选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

摘要

产生雄性或雌性不育植物的方法，所述方法包括步骤：用编码至少一个酶的多核苷酸转化植物材料，所述酶与非毒害植物的物质反应产生毒害植物的物质，并将所得的经转化的材料再生成植物，其中对植物施用所述非毒害植物的物质直至雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，这样非毒害植物的物质提供毒害植物的物质的产生，所述毒害植物的物质选择性地阻止所述配子体的形成或使其无功能，其中所述酶优先地在雄性或雌性生殖结构中表达并且所述非毒害植物的物质是D－α氨基酸，或非蛋白D－α氨基酸的肽衍生物，其特征在于所述酶是可获自纤细红酵母的突变型D－氨基酸氧化酶，所述氧化酶在位点58上包含赖氨酸而不是野生型序列中的苯丙氨酸。

说明书

作物中的杂种优势可具有显著的提高产量的效应。通常，与非杂交品种相比，杂种表现出增加的产量。杂种通常给生长因素例如水和肥料以更高的回报单位。杂种通常提供更优的逆境耐受性、在产量和成熟上的一致性，并且也提供简单的将以其它方法可能难以组合的特征或性状给合起来的育种机会。植物中的杂种优势通常大到足以保证商业利用。商用杂种被广泛地应用于许多作物中，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和油菜(canola)。然而，主要由于缺乏经济的杂交种子生产方法，小麦、大麦和水稻仍然主要以近亲交配繁育。

常规上，杂交种子的生产包括分区种植雌性和雄性亲本系并且只从雌性亲本收获种子。为确保该种子是杂种，必需通过使雌性系产生雄性不育从而将雌性亲本的自体受粉减少到最小。用于使雌性亲本系雄性不育的方法包括机械的、化学的和遗传的方法。在雌雄异体的植物例如玉米中，可很容易地通过除去雄性花序机械地获得雄性不育。然而绝大部分作物是雌雄同株并且在同一朵花中具有雄性和雌性器官，这使得这种物理去雄不具实用性。因此有时使用遗传方法。

发生的遗传雄性不育性状通常是由核基因控制的，其中相对于对应的与能育性相关的等位基因，与雄性不育表型相关的等位基因通常是隐性表达的。在遗传雄性不育发生时，其通常与单个隐性基因相关，所述稳性基因必需是纯合的，这样雄性不育才得以表达。为了在实践中应用这种遗传雄性不育性状，育种家通常培育表型一致的雌性系，所述雌性系分离成雄性不育和雄性可育植物。需要除去雄性可育植物(一旦鉴定)，这是项费力的工作。因为雄性可育植物对保持群体是必需的，所以不能从群体中将其清除，从而使得保持亲本系一直成问题。除了依赖天然存在的雄性不育等位基因外，也可能使用分子生物学方法。可通过基因工程改造植物，使其表达例如反义或核酶基因，所述基因可降低或消除可育花粉形成所必需的关键基因的表达。这种转基因植物系是雄性不育的，并且通过与来自雄性可育植物的花粉杂交可用来生产杂交种子。这些系的主要问题是通过与等基因可育系杂交，其只能在后代中以杂合状态保持。当产量非常重要时，这在杂交种子生产中可能是个问题。尽管例如通常将除草剂抗性与雄性不育连锁起来，就可能选择性地除去雄性可育植物，但这要确保所述植物一开始要以相当高的密度种植。

使用细胞质雄性不育用于商业杂种生产要求有稳定的雄性不育细胞质和花粉来源。雄性不育细胞质遗传系统要求用于杂种生产的三种类型的系存在，A系(细胞质雄性不育系)、B系(雄性可育保持系)和R系(具有恢复基因的雄性可育系)。用该系统产生的三系杂交涉及4系的保持和生产，近亲交配的A和B系和另外两系的雄性可育近亲交配。对单一雄性不育细胞质来源的依赖性可使育种的灵活性降到最低并且导致后代大规模地对特定疾病的易感性。

也可通过抑制有活力的花粉形成的化学物质生产杂交种子。这些化学物质(称为杀配子剂)用于提供瞬时雄性不育。但是杀配子剂的费用、注册和可靠性已限制其使用。

常规的杂种种子生产系统的缺点是需要分行或分区种植雄性和雌性亲本系。在释放少量不能随风传播较远的花粉的作物例如小麦中，低效率的授粉是尤其迫切的问题。在这些作物中多达三分之二的杂种生产田地需要供给雄性花粉供体植物，从而使得杂交种子生产变得很不经济。

为了在小麦或其它作物中获得更经济的杂交种子生产，需要将雄性和雌性植物移得更近以更有效地传授花粉；最有效地是在同一行中将雄性和雌性在数厘米内间作。在这种系统中只收获来自(雄性不育)雌性亲本的种子是不现实的。通过在种植混合物中使用尽可能低的这种雄性亲本植株和/或通过使用雌性不育的雄性植株可最大限度地减少来自雄性亲本的非杂交种子的污染。用于构建显性雌性不育系的方法已在(EP412,006A1(1990)；Goldman等人，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)中描述，但对于雄性不育系，其必须以杂合子保持。

