使用季铵杂环活化剂合成亚磷酸酯化化合物

摘要

一种包括如下步骤的制备亚磷酸酯化化合物的方法：使含有羟基的化合物与亚磷酸酯化试剂在具有式(I)的活化剂存在下反应，其中R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基，R

说明书

技术领域

本发明涉及使用特定的活化剂制备亚磷酸酯化化合物方法，尤其是涉及亚磷酰胺的合成。

背景技术

低聚核苷酸在生命科学中是重要的化合物并在各种领域具有重要作用。它们例如在基因表达分析领域中用作探针，在PCR或DNA测序中用作前体。

此外，还有许多潜在的治疗应用，即包括反义低聚核苷酸。

许多化学改性已引入低聚核苷酸中以增加它们在诊断中作为研究试剂和治疗剂如稳定核酸酶的有效性。

使用溶液相和固相方法均可完成低聚核苷酸的合成。目前优选的方法是经由在固体载体上制备低聚核苷酸并通过依次加入核苷酸使低聚核苷酸生长的固相合成。

应用的增加需要更大量的低聚核苷酸；因此，正需要开发改进的合成方法。

对于一般性综述，例如参见″Antisense-From Technology toTherapy″Blackwell Science(Oxford，1997)。

在低聚核苷酸的合成中主要结构单元类型为亚磷酰胺；例如参见S.L.Beaucage，M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters 1859(1981)22。核苷、脱氧核糖核苷和两者衍生物的这些亚磷酰胺均可市购。在通常的固相合成中，使用’-O-亚磷酰胺，但在其它合成工艺中也使用5’-O-和’-O-亚磷酰胺。在这些核苷的亚磷酰胺的制备中，一个步骤为使(保护的)核苷亚磷酸酯化。最通常的是将存在于核苷中的羟基和氨基以及其它官能团在亚磷酸酯化剩余的3’-、5’-或2’-O羟基之前保护起来。已知一些制备单体(核苷)和聚合(核苷酸或低聚核苷酸)亚磷酰胺的路线。已知方法非常经常地导致化学或安全性的问题。对于将这些化学品用于较大批量的合成(100kg-1000kg)，必须改进成本有效性。

在传统上，核苷的亚磷酸酯化通过用如下亚磷酸酯化试剂处理保护的核苷而进行：例如非常易反应的且不需要活化剂的氯-(2-氰基乙氧基)-N，N-二异丙基氨基膦或需要活化剂的2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(2-cyanoethyl-N，N，N’，N’-tetraisopropylphosphoro-diamidite)(双磷(bis-phos)或双酰胺化物(bis-amidite)试剂)。

常用于亚磷酸酯化反应的活化剂为1H-四唑。

尤其是在进行较大规模的合成时，使用1H-四唑具有内在问题。例如，已知1H-四唑是爆炸性的和有毒的。根据材料安全数据表(MSDS)，如果吸入、摄取或通过皮肤吸收1H-四唑(1H-四唑，98％)可能是有害的。

此外，1H-四唑是昂贵的。尤其是在大规模合成中，其对于低聚核苷酸的合成成本具有显著影响。

MSDS还声明如果将1H-四唑加热超过其熔融温度155℃，则其可能爆炸并会形成非常敏感的爆炸性金属化合物。在容器中大规模合成的情况下，1H-四唑对人类和环境会有很大危害。

此外，已知1H-四唑在其储存、使用和处理过程中需要特别的处理。

1H-四唑和相关的衍生物如5-乙基硫代-1H-四唑、5-苄基硫代-1H-四唑可能会使目标分子分解。因此，酸敏感的保护基团的离解在不同的出版物(Krotz等，Tetrahedron Letters，1997，38，3875)中有报道。

还已知使用氯-(2-氰基乙氧基)-N，N-二异丙基氨基膦使酸不稳定的保护基团不经意地脱保护。除易于使所用保护基团离解外，所述亚磷酸酯化试剂会导致较大量的3’-3’异构体。这导致必须通过时间和成本密集的层析步骤来提纯所得酰胺化物(amidite)。

