作为猪生殖和呼吸道征候群疫苗的PRRS病毒的融合蛋白

摘要

本发明提供一种具中和力价融合蛋白组成的次单位PRRS疫苗，PE－PQGAB－K3，其由绿脓杆菌外毒素部位I(结合部位－转位部位(II))架移PRRSV ORF5及ORF6N－端与细胞接受器结合的PQGAB结构胜肽，并于此融合蛋白羧基端添加一个KDEL－RDEL－KDEL(KEDL3)的讯码。本发明PE－PQGAB－K3免疫在小鼠或猪只后所得的血清可抑制PRRSV在MAC－10A细胞的生长及繁殖，其中和力价可达16至32。

说明书

技术领域

本发明是关于具备诱发猪只产生PRRSV中和力价反应的融合蛋白次单位疫苗。

背景技术

猪生殖与呼吸道征候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由猪生殖与呼吸道征候群病毒(PRRSV)感染，其为一种会导致母猪繁殖障碍，并对各年龄层猪只呼吸道感染为主的猪只传染病。PRRSV被视为极顽强的病毒，其基于在寄主体内不易诱发具有中和力价的抗体。且PRRSV为RNA病毒，可在寄主细胞内经由简化的基因复制系统进行繁殖，也因此基因突变机率非常高。此外，PRRSV感染可分为两阶段：(A)感染上呼吸道及下呼吸道上皮细胞系统；及(B)感染呼吸道外围组织的单核球及巨嗜细胞。因此，寄主需同时具备中和力价的体液或黏膜免疫反应机制及细胞免疫机制，利于清除被感染的细胞以进行防御。然而，自然界中PRRSV可以真正的在动物体内产生中和力价即不容易，因此一般的抗体对防御PRRSV效果不大，甚至会刺激病毒的突变。因此，在抗体-依赖性的增强作用机制中，非中和力价抗体的使用可能导致更严重的感染。

中国台湾第I-2289933号(美国专利公开号US 20040247617)中，提供一种对标靶细胞具专一性的融合蛋白，该融合蛋白利用一绿脓杆菌外毒素部位及一功能区架构PRRSV ORF7核蛋白片段，并于羧基端添加KDEL讯码。该融合蛋白可以大量在大肠杆菌中生产，免疫猪只后，可有效降低及清除猪只攻毒后的病毒血症的发生。该专利的全文引用记载并入本申请中。

在PRRSV的ORF5与ORF6杂二聚合反应(heterodimerization)中，ORF5的Cys-34抗原决定部位区域，及ORF6的Cys-8抗原决定部位区域，对病毒感染及其外套膜装配(envelope assembly)具关键性作用(Snijder Eric J.，Jessica C.et al.，Journal ofVirology，January 2003，Vol.77，No.1：97-104)。此外，PRRSV ORF5的保留序列(consensus sequence)-YKNTHLDLIYNA，为介于胺基酸38至44之间的抗原决定部位，其位于PRRSV ORF5的N-端体外区，业经鉴别为一中和抗原决定部位(Ostrowski M.，J.A.Galeota，et al.，Journal of Virology，May 2002，Vol.76，No.9：424 1-4250)。

公知技术亦曾将ORF5或ORF6整个蛋白架构在PE及KDEL中间，免疫到猪只后发现，攻毒的猪只在肺部反而发生更严重的发炎现象，显见ORF5或ORF6比本身更具有免疫毒性。因此，欲有效防治猪只感染PRRS，仍有必要发展具有高中和力价且低免疫毒性的疫苗。

发明内容

本发明目的之一是提供一种融合蛋白，及其组合方式。

本发明的另一目的是关于利用该等融合蛋白制备具中和力价融合蛋白组成的次单位PRRS疫苗。

本发明的再一目的是提供医药组合物，其包括本发明的融合蛋白及在药学上可接受的载剂。

为实现上述目的，本发明提供的PE-PQGAB-K3融合蛋白，其包括：

一含有猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，与PRRSV ORF5部分序列的N端蛋白区；

一绿脓杆菌外毒素A移位功能部位；以及

一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基终端部份。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV为美洲株。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV为欧洲株。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV的该ORF6部分序列为SEQ ID NO.13。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV ORF5部分序列为SEQ ID NO.12。