因此，存在着对用于生产杂交种子的简单经济的方法的需要。特别是为了有效地生产杂交种子，存在着对提供雄性不育雌性亲本系和雌性不育雄性亲本系的需要，它们可容易地以纯的纯合系保持和用于有效地生产杂交种子。在本领域中描述的用于实现该目的的方法包括从雄性和雌性亲本系生产杂交种子的方法，在所述雄性和雌性亲体系中至少有一个包含优选地在花组织中表达的异源嵌合基因，所述嵌合基因使得株系条件性地不育，所述不育依赖于外源非毒害植物的物质的施用，所述非毒害植物的物质可通过由所述异源嵌合基因编码和优选地在雄性或雌性生殖结构中表达的酶特异性和局部地转化成毒植物素。所述非毒害植物的物质可以是前除草剂(pro-herbicide)。具有这种条件性不育亲本系的有利方面是允许其以不育性状的纯合体保持。能育性只是在施用外源非植物毒性物质时被破坏。在一个这样的条件性雄性不育系统的例子中，编码脱乙酰基酶的基因优选地在雄花组织的绒毡层细胞中表达，在所述细胞中其将外源施用的前除草剂N-乙酰L膦丝菌素转化成毒植物素L膦丝菌素，从而阻止了有活力的花粉形成。在进一步类似的例子中：(i)绒毡层优选地表达的细菌细胞色素P450催化前除草剂R7402转化成阻止有活力的花粉形成的磺脲毒植物素；和(ii)绒毡层优选地表达的膦酸单酯水解酶催化甘油草甘膦将前除草剂转化成阻止有活力的花粉形成的毒植物素草甘膦。WO98/03838描述了条件性雌性不育系统的例子，其中能够将所述前除草剂转化成植物毒素的酶优选地在雌性生殖结构中表达。

尽管存在这些用于生产条件性不育的雄性和雌性亲本系的方法，杂交种子的产量仍然远不能满足在作物例如小麦的常规应用。本发明特别涉及到在本领域内提高条件性雄性不育的雌性亲本系和条件性雌性不育的雄性亲本系的生产。

本发明涉及改进用于生产作物杂交种子的方法。特别是本发明涉及从雄性和雌性亲本系中生产杂交种子的方法，所述雄性和雌性亲本系中至少有一种是条件性雌性或雄性不育的，所述不育依赖于外源施用对作物为非植物毒性的和包括前除草剂的物质。本发明进一步涉及在使条件性不育亲本系中自体受精被减少到最低或被阻止的时间和足够量施用所述非植物毒性物质的方法。本发明也涉及通过用一个或多个嵌合基因转化植物材料以生成条件性雄性或雌性不育植物的方法，其中所述嵌合基因单个地或一起编码一个或多个能够与非毒害植物的物质(优选地以前除草剂的形式存在)反应产生毒害植物的物质的酶。在一个或多个启动子有效地控制下表达酶，所述启动子在条件性雄性不育植物的情况下使所述酶优先地在雄性生殖结构中表达或在条件性雌性不育植物的情况下使所述酶优先地在雌性生殖结构中表达。所述植物材料再生成形态学正常的能育植物(条件性雄性或雌性不育的植物)。本发明也包括使用条件性雄性不育植物与条件性雌性不育植物更有效地产生杂交种子，使用某些前除草剂作为非毒害植物的物质和使用嵌合基因以更有效地生产杂交种子，本发明也包括用于本发明的嵌合基因和酶。本发明也提供条件性雄性不育、条件性雌性不育植物、这些植物的种子和通过所述方法产生的杂交种子。在本发明优选的实施方案中，用于所述制备杂交种子的方法的作物是玉米、水稻、高梁、小麦、粟、燕麦、油菜和大麦。

根据本发明，提供了生产雄性或雌性不育植物的方法，所述方法包括步骤：用编码至少一种与非毒害植物的物质反应生成毒害植物的物质的酶的多核苷酸转化植物材料，并且将所得的转化材料再生成植物，其中将所述非毒害植物的物质施用于所述植物直至雄性或雌性配子形成和/或成熟的时候，这样所述非毒害植物的物质提供了选择性地阻止所述配子形成或使所述配子无功能的毒害植物的物质的产生，其中所述酶优先地在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于(i)所述非毒害植物的物质选自D-α氨基酸、非蛋白D-α氨基酸的肽衍生物和(ii)所述酶是在对应于野生型纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)D-氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸的位点上具有赖氨酸的D-氨基酸氧化酶的突变体形式。

由于最大化杂交种子的产量并因此而使对任何作物的损害降到最低是想要的目的，因此在优选的实施方案中，所述非毒害植物的物质是选自对作物相对为非毒害植物的物质的前除草剂。为了能够影响花组织，前除草剂在‘非绿色’组织中是有效的毒植物素的前体也是想要的。因此，在优选的本发明的实施方案中，前除草剂选自毒植物素的前体，所述毒植物素直接对非绿色组织具有毒害植物的作用而不是选自主要作用位点是光合作用或产生光合色素的那些。使杂交种子生产的成本降到最低也是想要的目的。因此，在优选的实施方案中，前除草剂选自化学物质，所述化学物质已获得合适的管理机构批准用于作物或正在审批的化学物质。

术语：定义

此处所用的‘基因’是指任何包含几个有效地连接的DNA片段例如启动子和5’调节区域、编码序列以及包含聚腺苷酸化位点的非翻译3’区域的DNA序列。

当涉及基因或DNA序列时，‘嵌合的’用于表示在自然界中，所述编码序列与启动子或与基因中的至少一个其它DNA调节区域不相关的事实。

如此处所用的，‘嵌合基因’是指一种基因，其中在自然界中基因的编码序列与启动子或与至少一个其它DNA调节区域不相关。

此处所用的‘表达盒’是指包含嵌合基因的可翻译的DNA区域，所述嵌合基因的侧翼连接着一个或多个限制性或其它位点，所述位点有利于从一个DNA座位的精确切割和插入另一个座位。