尤其是在低聚亚磷酰胺的亚磷酸酯化的应用中，已知方法通常导致分解或目标分子和副产物的络合混合物。

使用具有某些活化剂的双磷对单体核苷酰胺化物通常是已知的，但在低聚核苷酸的情况下，低反应性使得该途径非常复杂。

低反应性还导致长反应时间(2-6小时)。避免长反应时间会需要使用大量过量的亚磷酸酯化试剂和活化剂。在这种反应结束时，还需要额外的提纯步骤来处理。

EP0906917A2和Hayakawa等，J.Am.Chem.Soc.120(1998)12395-12401公开了将咪唑三氟甲磺酸盐用于合成亚磷酰胺。所述合成的产率和纯度不能重现。

此外，Hayakawa方法通过使用单独制备、分离和提纯的活化剂而应用。在提纯对水敏感的活化剂时，需要将这种活化剂在完全干燥的条件下储存。

这种活化剂的敏感性和低反应性将导致复杂的处理，这对于大规模合成酰胺化物是有困难的。

在使用Hayakawa活化剂的所有试验中，必须通过成本密集的层析步骤提纯所得酰胺化物。

然而，在所有情况下，亚磷酸酯化反应的结果是不完全且低效率的，因此总是非常需要提纯步骤。

敏感的低聚核苷酸的亚磷酸酯化大多数最终分解。

所述合成的产率和纯度不能重现，因为所用咪唑三氟甲磺酸盐具有高的亲核特征和高的吸水倾向。这些特性会最终导致大量分解和水解。将所述活化剂分离并以其纯的形式使用。

所述合成酰胺化物的方法需要快速层析以提纯目标化合物。

此外，Hayakawa使用用于形成核苷酸分子间键(酰胺化物与核苷缩合)的化合物。

Hayakawa等，J.Org.Chem.61(1996)7996-7997公开了将苯并咪唑三氟甲磺酸盐用于亚磷酰胺和核苷的缩合。

Hayakawa等，J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165-8176公开了将酸/唑络合物用于亚磷酰胺和核苷的缩合。

Arnold等，Collect.Czech.Chem.Commun.54(1989)523-532公开了低聚脱氧核苷酸的自动氯化物(chloridite)和酰胺化物合成，尤其是将1-甲基咪唑用于亚磷酰胺和核苷的缩合。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备亚磷酸酯化化合物并克服至少一些现有技术缺点的方法。

本发明的另一目的是提供与现有技术的活化剂相比具有改进性能的活化剂。

本发明的另一目的是提供与现有技术的活化剂相比具有改进性能的活化剂/添加剂混合物。一方面，本发明提供了一种包括如下步骤的制备亚磷酸酯化化合物的方法：

-使含有羟基的化合物与亚磷酸酯化试剂在具有式I的活化剂存在下反应：

其中

R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基

R₁、R₂＝H或者一起形成5到6元环

X₁、X₂＝独立地为N或CH

Y＝H或Si(R₄)₃，其中R₄＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基

B＝脱质子酸。

活化剂可以采用化学计量或催化量(3-50摩尔％，优选10-30摩尔％)或过量(至多300摩尔％)的量。

在优选实施方案中，活化剂具有选自如下的式：

其中

Y如上所定义

R为甲基、苯基或苄基。

这些活化剂的制备例如描述于Hayakawa等，J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165-8176中。

在一个实施方案中，活化剂与添加剂组合使用。添加剂可选自非质子化形式的具有式I的化合物和其它杂环碱如吡啶。活化剂和添加剂之间的合适比例为1∶1到1∶10。

在一个优选实施方案中，活化剂可按“原位”工艺制备。此时不分离活化剂，这导致改进的反应结果。抑制了目标分子的水解或分解。

对于在低聚核苷酸(二、三、四、五、六、七和八聚物)的3’-和/或5’-位的高产率亚磷酸酯化，优选原位制备活化剂和与添加剂的组合。

如上所述，亚磷酸酯化尤其可用于合成低聚核苷酸和亚磷酰胺结构单元。因此，在优选实施方案中，含羟基化合物包含糖结构部分如核苷或由其衍生的低聚物。这类核苷例如为任选地包含保护基团的腺苷、胞嘧啶、鸟苷和尿嘧啶、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞嘧啶及其衍生物。