所述的融合蛋白，其中该猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区的核酸序列为SEQ ID NO.1。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV的该部分ORF6为SEQ ID NO.15。

所述的融合蛋白，其中该PRRSV的该部分ORF5为SEQ ID NO.14。

所述的融合蛋白，其中该猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区的核酸序列为SEQ ID NO.10。

本发明可作为疫苗的医药组合物，其包含：

一猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区；

一绿脓杆菌外毒素A移位功能部位；

一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基终端部份；以及

一药学上可接受的载体。

所述的医药组合物，其中该PRRSV为美洲株。

所述的医药组合物，其中该PRRSV为欧洲株。

所述的医药组合物，其中该PRRSV的该部分ORF6为SEQ ID NO.13。

所述的医药组合物，其中该PRRSV的该部分ORF5为SEQ ID NO.12。

所述的医药组合物，其中该猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区的核酸序列为SEQ ID NO.1。

所述的医药组合物，其中该PRRSV的该部分ORF6为SEQ ID NO.15。

所述的医药组合物，其中该PRRSV的该部分ORF5为SEQ ID NO.14。

所述的医药组合物，其中该猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区的核酸序列为SEQ ID NO.10。

所述的医药组合物，其中该载体包含一福氏佐剂、乳化剂二缩甘露醇单油酸盐(mannide mono-oleate emulsifier，ISA720，ISA206)佐剂。

所述的医药组合物，其中该载体包含一ISA206佐剂。

再进一步地说，本发明PE-PQGAB-K3融合蛋白包括：一含有猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，与PRRSV ORF5部分序列的N端蛋白区；一绿脓杆菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基终端部份。

本发明还包括一种可作为疫苗的医药组合物，其包含：一猪生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白区；一绿脓杆菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基终端部份；以及一药学上可接受的载体。

本发明中所指的PRRSV病毒株种类不限，可以是美洲型病毒株、欧洲型病毒株、或澳洲型病毒株，于本发明较佳实施例中，PRRSV病毒株为美洲型病毒株、或欧洲型病毒株。

本发明中，融合蛋白的N端蛋白区可包含的片段不限制，较佳为任一具备抗原特性的PRRSV片段，如PRRSV ORF5、ORF6、或ORF7。以美洲型病毒株为例，较佳PRRSV的ORF6部分序列可为SEQ ID NO.13。而PRRSV ORF5部分序列则可为SEQ ID NO.12。以欧洲型病毒株而言，较佳PRRSV的部分ORF6可为SEQ ID NO.15，而PRRSV的部分ORF5较佳则可为SEQ ID NO.14。

本发明中，融合蛋白含部分PRRSV ORF6及部分PRRSV ORF5的核酸序列是经改质，其序列不限制，较佳为可于大肠杆菌系统中高度表现，且表现出的蛋白质结构与野生型相同的核酸序列。以美洲型病毒株为例，更佳的改质后核酸序列为SEQ ID NO.1。而以欧洲型病毒株为例，更佳的改质后核酸序列为SEQ ID NO.10。

本发明的医药组合物可包括根据已知技术使用适合的佐剂；分散剂或保湿剂(如Tween 80)以及悬浮剂调配无菌注射剂，例如，无菌注射水溶液或含油性悬浮液。无菌注射制剂亦可用于无毒性注射的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液，例如，于1，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的载体与溶剂中，有甘露醇、水、Ringer溶液、与等张氯化钠溶液。此外，常用上使用灭菌、固定油类作为溶剂或悬浮介质(例如合成的单酸或二酸甘油酯类)。脂肪酸(例如油酸与其甘油酯衍生物)，以及天然医药上可接受的油类(例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其多氧乙基化的型态)，可使用于可注射制剂。此等油溶液或悬浮液亦可含有长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它一般使用的界面活性剂例如Tweens或Spans或其它类似的乳化剂或生体可用率增强剂(一般用于制造医药上可接受的固体、液体、或其它剂量形式)亦可用于调配的目的。