‘非毒害植物的物质’在本发明中是指对用于本发明方法的植物、任何特定的作物的细胞或组织相对无植物毒害的物质。非毒害植物的物质不必在所有植物的所有组织中是非毒害植物的。非毒害植物的物质包括前除草剂，所述前除草剂是对植物组织没有可察觉的直接毒害作用但却是活性毒植物素的前体的物质。在易感的植物物种中，这种前除草剂通过内源性酶的作用间接地起着除草剂的作用，所述内源性酶可在植物体内将其转化成毒植物素。

‘毒植物素’在本发明中是指对在本发明方法中使用的植物、植物组织和特定作物的植物细胞具有毒害的物质。这种毒植物素不必在来自所有植物种类的所有植物细胞中都毒害植物。

‘雌性生殖结构’是指雌性配子和专门负责雌性配子产生、成熟和生存力的植物部分。通常其包含植物的这些部分，所述部分包含心皮或雌蕊(“花柱”)。植物的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房和由柱头、花柱和子房包含的细胞或组织。

‘雄性生殖结构’是指雄性配子和专门负责雄性配子产生、成熟和生存力的植物部分。其包括植物的这些部分，所述部分包括例如小孢子、雄蕊、绒毡层、花药和花粉。

此处所用的‘雌性不育植物’是在用有功能或有活力的花粉授粉后不能支持有活力的种子形成的植物。这种雌性不育可以是育种选择或转基因存在造成的。‘条件性雌性不育植物’是指在正常生长条件下是雌性可育的而在特定的条件下可变成雌性不育的植物。在本发明中所述条件包括外源施用前除草剂或其它非毒害植物的物质。在本发明中这种‘雌性不育植物’或‘条件性雌性不育植物’保持雄性可育并能产生有活力的花粉。

此处所用的‘雄性不育植物’是不能支持有活力的花粉形成的植物。这种雄性不育可能是育种选择或转基因的存在造成的。‘条件性雄性不育植物’是指在正常条件下是雄性可育的而在特定条件下可变成雄性不育的植物。例如，所述条件可以包括物理去雄或施用特定的化学杀配子剂。在本发明中所述条件特别包括前除草剂或其它非毒害植物的物质的外源施用。在本发明中这种‘雄性不育植物’或‘条件性雄性不育植物’保持雌性可育并能在用有功能或有活力的花粉授粉后产生有活力的种子。

此处所用的‘启动子区域’是DNA区域，所述DNA区域至少包含功能性启动子和任选地一些或所有与其相关的上游调节序列(包括增强子序列)和/或相关的下游序列(包括一些或所有相对于启动子为内源的基因的5’非翻译区域)。

此处所用的‘间作’是指在田间种植种子或植物的方法，所述方法确保由雄性可育植物充分地给雄性不育或条件性雄性不育植物异花传粉。通过在种植植物之前以不同的混合比例(80/20；90/10；等)随机地混合雌性和和雄性亲本种子或通过以特定的田间模式(其中不同种子交替播种)种植来实现该方法。当要求从不同植物中分开收获时，以交替区或行种植植物是优选的。

在本发明的方法中，所述非毒害植物的物质可以和至少一种其它的物质混合使用，所述其它物质可选自氨基酸、安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导剂、细胞色素P450诱导剂、肥料、除草剂、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。在特定的实施方案中所述非毒害植物的物质可与其前体是所述非毒害植物的物质的毒害植物的物质混合使用。

所述酶是D-氨基酸氧化酶的突变体形式，所述突变体在对应于来自纤细红酵母的野生型D-氨基酸氧化酶的第58位残基的序列位置上具有赖氨酸，而在所述野生型序列中该残基是苯丙氨酸(即所述突变体是F58K突变体)，非毒害植物的物质可以是D-氨基酸和特别地其可以是膦丝菌素的D对映异构体、双丙氨膦的D对映异构体或选自D-天冬氨酸和D-谷氨酸。

突变D-氨基酸氧化酶(DAMOX)可以来源于例如由红冬孢属物种(红酵母属物种)、三角酵母属物种、猪、镰孢属物种、假丝酵母属物种、裂殖糖酵母属物种和轮枝孢属物种产生的酶和也可以例如选自具有对应于Swissprot检索号P80324、Q99042、P00371、P24552或SPTREMBL号Q9HGY3和Q9Y7N4的序列的蛋白的F58K等同突变体。编码野生型D-氨基酸氧化酶的起始DNA序列可选自例如包含于EMBL登录号A56901、RGU60066、Z50019、SSDA04、D00809、AB042032、RCDAAOX、A81420和SPCC1450的序列。

特别优选的D-氨基酸氧化酶是来自纤细红酵母的酶的突变体形式。这种突变体总是在第58位上具有赖氨酸(即其是野生型序列的F58K突变体)和可以在其它的位点发生突变，以及特别地可在位点213、223和238(与野生型序列比较时)上进一步包含单、双或三氨基酸替代。优选地213位点的野生型甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或223位点的野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或238位点的野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。在特别优选的实施方案中213位点上的甲硫氨酸被丝氨酸取代。在另一个特别优选的实施方案中位点213的甲硫氨酸被苏氨酸取代。