本发明方法尤其可用于使低聚核苷酸(二、三、四、五、六、七和八聚物)亚磷酸酯化。这类亚磷酸酯化的低聚核苷酸例如用于通过片段缩合(fragment condensation)思想合成大的低聚核苷酸。

通常将它们在其杂环官能团和除了应亚磷酸酯化的羟基外的带有羟基的基团处进行合适的保护。通常将二甲氧基三苯甲基、一甲氧基三苯甲基或含有甲硅烷基的保护基团(如TBDMS)用作5’-OH基团的保护基团，并使3’-OH基团亚磷酸酯化。

还可以用保护基团(LEV、TBDMS等)将3’-OH基团保护起来并且脱保护的5’-OH使得核苷或核苷酸可以’-O-亚磷酸酯化。

亚磷酸酯化的方法可用于合成3’-或5’-亚磷酰胺并具有相同的结果。

亚磷酸酯化反应得到的目标分子为亚磷酰胺的一个实施方案且具有如下结构：

Z表示离去基团如CH₃、C₂H₅、CH₂C₆H₅、-CH₂CH₂CN、-CH₂CH＝CHCH₂CN、对-CH₂C₆H₄CH₂CN、-(CH₂)_2-5N(H)COCF₃、-CH₂CH₂Si(C₆H₅)₂CH₃或-CH₂CH₂N(CH₃)COCF₃，其中R₃为具有1至约6个碳的烷基；或R₃为含有4-7个原子且具有至多3个选自氮、硫和氧的杂原子的杂环烷基或杂环烯基环，“化合物”为含羟基化合物的剩余部分，如核苷、核苷酸或低聚核苷酸。

此时P(III)原子与2个氧原子(或形成2个P-O键)和1个氮原子(形成一个P-N键)连接，其中所述氮原子属于氨基，优选二异丙基胺，二乙基胺或其它仲胺。

亚磷酰胺与其它分子(化合物A)的其它羟基的缩合反应将产生具有如下结构的亚磷酸三酯：

此时P(III)原子与3个氧原子(形成3个P-O键)连接且没有与氮连接。

通常而言，亚磷酸酯化试剂可与使用1H-四唑的亚磷酸酯化反应中的相同。

在优选实施方案中，其具有下式：

其中，Z表示离去基团如CH₃、C₂H₅、CH₂C₆H₅、-CH₂CH₂CN、-CH₂CH＝CHCH₂CN、对-CH₂C₆H₄CH₂CN、-(CH₂)_2-5N(H)COCF₃、-CH₂CH₂Si(C₆H₅)₂CH₃或-CH₂CH₂N(CH₃)COCF₃，R₁和R₂独立地为仲氨基N(R₃)₂，其中R₃为具有1至约6个碳的烷基；或R₃为含有4-7个原子且具有至多3个选自氮、硫和氧的杂原子的杂环烷基或杂环烯基环。

典型的亚磷酸酯化试剂为2-氰基乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺。

其它优选的亚磷酸酯化试剂为作为参考引入的N.Ok等，J.Am.Chem.Soc.2003，125，8307-8317中所述的唑膦烷(oxazaphospholi-dine)衍生物。所述亚磷酸酯化试剂使得可以合成低聚核苷酸，其中核苷酸分子间键可以通过立体选择性方式转化为硫代磷酸酯(phosphothioate)。这种非对映异构选择合成的核苷酸硫代磷酸酯分子间键对于硫代磷酸酯用作反义药物具有有利的影响。

