能是进行骨吸收，将破骨细胞和牛皮质骨骨片共同培养，破骨细胞通过骨吸收作用，溶解骨片的无机盐和有机质，从而在骨片上形成吸收陷窝。由表5可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-7-10^-5M浓度下，作用10天时，显著减少破骨细胞在牛皮质骨骨片上形成的吸收陷窝的面积，说明它们具有显著的抑制骨吸收作用。

3.仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞作用下骨片中Ca²⁺释放的影响，结果见表6。

表6仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C对破骨细胞作用下骨片中Ca²⁺释放的影响

(n＝6，x±SD)

浓度(M)    Ca²⁺的浓度(ppm) 48小时  72小时阴性对照组仙茅苷10^-710^-610^-5仙茅苷B10^-710^-610^-5仙茅苷C10^-710^-610^-5 72.4±6.7 56.2±6.8^* 49.6±6.3^** 43.1±5.5^** 64.3±4.9 64.7±2.4 68.2±3.1 62.4±7.5 66.5±8.2 55.1±0.6^**  140.2±9.8  100.4±10.5^*  58.6±10.6^**  59.2±5.4^**  86.5±9.5^**  93.2±10.9^*  91.2±8.6^**  106.7±6.2^**  83.0±10.3^**  84.7±4.8^**

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

破骨细胞在进行骨吸收过程中，溶解骨片的无机盐和有机质，在骨片上形成吸收陷窝的同时，使培养液中Ca²⁺的浓度升高。由表6可见仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C在10^-7-10^-5M浓度下，作用48和72h时，显著减少破骨细胞从牛皮质骨骨片释放钙离子，进一步说明它们具有显著的抑制破骨细胞的骨吸收作用。

上述实验表明，仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C均可显著增加成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和骨胶原合成，抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收作用，通过增加骨形成和抑制骨吸收而具有显著的抗骨质疏松活性。因此，可用于制备抗骨质疏松药物。