当非毒害植物的物质是D-氨基酸而不是D-膦丝菌素或D-双丙氨膦时，那么所述D-氨基酸优选地不是内源植物代谢物并且被选择作为在韧皮部内流动的、在植物中代谢稳定(优选地在植物中具有大于约1周的t1/2)并且为D-氨基酸氧化酶的有效底物的物质。通过酶进行的D-氨基酸氧化伴随着氧还原为毒害植物的过氧化物阴离子。

在优选的实施方案中所述氧化酶被靶向至除了过氧化物酶体以外的亚细胞位置。例如，通过修饰基因例如删除或修饰三个C-末端氨基酸(例如在来源于纤细红酵母的D-氨基酸氧化酶的情况下是SKL)和/或通过向序列的N末端加上叶绿体或线粒体转运肽序列可实现该目的。

通过本领域技术人员已知的和通过本公开内容改进的突变和选择方法优选地可从真菌来源获得其它合适的D-氨基酸氧化酶。

通过在合适的宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)或酵母(合适宿主株系缺少针对D-膦丝菌素的内源性氧化酶或脱氢酶活性)中表达候选突变体D-氨基酸氧化酶文库获得适合用于本发明的进-步的突变体D-氨基酸氧化酶和DNA编码序列，所述宿主细胞经转化产生具有增强的对基本培养基中的D-膦丝菌素产生的生长抑制作用敏感的表型。该方法依赖于经转化的大肠杆菌克隆通过其内源L转氨酶活性和异源表达的氧化酶相结合的作用从D-PPT产生L-PPT的能力。可选择地，在就想要的氧化D-膦丝菌素的活力在体外测定所表达的酶的基础上选择合适的和改进的基因。存在许多用于直接测定D-氨基酸氧化酶活性的方法，例如基于通过使用氧电极除去氧来进行过氧化物(EnzymeMicrob.Technol.，(2000)，27(8)，605-611)检测或基于氨或酮酸产物的直接检测的方法。

在本发明的实施方案中，将来源于真菌的DAMOX基因克隆入穿梭载体，处于能够在宿主生物体中表达的启动子(例如GAL启动子)有效控制下，所述宿主生物体是要在其中进行选择的生物体(优选地是酵母)。然后将该基因接受诱变，例如通过经Mn2+中毒的PCR；在DNA复制/编辑过程中有缺陷的株系例如大肠杆菌株系XL1 red中复制质粒DNA；或通过在使用例如X射线、UV光、加入化学诱变剂进行诱变的宿主株系中复制质粒DNA并转化入宿主生物体(优选地是酵母)中。通过例如下列选择方式，选择想要的编码DAMOX(具有想要的增强的氧化D-PPT的能力的特性)的DNA(在任选的基于存在于所述穿梭载体上的选择标记的初步选择步骤之后，所述标记允许例如通过原养型的恢复或在潮霉素存在的情况下生长等进行筛选)，例如

a)具有利用化学上与D-膦丝菌素相似的氨基酸作为唯一氮源的能力的转化细胞的选择。例如，选择能够在作为唯一N源的D-PPT(和其酯)的类似物上生长的转化酵母菌落，在所述D-PPT类似物中次膦酸部分被羧酸(即D-谷氨酸)、磺酸、膦酸、砜或亚砜部分(或其酯)取代。例如

b)能够利用D-PPT自身作为唯一N源的转化细胞的选择。为进行该选择，也用能够消除L-膦丝菌素对谷氨酰胺合成酶的抑制作用的基因转化宿主细胞。例如所述穿梭载体也包含编码酶例如使L-PPT失活的PAT的基因。

重复突变和选择周期。可进一步克隆、表达、部分纯化和动力学表征D-氨基酸氧化酶以鉴定具有最合适特性的(例如酶稳定性、针对D-PPT氧化的高kcat/Km值、对任何内源性植物底物的最低氧化、最优pH等)基因和DAMOXs。

当非毒害植物的物质是D-膦丝菌素(PPT)时其可从D和L PPT混合物中获得。例如，当大肠杆菌经转化以高水平(例如，在加入IPTG后诱导地)表达PAT基因(编码将乙酰基团从乙酰CoA转移至L-PPT的酶)时可向大肠杆菌细胞(任选地使N-乙酰PPT脱乙酰基酶活性的背景水平降到最低的argE突变体)的培养基(优选地基本培养基)中加入DL PPT。优选地，所述大肠杆菌也通过基因工程改造以表达乙酰CoA合成酶。在经历允许膦丝菌素的L组分基本上全部被N-乙酰化(例如通过使用31-P NMR监控判断)的合适时间后，通过使用例如在高和低pH下溶剂提取，阴离子和阳离子交换层析，用手性阳离子例如chinchocine进行选择性结晶或其它本领域已知的方法(例如用两种非混溶的水相作为相系统(USP5,153,355中的方法)进行液体/液体抽提)的连续步骤从无细胞培养基中回收和纯化D-PPT。通常后面的步骤是对以铵盐回收的D-PPT进行阳离子交换层析。

可选择地，通过酶促方法可获得D-PPT，其中通过(I)L-氨基转移酶(例如来自大肠杆菌)和(II)谷氨酸脱羧酶的结合作用将DLPPT+2-酮戊二酸主要转化成D-PPT、2-氧代PPT(和其脱羧产物)和GABA的混合物。使用本领域已知的和上面所述的方法从所述反应混合物中将想要的纯D-PPT解析出来。

D-PPT也可通过使用酶促方法获得，其中通过(I)L-氨基转移酶和(II)谷氨酸脱氢酶的结合作用将DL PPT+2-酮戊二酸+NAD主要转化成D-PPT、2-氧代PPT(和其脱羧产物)NADH和氨的混合物。从反应混合物纯化所需的D-PPT。