合适的脱质子酸B^-的实例为三氟甲磺酸根、三氟乙酸根、二氯乙酸根、甲磺酰基、甲苯磺酰基、邻氯酚离子。优选pKa低于4.5的酸。优选它们具有低的亲核性。

在一个实施方案中，反应在分子筛或其它结合水的试剂存在下进行。通常在反应过程中应排除水或者通过所选干燥介质将水固定。

或者，可将本发明活化剂与亚磷酸酯化试剂组合，随后加入羟基组分。也可以将活化剂与含羟基化合物组合，随后加入亚磷酸酯化试剂。

在使用添加剂的情况下，将活化剂与羟基组分在加入亚磷酸酯化试剂之前混合。

对于“原位”产生活化剂，优选将所选酸在加入添加剂之后在可控的反应温度下加入。

亚磷酸酯化试剂可在加入所选酸之前或之后加入。

相对于酸和亚磷酸酯化试剂的加入，核苷组分可在结束或开始时加入。

在优选的实施方案中，将活化剂对应的碱、含羟基化合物和亚磷酸酯化试剂组合并且加入酸开始反应。

本发明的另一目的为具有式I的活化剂在用亚磷酸酯化试剂使含羟基化合物亚磷酸酯化中作为活化剂的用途：

其中

R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基

R₁、R₂＝H或者一起形成5到6元环

X₁、X₂＝独立地为N或CH

Y＝H或Si(R₄)₃，其中R₄＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基

B＝脱质子酸。

本发明的另一目的为活化剂和非质子化碱(添加剂)的组合，其中在这两种物质之间将会形成平衡。与现有技术的活化剂相比，所得平衡显示改进的性能。

尤其是与丙酮结合使用时，活化剂/催化剂不会显示已知的副反应(分解或形成3’-3’或5’-5’同系物)。丙酮还具有溶解离析物和试剂的能力。

根据现有技术，在较长反应时间的情况下，释放的二异丙基胺以及存在活化的双磷导致目标化合物分解(脱三苯甲基、CE-离解、脱嘌呤或其它保护基团的离解)。丙酮和特定的活化剂制剂的存在降低了这些倾向。

存在的丙酮猝灭了在亚磷酸酯化工艺中释放的任何量的二异丙基胺(DIPA)的活性。这可用于较短和较长的低聚核苷酸的亚磷酸酯化且具有类似的结果(没有分解)。也可使用其它具有式R_x-C(＝O)-R_y(其中R_x和R_y独立地为C₁-C₆烷基或一起形成环烷基)的酮化合物，只要它们能够在例如α-位具有CH₂-基团的胺存在下形成烯醇化物。

此外，使用丙酮允许较长的反应时间而没有5’-O保护基团的离解。在两种情况下，使用丙酮会保护不同的保护基团并避免已知的脱嘌呤倾向。

与例如乙腈相比，丙酮还具有较好的毒性特性和改进的环境性能且廉价。

因此，另一目的为丙酮在亚磷酰胺的合成中作为反应介质或共溶剂的用途。

活化剂与一定量的添加剂的组合支持了较长且敏感的低聚核苷酸(3’或5’脱保护)的亚磷酸酯化工艺的较高有效性。

通常，试剂的反应性增加到在2-5分钟后结束合成。

通过使用本发明方法不需要额外的提纯步骤。

所得单体和低聚酰胺化物可用于低聚核苷酸的固相和液相合成。

活化剂或活化剂/添加剂组合尤其可用于合成腺苷亚磷酰胺、胞嘧啶亚磷酰胺、鸟苷亚磷酰胺和尿嘧啶亚磷酰胺、脱氧腺苷亚磷酰胺、脱氧鸟苷亚磷酰胺、脱氧胸苷亚磷酰胺、脱氧胞嘧啶亚磷酰胺以及具有式Xn的低聚核苷酸氨基磷酸酯，其中每个X选自A、dA、C、dC、G、dG、U、dT且n＝2-30，优选2-12，更优选2-8或2-6，及其包含保护基团的衍生物。

此处使用的低聚核苷酸还包括呈RNA和DNA形式的低聚核苷、低聚核苷酸类似物、改性的低聚核苷酸、核苷酸类似物等。通常而言，这些化合物包含键接的单体亚单元骨架，其中各键接的单体亚单元与杂环碱结构部分直接或间接连接。连接单体亚单元、单体亚单元和杂环碱结构部分的键的结构可以不同，从而产生多种获得所述合成化合物的动因。