口服投药用的组合物可为任何口服上可接受的剂量形式，包含但不限于胶囊、锭、乳剂、及水性悬浮液、分散剂、与溶液。在口服用途的锭剂例中，一般使用的载体包含乳醣及玉米淀粉。一般亦常添加润滑剂，例如，硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服投药而言，可使用的稀释剂包含乳糖及玉米淀粉。当口服投药水性分散剂或乳剂时，可使活性成份与乳化剂或悬浮剂组合悬浮或分散于油相中。若需要，可添加特定的甜味剂、风味剂、或着色剂。鼻腔喷剂或吸入剂组合物可依据医药配方的技术中公知技术制备，及可制成生理食盐水，使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、增加生体可用率的吸收促进剂、氟碳化合物、及/或其它技术中已知的溶解剂或分散剂。含吲哚化合物的组合物亦可以直肠投药的栓剂形式投药。

医药组合物中的载体必须为″可接受″，意为与配方中的活性成份相容(及较佳地是能使配方安定)及对接受治疗的病患无害。其它载体的实例包含胶态二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠、及D&C黄色10号。

而含本发明融合蛋白的医药组合物中，较佳地还包括一免疫佐剂；所适用的免疫佐剂不限，可以是任何一种常用于疫苗的佐剂，包括铝胶以及油质佐剂如：福氏佐剂(Freund’s FCA or FIA)或乳化剂二缩甘露醇单油酸盐(mannide mono-oleate emulsifier，ISA720或ISA206，SEPPIC^，France)，较佳为ISA206佐剂。

本发明的详细说明陈述于下列说明中。在本发明说明及申请专利范围中将显而易见本发明的其它特征、目的及优势。

附图说明

图1表示根据实例1的PE-PQGAB-K3融合蛋白的简图。

图2表示根据实例1的PE(ΔIII)-PQGAB质体构筑流程图。

图3表示根据实例1所合成的核酸片段电泳图，共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。

图4表示PE(ΔIII)-PQGAB质体图谱。

图5为利用8M尿素法萃取及溶出包涵体(inclusion bodies)内的PE-PQGAB-K3抗原蛋白质片段定量的结果图。

具体实施方式

本发明特征在于，发现将ORF5及ORF6大多数的抗原去除，仅留下ORF5及ORF6的N端数十几个胺基酸，以此架构一个杂合胜肽链PQGAB，接着使的嵌入PE及KDEL3序列中间，该融合蛋白PE-PQGAB-KDEL3经小鼠及猪只的免疫试验，确认具有血清中和力价能力。

为解释本发明目的，提供下列实例，惟，其并非用以限制本发明的范围。

实施例1：美洲株PRRSV的PQGAB融合胜肽

美洲株PRRSV的ORF5及ORF6结构蛋白序列是得自美国国立生物技术数据中心(NCBI)的数据库。而根据上述病毒感染机转已知，PRRSV病毒具有中和力价的区域分别为ORF6及ORF5的N端。即为ORF6结构蛋白第2至26号胺基酸胜肽区(SEQ ID NO.13)，及ORF5结构蛋白第30至63号胺基酸胜肽区(SEQ ID NO.12)。将融合此二段胜肽区的胺基酸序列列出，如下：

GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA

即，PRRSV-ORF6-2～26-ORF5-31～63融合胜肽，其由(ORF6)-G₂SSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY₂₆(SEQ ID  NO.13)及(ORF5)-A₃₁SNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD  WA₆₃(SEQ IDNO.12)两胜肽片段所组成，其中，GSSLDDFC片段称的P、YDSTAPQKVLLAFSITY片段称的Q、ASNDSSSHLQLIYNLTLC片段称的A，且ELNGTDWLANKFDWA片段称的B。PQ片段属于一部份的ORF6片段，而AB片段属于一部份的ORF5片段。

本例利用PQGAB胜肽融合区，构筑一个具有诱发中和力价免疫保护力的关键蛋白质(即抗原决定部位)，以达成诱发活体免疫效果。PE-PQGAB-K3融合蛋白简图及PE(ΔIII)-PQGAB质体构筑的流程图分别如图1及2所示。

实施例2

以下说明PQGAB核酸序列的编制。由于一胺基酸可对应多组不同的核酸序列，因此可先由学术数据(如http://www.kazusa.or.jp/codon)，找到比较适合在大肠杆菌(E.coli)寄主系统中表现的核酸对应序列，且避开大肠杆菌不容易辨识、表现的核酸对应序列。同理，如果这序列要在酵母菌系统中表现，则亦要选择适于酵母菌系统(Saccharomyces或Pichia spp.)表达的序列。

根据PQGAB融合蛋白区的胺基酸序列，找出适合于大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列，并且在核酸序列的5′及3′-末端分别接上限制酵素序列，以利于往后的基因片段剪接步骤。为了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的设计，该基因两端可加上一些重复碱基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改质后的PQGAB融合蛋白区核酸序列可见SEQID NO.1。

SEQ ID NO.1中总共207个核酸，当利用酵素进行与质体的剪接时，上述连续三码的核酸会有部分被切除，而至少会有186至180个核酸进入质体内。

标的核酸序列确定后，在开始进行合成前，需利用计算机软件(如DNAstrider)分析标的核酸序列上带有限制酵素切点的图谱，并根据图谱结果，于标的核酸序列两端安装限制酵素的序列，以供往后进行剪接用。而由于产生出来的标的物须进行限制酵素的剪接，因此最好在标的核酸序列内避免出现与剪接时相同的限制酵素切位。为此，须再利用常用的软件，分析DNA序列中是否有这些切位(restriction map)。如果标的核酸序列内有与剪接时相同的限制酵素切位序列，就必须再改换核酸序列，找寻相同胺基酸对应的不同核酸序列，使标的核酸序列片段内的限制酵素切位消失。

接着利用前述中国台湾第I-2289933号(美国专利号US20040247617)专利所公开的方法，根据野生型胺基酸进行对应的核酸序列的改质，使得上述野生型胺基酸可由大肠杆菌系统大量表现出来。改质的重点主要在将野生病毒株的核酸片段，以在不影响其原本表现出的胺基酸，而又能有效的在大肠杆菌宿主系统中表现的状况下，进行核酸序列的改质。此改质后的核酸序列，可分别利用多对引子，以聚合酶连锁反应进行合成，所有引子对的对应编号请见表1。

表1：美洲株PRRSV标的抗原PQGAB引子对的对应编号

  标的抗原正向引子  序列编号  (Seq.ID No.)  反向引子  序列编号  (Seq.ID No.)  PQGAB    F1    2    R1    6  PQGAB    F2    3    R2    7  PQGAB    F3    4    R3    8  PQGAB    F4    5