在制备D-PPT的进一步方法中，用L氨基酸氧化酶处理DL PPT以使剩余的氨基酸仅仅是想要的D型。然后从所述反应混合物中纯化该D-PPT。

进一步的方法包括(I)将DL PPT转化成N-乙酰DL PPT(使用乙酸酐或其它乙酰化试剂和本领域已知的方法)和(II)用D酰化氨基酸水解酶处理N-乙酰DL PPT以使只有N-乙酰-D-PPT脱乙酰化。从所述反应混合物中纯化所得的D-PPT。例如，通过结合Dowex阴离子交换树脂和用40mM甲酸洗脱将D-PPT从N-乙酰-L-PPT中解析出来。在合适的上样条件下，该酸洗脱D-PPT同时保留与柱子结合的N-乙酰L-PPT。

进一步的方法包括用L酰化氨基酸水解酶和非水性溶剂中的酰化试剂处理DL PPT，这样只有想要的D-PPT以非乙酰化形式保留下来。

进一步制备纯D-PPT的方法包括通过使用手性碱例如chinchocine和加入手性碱和纯D-PPT的种子晶体从DL PPT中对映选择性结晶。

通过使用手性碱性柱直接进行手性层析从DL-PPT制备纯D-PPT的方法。

在一个下列的实施例中给出了详细的生产纯D-PPT的方法。

任选地可进一步突变和选择编码用于本发明的酶的DNA序列以产生进一步有用的具有提高的效力的酶。于是许多酶的特性得到了提高，所述特性包括对想要的底物的催化活性(kcat/Km)、温度稳定性和pH的最适合值。用于产生、筛选和选择这些改进了的变体的方法是熟知的。例如，通过诱变(例如通过将DNA通过DNA复制易于出错的细菌或醇母株系例如大肠杆菌XL1 red传递、通过UV、化学或被靶向的寡核苷酸PCR诱变)的方法产生合适的变体DNA序列。特别地通过许多可选择的DNA重排或‘有性PCR’方法(如，WO 00/61740中从28至41页中所概述的，此处引用作为参考)中的任一种产生这类基因。许多方法适合用于筛选这些改进了的基因。在合适的宿主细胞例如大肠杆菌或酵母中可合适地表达基因并且可通过使用合适的测定法例如此处所描述的测定法选择改进了的基因。

编码用于本发明的酶的嵌合基因可各自包含编码其中一个所述酶的DNA序列，所述DNA序列有效地连接优选地指导其在雄性或雌性生殖结构中表达的5’启动子区域，所述酶能够单独地或与其它酶一起将非毒害植物的物质转化成毒害植物的物质。这种表达的特异性确保了所表达的酶的效果只在有活力的种子或有活力的花粉形成所必需的组织和细胞位点内发挥作用，并且在合适的非毒害植物的物质(可能是前除草剂)存在时除了其对能育性的影响外对所述植物无害。除了启动子区域外，本发明的嵌合基因还包含3’转录终止子序列。其负责转录的终止和使mRNA正确聚腺苷酸化。许多这样的3’终止子序列在本领域是已知的并且适合用于本发明的嵌合基因。在特定的实施方案中所述3’转录终止子序列选自CMV35S终止子、tm1终止子、胭脂碱合酶(nos)终止子和豌豆rbcS E0终止子。

适合用于所述嵌合基因的某些实施方案的5’启动子区域包含基因的5’区域，其优选地在雌花组织中表达。在某些实施方案中5’启动子区域选自烟草的stig 1启动子(Goldman等人，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)、经修饰的S13启动子(Dzelkalns等人(1993)PlantCell，5，8555)、AGL5启动子(Savidge等人(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米心皮特异性ZAG2基因(Thiessen等人(1995)Gene，156，155-166)5’的启动子区域。任选地，从基因组DNA的编码序列的上游区域获得进一步合适的启动子区域，所述基因组DNA的编码序列对应于本领域已知的优先地在雌性生殖结构中表达的cDNA序列。在某些实施方案中这类探针cDNAs选自拟南芥Fbp7和Fbp11基因(Angenent等人.，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和兰花特异性cDNAs 040、0108、039、0126和0141(Nadeau等人，(1996)Plant Cell，8，213-239)。在特定的实施方案中包含基因组DNA的5’启动子区域选自包含于由基因组DNA克隆pSH64(具有登录号NRRLB-21920)、与cDNA P26-A4(具有登录号NRRL B-21655)杂交的pCIB10302基因组克隆和与cDNA克隆P19-QA(具有登录号NRRLB-21919)杂交的基因组DNA克隆X2-1构成的群体的DNA区域，所述5’启动子区域包含优先地在雌性生殖结构中表达的基因组DNA。在特定的实施方案中，这些启动子区域包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸1至1390、SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1至1093。在进一步的实施方案中，通过本领域技术人员熟悉的方法分离和克隆适合用于本发明的嵌合基因的5’启动子区域。例如，通过从组织例如玉米穗丝或小麦雌蕊中分离RNA，接着使用技术例如差示显示、PCR选择性cDNA扣除和扣除cDNA文库构建进行差示筛选来鉴定在雌性生殖结构中表达的新转录物。分离优先地在雌性组织而不在其它植物部分表达的cDNA克隆。任选地通过Northern印迹杂交进一步确定表达的组织特异性。将所述cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆中获得与组织特异性表达相关的5’启动子区域和任选地3’非翻译DNA区域，并用于构建用于优先地在雌性生殖结构中表达的嵌合基因。