在本领域中已知的改性为杂环碱、糖或连接单体亚单元的键的改性。核苷酸分子间键的变型例如描述于作为参考引入的WO2004/011474中，从第11页的底部开始。

典型的衍生物为硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯和膦酸烷基酯以及二氧磷基丙酮(phosphonoaceto)衍生物。

其它典型的改性位于糖结构部分。或者通过不同的糖取代核糖或者一个或多个位置被其它基团如F、O-烷基、S-烷基、N-烷基取代。优选实施方案为2′-甲基和2′-甲氧基乙氧基。所有这些改性均在本领域已知。

对于杂环碱结构单元，存在许多在本领域中使用的其它合成碱，如5-甲基-胞嘧啶、5-羟基-甲基-胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-或2-烷基衍生物、2-硫尿嘧啶。这类改性例如公开于WO2004/011474中，从第21页开始。

当用于合成时，这些碱通常具有保护基团，如N-6-苄基腺嘌呤、N-4-苄基胞嘧啶或N-2-异丁酰基鸟嘌呤。通常而言，所有不欲在进一步的反应中反应的反应性基团，尤其是糖的羟基均应保护。

在涉及合成低聚核苷酸亚磷酰胺的实施方案中，可用于在丙酮或其它酮如丙酮、丁酮、戊酮、己酮、环己酮存在下进行反应，所述酮可用作反应介质或其它溶剂的共溶剂。

具体实施方式

本发明通过如下非限制性实施例进一步说明。

实施例1 

使用甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-T-3’-O-亚磷酰胺

将5.0g 5’-O-DMTr-T-3’-OH(9.2mmol，1.0当量)和2.34g甲基-咪唑-三氟乙酸盐(11.9mmol，1.3当量)溶于100ml二氯甲烷中并加入3g分子筛3并将混合物搅拌10分钟。加入3.8ml 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(11.9mmol，1.3当量)。反应在2小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：95％。

实施例2

使用苄基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将322mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(1.64mmol，1.05当量)和1.0g5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-OH(1.56mmol，1.0当量)溶于10ml二氯甲烷中并加入500mg分子筛3。30分钟后，将0.52ml 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(1.64mmol，1.05当量)和0.1ml丙酮加入到搅拌的溶液中。反应在30分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：74％。

实施例3

使用甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dC^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将9.51g 5’-O-DMTr-dC^Bz-3’-OH(15mmol，1.0当量)溶于80ml丙酮和80ml乙腈中。将6.17g甲基-咪唑-三氟乙酸盐(32mmol，2.1当量)和9.64g 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(32mmol，2.1当量)加入到搅拌的溶液中。反应在30分钟之后完成。加入500ml乙酸乙酯，用250ml NaHCO₃溶液和250ml盐水萃取该溶液两次。用MgSO₄干燥有机层并蒸发至干燥。将残留物溶解在40ml二氯甲烷中，加入250ml戊烷，将上层清液滗析，并将残留物在减压下干燥形成无色泡沫。产率(12.0g，14.4mmol)：96％，纯度(通过HPLC测定)：93％。

实施例4

使用苄基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dA^Bz-3’-O-亚磷酰胺

38mg苄基-咪唑-三氟乙酸盐(0.14mmol，1.5当量)溶于5ml乙腈中并加入300mg分子筛3。加入145μl 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.46mmol，5.0当量)。30分钟后加入61mg5’-O-DMTr-dA^Bz-3’-OH(0.09mmol，1.0当量)，将溶液搅拌过夜。反应在17小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：91％。

实施例5

使用催化量的甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dC^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将500mg 5’-O-DMTr-dC^Bz-3’-OH(0.79mmol，1.0当量)溶于18ml二氯甲烷和1ml DMF中，加入3g分子筛3。将50mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(0.17mmol，0.2当量)和276μl2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.87mmol，1.1当量)加入到搅拌的溶液中。反应在24小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：89％。