正向引子及反向引子的序列分别如下所示：

正向引子F1(SEQ ID No.2)为SEQ ID No.1的第81至124号胺基酸序列，即，

5′-GCT TTC TCC ATC ACC TAC GCT TCC AAC GAC TCC TCCTCC CAC CT-3′；

正向引子F2(SEQ ID No.3)为SEQ ID No.1的第48至96号胺基酸序列，即，

5′-C GAC TCC ACC GCT CCC CAG AAA GTT CTG CTG GCT TTCTCC ATC ACC TA-3′；

正向引子F3(SEQ ID No.4)为SEQ ID No.1的第22至65号胺基酸序列，即，

5′-GGT TCC TCC CTG GAC GAC TTC TGC TAC GAC TCC ACCGCT CCC CA-3′；

正向引子F4(SEQ ID No.5)为SEQ ID No.1的第1至41号胺基酸序列，即，

5′-CCC AAA CCC CAT ATG GAA TTC GGT TCC TCC CTG GACGAC T-3′；

反向引子R1(SEQ ID No.6)为SEQ ID No.1的第148至1 06号胺基酸序列，即，

5′-A CAG GGT CAG GTT GTA GAT CAG TTG CAG GTG GGA GGAGGA GTC-3′；

反向引子R2(SEQ ID No.7)为SEQ ID No.1的第176至133号胺基酸序列，即，

5′-GC CAG CCA GTC GGT ACC GTT CAG TTC GCA CAG GGTCAG GTT GTA-3′；

反向引子R3(SEQ ID No.8)为SEQ ID No.1的第204至1 64号胺基酸序列，即，

5′-TTT TTT CTC GAG AGC CCA GTC GAA TTT GTT AGC CAGCCA GTC GG-3′；

其中R1、R2及R3为表1基因序码的逆向互补基因序列。

首先利用无DNA模板的聚合方式，利用正向引子F1以及反向引子R1进行核酸片段的聚合，其中各引子的3′端部分各有10-18个碱基是设计为彼此互补的结合，以经由聚合酵素的读写及补足成为一条双股的DNA模板聚合产物。

完成第一次PCR后，取0.01～4μl的聚合产物作为第二次PCR的模板DNA，同时加入第二组引子对正向引子F2及反向引子R2各0.01～4μl，连同所需的dNTPs、反应试剂以及Pfu聚合酶等，开始进行第二次PCR；接着依照相同方式，分次加入不同引子对F3及R3进行PCR后，再进行引子对F4及R3的PCR步骤，即可合成出PQGAB改质后的207bp核酸序列。

所分别合成出的核酸片段经电泳试验后，可确认其产物的片段大小与预期相符。PQGAB-1段(207bp)，如图3；PQGAB-产生a、b、c及d共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。

实施例3、欧洲型病毒株PRRSV的PQGAB

实施例1～2为PRRSV美洲型的融合蛋白设计，但是PRRSV在全球的感染盛行率除了PRRSV美洲型病毒株外，欧洲型病毒株、澳洲型病毒株的盛行亦相当普遍，由于这些病毒株在结构蛋白胺基酸的相似度并不高，只在60～80％，因此对于其它型的ORF5与ORF6的融合蛋白设计，亦可分别根据如实施例1～2的类似方式，进行序列的设计与合成。

欧洲型病毒株PRRSV的PQGAB融合蛋白区的胺基酸序列如SEQ IDNO.11所示。其中包含ORF6-M1～I28(SEQ ID NO.1 5)片段，以及ORF5-F31～A64(SEQ ID NO.14)的片段序列。以SEQ ID NO.11为依据所设计的合成用引子，分别为四组，如下表2所示。

表2：欧洲株PRRSV标的抗原PQGAB引子对的对应编号

 标的抗原  正向引子  序列编号  (Seq.ID No.)反向引子序列编号(Seq.ID No.) PQGAB-EP    F1    16    R1    20 PQGAB-EP    F2    17    R2    21 PQGAB-EP    F3    18    R3    22 PQGAB-EP    F4    19    R4    23

经如实施例2所述的方式，由如表2的引子序列，可体外合成出一改质后的欧洲株PQGAB核酸序列。为了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的设计，于欧洲株PQGAB核酸序列的两端，同样可加上一些具重复碱基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改质后的欧洲株PQGAB核酸序列为SEQ ID NO.10。