适合用于所述嵌合基因的某些实施方案的5’启动子区域包括基因的5’区域，所述基因优选地在雄花组织中表达。这些包括在花粉、绒毡层或花药的其它结构中表达的启动子区域。在某些实施方案中，这些5’启动子区域选自LAT52启动子(Twell等人.，(1989)Dev.，109，705-713)、番茄A127启动子(Dotson等人，(1996)Plant J.，10，383-392)、玉米Zmg启动子(Hamilton等人，(1989)Sex.PlantReprod.2，208-212)、玉米CDPK启动子(Guerro等人.，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP 5477002中公开的花药特异性ant32和ant43D启动子，此处引用其全文作为参考。在某些实施方案中，所述5’启动子区域选自来自玉米的绒毡层特异性启动子CA55(WO92/13956中描述的“Pca55”)、来自水稻的绒毡层特异性启动子E1(USP5639948中所描述的)、来自水稻的绒毡层特异性启动子T72(USP5639948中所描述的)、来自水稻的RA8花药特异性启动子(EMBL/Genbank检索号AF042275；Jeon等人，(1999)PMB，39，35-44；WO 00/26389)、花药特异性Tap1启动子(Spena等人(1992)TheorAppl Genet 84，520-527)和来自玉米的ZmC5-花粉特异性启动子(EMBL/Genbank检索号Y13285；Wakeley等人，(1998)PMB，37，187-192)。任选地，从基因组DNA的编码序列的上游区域获得合适的启动子区域，所述基因组DNA的编码序列对应于本领域已知的优先地在雄性生殖结构中表达的cDNA。在某些实施方案中这种探针cDNAs选自由兰花花粉管特异性细胞色素P450基因(Nadeau等人.，(1996)Plant Cell，8，213-239)、拟南芥Bcp1基因(Xu等人(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米的雄花特异性MFS14基因(Wright等人.，(1993)Plant J，3，41-49)构成的组。在进一步的实施方案中，通过本领域技术人员熟知的方法分离和克隆适合用于本发明的嵌合基因的5’启动子区域。例如，通过从组织例如穗、花粉管、花药或绒毡层中分离RNA，接着通过使用技术例如差示显示、PCR选择性cDNA扣除和扣除cDNA文库构建进行差示筛选来鉴定在雄性生殖结构中表达的新转录物。分离优先地在雄性组织而不在其它植物部分例如叶、根和柱头表达的cDNA克隆。任选地通过Northern印迹杂交进一步确定表达的组织特异性。将所述cDNA克隆用作基因组文库筛选的探针。从基因组DNA克隆中获得与组织优先表达相关的5’启动子区域和任选地3’非翻译DNA区域，并将其用于构建用于优先地在雄性生殖结构中表达的嵌合基因。

进一步用于本发明的嵌合基因的启动子区域包括水稻的Osmads13基因、水稻花药的OSG基因和水稻的YY2基因的上游区域。通常，在雄性或雌性生殖结构中产生高水平的、早期的、持续的和优先的表达的启动子区域被选作最合适的启动子。启动子区域也可进一步包含相互之间组合和与增强子区域组合的嵌合体。

嵌合基因可任选地包含紧接在编码参与将非毒害植物的物质转化为毒植物素的酶的DNA序列前面的区域，所述区域编码能够将所述酶靶向亚细胞器例如叶绿体、过氧化物酶体(除了当所述毒植物素是过氧化物或过氧化物阴离子时)或线粒体的肽序列，并且所述靶向蛋白可以具有(i)叶绿体转运肽或(ii)叶绿体蛋白-叶绿体转运肽的叶绿体转运肽的N端部分的序列。特别地，为了靶向线粒体，所述紧接在酶编码DNA序列之前的DNA区域编码线粒体转运肽序列。在某些实施方案中，转运肽序列可选自Nicotinia plumbaginifolia线粒体ATP合酶的β亚单位、线粒体特异性NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶、呼吸链复合物I的NADPH结合亚单位和酵母线粒体色氨酰-tRNA-合成酶的内源转运肽序列。

用于本发明方法的多核苷酸可包含一个或多个编码酶的嵌合基因，所述酶催化参与从非毒害植物的物质产生毒植物素的反应。任选地这些多核苷酸还包含进一步的基因和嵌合基因，例如嵌合标记基因。此处使用的嵌合标记基因包含在植物细胞中具有活性的启动子控制之下表达的标记DNA。所述标记DNA编码RNA、蛋白质或多肽，当所述物质在植物，植物组织或植物细胞中表达时，可使这种植物材料与不表达所述标记DNA的植物材料区分开来。标记基因的例子有为细胞提供特异性颜色的基因例如A1基因(Meyer等人(1987)Nature 330，667)或使植物细胞抵抗使用抗生素(例如，编码对艮他霉素抗性的aac(6’)基因，WO 94/01560或提供对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因)或除草剂例如草甘膦(例如USP 5510471或WO 00/66748中的EPSPS基因)、甜菜宁(例如USP5347047；USP 5543306中的pmph基因)、溴苯腈(bromoxynyl)(例如USP 4810648中描述的基因)、磺酰脲(例如EP 0360750中描述的基因)、茅草枯(WO 99/48023中描述的基因)、氨腈(WO98/48023；WO 98/56238中描述的基因)进行致死选择的基因和编码对谷氨酰胺合成酶抑制剂例如L-膦丝菌素抗性的基因(例如，EP 0242246、EP 0242246和EP 0257542中描述的N-乙酰转移酶基因)。在本发明的多核苷酸(包含作为标记基因的除草剂抗性基因)的优选的实施方案中，所述除草剂是用于作物中控制杂草的除草剂，此外，充分表达除草剂抗性基因以提供对田间比率的所述除草剂充沛的耐受性。在进一步优选的实施方案中，所述除草剂是草甘膦并且所述除草剂抗性基因是EPSP合酶。而所述标记基因可以是提供正选择的基因，其中所述标记基因编码在特定的介质中给转化的植物细胞提供正代射作用有利方面的酶。USP 5767378描述了许多合适的正选择系统和基因。