实施例6

使用催化量的苄基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将5mg苄基-咪唑-三氟乙酸盐(0.02mmol，0.2当量)溶于5ml乙腈中并加入300mg分子筛3。将145μl2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.46mmol，5.0当量)加入到搅拌的溶液中。1小时后加入60mg 5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-OH(0.09mmol，1.0当量)，将溶液搅拌过夜。反应在48小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：90％。

实施例7

使用催化量的苄基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-T-3’-O-亚磷酰胺

将50mg苄基-咪唑-三氟乙酸盐(0.18mmol，0.18当量)和500mg 5’-O-DMTr-T-3’-OH(0.92mmol，1.0当量)溶于28ml二氯甲烷中并加入3g分子筛3。将350μl 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(1.0mmol，1.1当量)加入到搅拌的溶液中。反应在25小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：90％。

实施例8

使用  甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将100mg 5’-O-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-3’-OH(0.10mmol，1.0当量)和24.4mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(0.11mmol，1.1当量)溶于10ml二氯甲烷中，加入200mg分子筛4。将32μl 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.10mmol，1.0当量)加入到搅拌的溶液中。反应在24小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：60％。

实施例9

使用甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dC^Bz-P(S)-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将100mg 5’-O-DMTr-dC^Bz-P(S)-dG^iBu-3’-OH(0.09mmol，1.0当量)和17.8mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(0.09mmol，1.0当量)溶于10ml二氯甲烷中，加入200mg分子筛4。将28μl2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.09mmol，1.0当量)加入到搅拌的溶液中。反应在3小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：56％。

实施例10

使用甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-d G^iBu-P(O)-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将106mg 5’-O-DMTr-dG^iBu-P(O)-dG^iBu-3’-OH(0.10mmol，1.0当量)和30mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(0.15mmol，1.5当量)溶于10ml丙酮中，加入500mg分子筛3。在30分钟之后将34μl 2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.11mmol，1.1当量)加入到搅拌的溶液中。反应在4小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：55％。

实施例11

使用甲基-咪唑-三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-P(S)-T-P(S)-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将10mg 5’-O-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-P(S)-T-P(S)-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-3’-OH(3.6μmol，1.0当量)和1.4mg甲基-咪唑-三氟乙酸盐(7.2μmol，2.0当量)溶于0.5ml丙酮和0.5ml乙腈中，加入50mg分子筛3。在30分钟之后将5.8μl2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(18.1μmol，5.0当量)加入到搅拌的溶液中。反应在5小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：71％。

实施例12

经由原位产生N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dT-3’-O-亚磷酰胺

将1.00g 5’-O-DMTr-dT-3’-OH(1.84mmol，1.0当量)溶于2mL二氯甲烷和2mL丙酮中。加入300mg N-甲基咪唑(3.68mmol，291μL，2.0当量)和665mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(2.21mmol，700μL，1.2当量)，之后加入1.00g分子筛。向所述搅拌的悬浮液中，滴加在1mL二氯甲烷中的230mg三氟乙酸(2.02mmol，159μL，1.1当量)。反应在3小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：99％。

实施例13

经由原位产生N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将1.00g 5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-OH(1.56mmol，1.0当量)溶于2mL二氯甲烷和2mL丙酮中。加入255mg N-甲基咪唑(3.11mmol，247μL，2.0当量)和563mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.87mmol，593μL，1.2当量)，随后加入1.00g分子筛。向所述搅拌的悬浮液中，滴加在1mL二氯甲烷中的195mg三氟乙酸(1.72mmol，135μL，1.1当量)。反应在5小时之后完成。产率(通过HPLC测定)：88％。

实施例14

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐-N-甲基咪唑混合物合成5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将1.00g 5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-OH(1.56mmol，1.0当量)溶于2mL二氯甲烷和2mL丙酮中。加入2.00g分子筛、367mg N-甲基咪唑三氟乙酸盐(1.87mmol，1.2当量)和383mg N-甲基咪唑(4.68mmol，371μL，3.0当量)，随后加入563mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.87mmol，593μL，1.2当量)。反应在20分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：90％。