实施例4：含标的序列的质体构筑

以实施例2制备出的改质核酸片段为例，将上述合成出的207bp DNA片段，分别以限制酵素EcoRl、Xhol切割后，接入已带有一结合与移位功能的胜肽序列，以及一羧基终端胜肽的大肠杆菌质体中，所得质体为pPE-PQGAB-K3质体。

构筑于含T7启动子及具抗生素(ampicilin)抗性片段的pET15质体系统，可表现含有PRRSV PQGAB以及去毒性的绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonasexotoxin A without domain III)的融合蛋白，质体图谱系如图4所示。

最后分别将上述质体转染于可以表现该融合蛋白质的菌株或细胞中。

实施例5、标的蛋白质的表现与分析

经确定含有以上质体的菌种，90％以上细菌均含有质体及PQGAB基因，个别以甘油保存法于2ml分装瓶中保存于-70℃温度下。在无菌室中，将以上保存菌苗取2ml接种于灭菌的500ml三角瓶，其内含有200ml LB(+500μg/ml Amp)，于37℃回转式培养箱以150rpm转速下培养10～12小时，完成种菌培养。该菌苗的OD600应达到1.0±0.4。

在无菌室中，将50ml菌种液各别接种于灭菌的3000ml三角瓶共八瓶，该三角瓶内含有1250ml LB(+500μg/ml Amp+50ml 10％Glucose)，于37℃回转式培养箱以150rpm转速下培养2～3小时，检测OD600在0.3±0.1时，注入最终浓度为50 ppm的IPTG蛋白质诱导剂后，于37℃回转式培养箱以150rpm转速下培养2小时，即完成蛋白生产步骤。

接着，利用8M尿素法萃取及溶出包涵体(inclusion bodies)内的PE-PQGAB-K3抗原蛋白质片段，各以十公升细菌液(一小批量，lot)萃取，可得到300～400mg抗原量。利用西方墨点法(Western-blotting method)、coomasie blue染色法、SDS-PAGE电泳分析法，并以密度计(densitometer)量测电泳条带的密度，以进行各抗原溶液的蛋白质定量(结果如图5)。将上述抗原蛋白质取0.2±0.02 mg，作为针剂高剂量的主成份。取0.02±0.002 mg作为针剂低剂量的主成份，进行猪只免疫及攻毒的功效性试验。

实施例6、猪只免疫及攻毒的功效性试验

在SPF农场中，将猪只随机分成三组，每组五只猪，且每组猪只分别饲养在装设有空调及换气设备的隔离室内。PE-PQGAB-E3接种疫苗组的猪只在14及28日龄时，藉由肌肉内分别注射含有1ml PE-PQGAB-E3(含有200μg蛋白质/剂量)，在1ml ISA206(SEPPIC^法国)佐剂中乳化的2ml疫苗，免疫两次。GP5&M免疫组则以PE-ORF5-K3及PE-ORF6-K3(各含有200μg蛋白质/剂量)所免疫。对照组则于无免疫接种下养育。

在最后的疫苗接种之后二周，对猪只在肌肉内投予100mg氯胺酮(ketamine)溶液以达镇静作用，接着在鼻内滴下1ml的2％利多卡因(Lidocaine)抑制咳嗽-反射作用之后，以鼻内攻毒猪只。使用新鲜的1ml的MD-1品系的PRRSV培养物，以大约1×10⁷TCID₅₀/ml的剂量攻毒每组中的五只猪。

接种后第14天时，对所有牺牲的猪只进行完整解剖。收集肝脏样品(自头盖叶的两部份及各来自肝尾状叶的中间及附属部份)，并利用10％中性缓冲福尔马林予以固定，以进行后续组织病理学检验。该检验方式是采用盲模式(blind fashion)并根据间质性肺炎严重程度加以评比(Opriessnig T，P.G.Halbur，et al.，Journal of Virology，76(2002)：11837-11844及Halbur，P.G.，P.S.Paul，et al.，1996.J.Vet.Diagn.Investig.8：11-20)，以0至6作区分，数字愈大表示病变程度愈严重。