当本发明的多核苷酸包含除草剂抗性基因时，对以充分密度间作的作物植株外源地施用所述除草剂，所述充分密度间作用以消除来源于非转基因的自体受精亲本植株的非杂交种子的产生。在优选的实施方案中所述除草剂是草甘膦或其农学上有用的盐，而所述除草剂抗性标记基因选自WO 00/66748中描述的草苷膦抗性提供基因。

当标记基因存在时，也可提供用于除去所述标记基因的方法。例如在决定组合性状时，这是想要的。此外，除去除草剂抗性标记基因也是想要的，当所述基因可干扰本发明的前除草剂抗性依赖性条件性生育力机制的作用时。例如，从也包含嵌合基因的多核苷酸中除去膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)除草剂抗性标记基因可以是想要的，所述嵌合基因用于依赖于外源施用D-膦丝菌素前除草剂的条件性雄性或雌性不育。PAT基因的存在可通过失活L-膦丝菌素毒植物素潜在地干扰成功的条件性不育。因此，包含标记基因的多核苷酸可任选地包含特异性重组酶的特异性识别位点，所述位点位于所述标记基因侧翼并允许所述序列被“剔除”的位置上。将携带这种经侧翼连接的标记基因的植物与携带编码相应的特异性重组酶的基因的植物杂交导致所述标记从其中被特异性切除的后代植物。合适的这类位点特异性同源重组系统的例子是flp/frt系统(Lyznik等人，(1996)，NucleicAcids Res.24，3784-3789)和Cre/Lox系统(Bayley，C.C.等人，(1992)PMB，18，353-361)。

用于本发明方法的多核苷酸可任选地包含一个或多个位于编码蛋白的序列的5’非翻译区域内的翻译增强子。本领域技术人员知道这类合适的翻译增强子，例如来源于TMV的Omega和Omega引物序列以及来自烟草蚀纹病毒的翻译增强子，也知道怎样可将这些翻译增强子导入所述多核苷酸以提供想要的增加的蛋白表达结果。进一步的例子包括来源于玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒(Gallie等人，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等人，(1990)PMB.，15，65-79)的翻译增强子。为进一步最优化来自嵌合基因和嵌合标记基因的蛋白的表达，所述多核苷酸也可进一步包含元件例如增强子、支架或基质附着区域(SARS或MARS)和内含子。已显示当基因的5’非翻译区域包含各种内含子序列和任选地当各种内含子序列用于本发明的嵌合基因中时，各种内含子例如玉米adh1内含子1增强表达。

根据本发明已转化以表现想要的雄性/雌性不育特征的植物也可用多核苷酸转化，所述多核苷酸酸包含编码能够为包含其的植物材料提供至少一种下列农艺学性状的区域，所述性状是：对昆虫、真菌、细菌、线虫、逆境、dessication和除草剂的抗性。

除草剂抗性提供基因可以例如选自编码下列蛋白的群体：草苷膦氧化酶(GOX)、EPSP合酶、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸二氧化酶(HPPD)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰-CoA羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氢蝶酸合酶、多胺转运蛋白、超氧化物岐化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、获自真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的tfdA基因的产物和已知的所述蛋白的诱变产生的或其它修饰的变体。仔细地考虑其用于转化非毒植物素物质的酶的性质后，本领域技术人员认识到需要包括这些基因和驱动其表达的启动子。在所述多核苷酸提供多种除草剂抗性的情况下，这些除草剂可选自二硝基苯胺除草剂，三唑并嘧啶、尿嘧啶、苯基脲、三酮、异唑、N-乙酰苯胺、二唑、triazinone、N-磺酰苯胺、酰胺、N-酰苯胺、isoxaflutole、flurochloridone、哒草伏和三唑啉酮(triazolinone)类型除草剂，并且萌后(post-emergence)除草剂选自草甘膦和其盐、草铵膦、磺草灵、灭草松、双丙氨膦、除草定、稀禾定或其它的环己二酮、麦草畏、蔓草磷、胺草唑、苯氧基丙酸、喹禾灵或其它芳氧基苯氧基丙酸、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津或其它三嗪、嗪草酮、氯嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、halosulfuron、sulfometron、灭草喹、咪草烟、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、sulcotrione、百草枯、敌草快、溴苯腈和唑禾草灵。

在所述多核苷酸包含编码杀虫剂蛋白的序列的情况下，这些蛋白可选自来源于Bt的晶体毒素(包括分泌的Bt毒素例如称作“VIP”的毒素)、蛋白酶抑制剂、凝集素和Xenhorabdus/光状杆菌属毒素。提供真菌抗性的基因可选自编码已知的AFPs、防卫素、壳多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特别优选的杀昆虫蛋白是cryIAc、cryIAb、cry3A、Vip 1A、Vip 1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪花莲凝集素。在所述多核苷酸包含提供细菌抗性的基因的情况下，这些基因可选自编码杀菌肽和techyplesin和其类似物的基因。病毒抗性提供基因可选自编码病毒衣壳蛋白、运动蛋白、病毒复制酶的基因和反义和核酶序列，已知所述核酶序列提供对病毒的抗性；而提供逆境、盐和干旱抗性的基因可选自编码谷胱甘肽S转移酶和过氧化物酶的基因、构成已知的CBF1调节序列的序列和已知提供海藻糖积累的基因。