实施例15

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐-N-甲基咪唑混合物合成5’-O-DMTr-dC^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将1.00g 5’-O-DMTr-dG^iBu-3’-OH(1.56mmol，1.0当量)溶于2mL二氯甲烷和2mL丙酮中。加入2.00g分子筛、367mg N-甲基咪唑三氟乙酸盐(1.87mmol，1.2当量)和383mg N-甲基咪唑(4.68mmol，371μL，3.0当量)，随后加入563mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.87mmol，593μL，1.2当量)。反应在20分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：90％。

实施例16

经由原位产生甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-DMTr-dC^Bz-P(O)-dA^Bz-3’-O-亚磷酰胺

将100mg 5’-O-DMTr-dC^Bz-P(O)-dA^Bz-3’-OH(90.7μmol，1.0当量)溶于200μL二氯甲烷和200μL丙酮中。加入15mg N-甲基咪唑(180μmol，14μL，2.0当量)和54.6mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(181μmol，57μL，2.0当量)，随后加入100mg分子筛。向所述搅拌的悬浮液中滴加100μL的1M三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液。反应在30分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：90％。

实施例17

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-亚磷酰胺-dT-P(O)-dG^iBu-P(O)-dG^iBu-3’-O-Lev

将2.0g 5’-HO-dT-P(O)-dGi^Bu-P(O)-dG^iBu-3’-O-Lev(1.6mmol，1.0当量)溶于80mL丙酮中，加入500mg甲基咪唑三氟乙酸盐(2.5mmol，1.56当量)和4.0g分子筛。加入2.76ml 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(2.62g，8.7mmol，5当量)，在搅拌30分钟之后，通过加入300mL正庚烷使亚磷酰胺沉淀。产率(通过HPLC测定)：72％。

实施例18

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-亚磷酰胺-dC^Bz-P(O)-dA^Bz-3’-O-Lev

将1.0g 5’-HO-dC^Bz-P(O)-dA^Bz-3’-O-Lev(1.1mmol，1.0当量)和326mg甲基咪唑三氟乙酸盐(1.66mmol，1.5当量)溶于8mL丙酮和10mL二氯甲烷中并加入2.0g分子筛。加入700μL2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(664mg，2.2mmol，2当量)，并在搅拌1小时之后，通过加入50mL正庚烷使亚磷酰胺沉淀。产率(通过HPLC测定)：78％。

实施例19

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-亚磷酰胺-T-P(O)-dC^Bz-P(O)-dC^Bz-P(O)-dC^Bz-3’-O-Lev

将20mg 5’-HO-T-P(O)-dC^Bz-P(O)-dC^Bz-P(O)-dC^Bz-3’-O-Lev(11.6μmol，1.0当量)和4.3mg N-甲基咪唑三氟乙酸盐(22μmol，1.9当量)溶于2mL丙酮中并加入40mg分子筛。加入15μL2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(14mg，47μmol，4当量)，并在搅拌1小时之后，通过加入3mL正庚烷使亚磷酰胺沉淀。产率(通过HPLC测定)：86％。

实施例20

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-TBDPS-dT-3’-O-亚磷酰胺

将510mg 5’-O-DMTr-dT-3’-OH(1.06mmol，1.0当量)溶于20mL丙酮中，在搅拌下加入251 N-甲基咪唑三氟乙酸盐(1.27mmol，1.2当量)，1.0g分子筛和383mg 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(403μL，1.27mmol，1.2当量)。反应在30分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：88％。

实施例21

使用N-甲基咪唑三氟乙酸盐合成5’-O-TBDMS-dG^iBu-3’-O-亚磷酰胺

将1mg 5’-O-TBDMS-dG^iBu-3’-OH(2.21mmol，1.0当量)溶于20mL丙酮中，在搅拌下加入875 N-甲基咪唑三氟乙酸盐(4.42mmol，2当量)、2.0g分子筛和3.33g 2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(3.5mL，11mmol，5当量)。反应在30分钟之后完成。产率(通过HPLC测定)：88％。