实验结果

第二次免疫的后两周，猪只血液白血球试样以RT-PCR检测PRRSV，结果显示在PRRSV攻毒之前，所有猪只均未引起病毒血症。在攻毒之后3、7及14天后，再次利用RT-PCR检测猪只的血液白血球试样，结果如表3所示。

表3：PRRSV攻毒后，猪只PRRSV病毒血症比例

    天数    对照组PE-PQGAB-K3  PE-ORF5-K3  PE-ORF6-K3    3    3/5    3/5    2/5    7    3/4(死1^*)    2/5    2/4(死2^*)    14    3/4(死1^*)    2/5    2/4(死2^*)

^*表示死亡的猪只之前均由RT-PCR检测出PRRSV病毒血症

对所有猪只(包括已经牺牲的猪只及两周研究结束时还存活的猪只)进行解剖，巨观检查显示，攻毒后猪只肺脏显示，对照组及ORF5&ORF6疫苗组观察到较广泛的病变以及严重之间质性肺膜炎，而本发明PE-PQGAB-K3疫苗组则未发现此等广泛的病变及之间质性肺膜炎。

表4：以PRRSV攻毒后14天对于PRRSV-所诱发的巨观肺脏病变的比较

  猪只编号   对照组   病变指数PE-PQGAB-K3疫苗组    病变指数  PE-ORF5-K3，  PE-ORF6-K3疫苗组病变指数  1   6^*    5    6  2   6    3    5  3   6    4    6  4   6    4    6  5   5    3    6  平均指数   5.75   +0.50    3.80    ±0.84    5.80    ±0.45

^*：间质性肺炎病变指数。

如表4所示，本发明PE-PQGAB-K3疫苗组所表现的巨观肺脏病变严重程度显著地较对照组及ORF5&ORF6疫苗组为小。

表5、PE-PQGAB-K3疫苗组所表现的巨观肺脏病变指数，以生物统计具极显著差异水平，较对照组及ORF5&ORF6疫苗组低(p＜0.01)

组别  个数总和    平均  变异数对照组PE-PQGAB-K3组PE-ORF5&ORF6-K3组    5    5    5    29    19    29    5.8    3.8    5.8    0.2    0.7    0.2

ANOVA  变源  SS  自由度  MSFP-值临界值  组间  组内  总和  13.33333  4.4  17.73333    2    12    14  6.666667  0.36666718.181820.0002333.885294

比较对照组及ORF5&ORF6疫苗组低(p＜0.01)

根据以上实验结果清楚显示，本发明PE-PQGAB-K3不但确实可有效保护猪只免于PRRSV感染，且根据本发明的疫苗，其相对于其它疫苗(例如PE-ORF5-K3，PE-ORF6-K3)所表现之间质性肺炎更为轻微。

表6、血清力价总表

 Group    coating antigen  IFA titers  NT titersPE(ΔIII)IgG-ELISA PQGAB titers(S/BK) A PE-ABCF-K3 PE-PQGF-K3     12     80     8-16     8-16 B Negative CTL     1     1     ＜8     ＜8 C PE-PQG1AB-K3     17     30     32-64     16-64

攻毒后猪只抗体力价变化如图6所示。

序列表

<110>生宝生物科技股份有限公司

<120>作为猪生殖与呼吸道征候群疫苗的PRRS病毒的融合蛋白

<130>S0160/0613

<160>23

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>207

<212>DNA

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>1

cccaaacccc atatggaatt cggttcctcc ctggacgact tctgctacga ctccaccgct     60

ccccagaaag ttctgctggc tttctccatc acctacgctt ccaacgactc ctcctcccac    120

ctgcaactga tctacaacct gaccctgtgc gaactgaacg gtaccgactg gctggctaac    180

aaattcgact gggctctcga gaaaaaa                                        207

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>正向引子PQGAB-US.

<400>2

Gctttctcca tcacctacgc ttccaacgac tcctcctccc acct         44

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-US的正向引子.

<400>3

cgactccacc gctccccaga aagttctgct ggctttctcc atcaccta    48

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>  PQGAB-US的正向引子.

<400>4

ggttcctccc tggacgactt ctgctacgac tccacegctc ccca        44

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-US的正向引子

<400>5

ggttcctccc tggacgactt ctgctacgac tccaccgctc ccca    44

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-US的反向引子.

<400>6

acagggtcag gttgtagatc agttgcaggt gggaggagga gtc    43

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-US的反向引子.

<400>7

gccagccagt cggtaccgtt cagttcgcac agggtcaggt tgta    44

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-US的反向引子.

<400>8

ttttttctcg agagcccagt cgaatttgtt agccagccag tcgg    44

<210>9

<211>207

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>9

Cys Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly Gly

1                5                  10                  15

Ala Ala Thr Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr

            20               25                      30

Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys

        35                  40                      45

Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Cys Cys

    50                  55                  60

Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys

65                  70                  75                  80

Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

                85                  90                  95

Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr

        100                     105                 110

Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr

        115                 120                 125

Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys

    130                 135                 140

Cys Thr Gly Thr Gly Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly

145                 150                 155                 160

Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys

               165                  170                 175

Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Thr Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly

            180                 185                 190

Gly Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala

        195                 200                 205

<210>10

<211>219

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>10

Cys Cys Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Thr

            20                  25                  30

Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr Ala Ala Cys

        35                  40                  45

Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys

    50                  55                  60

Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys

65                  70                  75                  80

Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

                85                  90                  95

Ala Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly

             100                 105                 110

Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys

        115                 120                 125

Thr Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys

    130                 135                 140

Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr

145                 150                 155                 160

Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Cys

                165                 170                 175

Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Cys

            180                 185                 190

Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys

        195                 200                 205

Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala

    210                 215

<210>11

<211>219

<212>DNA

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>11

cccgaattcc atatggtcga catgggttct ctcgacgact tttgtaacga ctctaccgct     60

gctcagaaac tggttctggc tttttctatc acctacaccc caatctttgt tgctggtggt    120

tcttcttcta cctaccagta catctacaac ctcaccatct gtgaactcaa cggtaccgac    180

tggctgtcta accactttga ctgggctctc gagaaaaaa                           219

<210>12

<211>33

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>12

Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr

1               5                    10                  15

Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Thp LeuAlaAsn Lys Phe Asp Thp

            20                  25                30

Ala

<210>13

<211>25

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>13

Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Tyr Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys

1               5                   10                   15

Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr

            20                  25

<210>14

<211>28

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>14

Met Gly Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Ala Gln Lys

1               5                   10                  15

Leu Val Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile

            20                  25

<210>15

<211>34

<212>PRT

<213>猪生殖与呼吸道征候群病毒

<400>15

Phe Val Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu

1               5                   10                  15

Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Asn His Phe Asp

            20                  25                  30

Trp Ala

<210>16

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的正向引子.

<400>16

ctggcttttt ctatcaccta caccccaatc tttgttgctg gt    42

<210>17

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的正向引子

<400>17

gactctaccg ctgctcagaa actggttctg gctttttcta  t    41

<210>18

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的正向引子.

<400>18

ggttctctcg acgacttttg taacgactct accgctgct    39

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的正向引子.

<400>19

cccgaattcc atatggtcga catgggttct ctcgacga    38

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的反向引子.

<400>20

gatgtactgg taggtagaag aagaaccacc agcaacaaag at    42

<210>21

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的反向引子.

<400>21

 gttgagttca cagatggtga  ggttgtagat gtactggtag gt    42

<210>22

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的反向引子.

<400>22

gtggttagac agccagtcgg taccgttgag ttcacagat          39

<210>23

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PQGAB-EP的反向引子.

<400>23

ttttttctcg agagcccagt caaagtggtt agacagcc    38