可“修饰”用于本发明的多核苷酸以增强由其包含的蛋白编码序列的表达，例如可除去mRNA不稳定性基序和/或偶然的拼接区或可使用作物优选的密码子以使所得的多核苷酸在植物中表达产生基本相似的蛋白，所述蛋白具有与生物体中未经修饰的多核苷酸的蛋白编码区域表达获得的蛋白基本相似的活性/功能，在所述生物体中这些未经修饰的多核苷酸区域是内源多核苷酸。经修饰的多核苷酸和内源地包含于所述植物并编码基本相同蛋白的多核苷酸之间的同一性程度可以使得防止经修饰的和内源序列之间的共抑制。在这种情况下，序列之间的同一性程度应当优选地低于大约70％。此外可以修饰翻译起始位点周围的序列以使其是“Kozack优选的”。其代表的意义对本领域技术人员来说是熟知的。

本发明进一步包括形态学正常的条件性可育的完整植物，所述完整植物由使用本发明的核酸转化的从而提供这种性状的材料再生的植物杂交产生。本发明也包括所得植物的后代、其种子和部分。

本发明的植物可选自田间作物、水果和蔬菜例如油菜、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、高梁、mangel worzels、蕃茄、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、卷心菜、洋葱、大豆属物种、甘蔗、豌豆、field beans、白杨、葡萄、柑橘、紫花苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和草料草、亚麻和油料种子油菜、和产生坚果的植物(只要其没有在前面被特别地提到)、其后代、种子和部分。

特别优选的这类植物包括小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、粟和高梁。

产生杂交小麦种子的优选的方法包括步骤：

(i)用包含提供雄性不育的基因的多核苷酸或载体转化植物材料，所述雄性不育条件性依赖于外源施用前除草剂或其它非毒害植物的物质；

(ii)选择所得的转化材料；和

(iii)将所选择的材料再生成形态学正常的条件性雄性不育的完整植物。

(iv)培育纯合的条件性雄性不育雌性亲本系

(v)用包含提供雌性不育的基因的多核苷酸或载体转化植物材料，所述雌性不育条件性依赖于外源施用与(i)中相同的前除草剂或非毒害植物的物质；

(vi)选择所得的转化植物；和

(vii)将所选择的材料再生成形态学正常的条件性雌性不育的完整植物

(viii)培育纯合的条件性雌性不育雄性亲本系

(ix)以确保有效授粉的比例间作所述条件性不育的雄性和雌性亲本系

(x)以使自体受精减少到最少的剂量和发育阶段对所述间作的亲本系施用所述前除草剂或其它非毒害植物的物质

(xi)从间作亲本植物中收获杂交小麦种子。

本发明也提供了上述方法的变体，其中通过任何方法使雄性亲本雌性不育，通过任何方法使雌性亲本雄性不育，雄性和雌性亲本系是依赖于施用不同前除草剂(同时施用两者)的条件性不育，并且所述作物不是小麦。

本发明也包括包含用于检测蛋白或编码其的DNA序列的手段的诊断试剂盒，所述蛋白或DNA序列存在于根据本发明方法产生的植物中，因此适合用于鉴定包含其的组织或样品。通过本领域技术人员已知的PCR扩增可检测所述DNA序列，所述PCR扩增基于引物，所述引物是可容易地从本申请公开或提到的编码酶的序列推导得出的引物。所述酶自身可通过例如使用针对其而产生的抗体进行检测，所述抗体用于诊断性区分其包含的抗原性区域。

可通过方法产生对映异构体纯的D-膦丝菌素(D-PPT)，所述方法包括步骤：

(a)提供包含能够选择性N-酰化PPT的酶的细胞；

(b)将所述细胞培养在包含D-L PTT以产生条件培养基的培养基中；

(c)将细胞从(b)中的条件培养基中分离出来；

(d)任选地在各种pHs下用非水、非混溶的溶剂提取所述条件培养基，以使包含PPT的级分从包含比PPT更溶于水的分子的级分分离开；

(e)任选地将条件培养基或步骤(d)中的包含PPT的经提取的培养基与以质子化形式存在的阳离子交换树脂(以从培养基中充分吸收除了PPT以外的绝大部分阳离子的量和pH下)混合；

(f)将条件培养基、提取的培养基或来自步骤(e)中的培养基与以质子化形式存在的阳离子交换树脂(以充分结合培养基中大量的PPT的量和pH下)混合；

(g)收集步骤(f)中结合有PPT的阳离子交换树脂并用洗脱介质从其中选择性地洗脱PPT，所述洗脱介质具有足够的pH和离子强度，前提是所述洗脱介质的pH不能低至使所得的洗脱的PPT外消旋化。

关于植物材料的转化，本领域技术人员承认尽管靶材料的类型(例如，胚发生细胞悬浮培养物或去分化未成熟胚)和转化的特定方法(例如，使用农杆菌或微粒轰击)在下列的实施例中明确公开，但本发明并不限于这些特定的实施方案并且这些靶材料和方法可交换使用。此外，整个本发明说明书中所用的术语“植物细胞”是指分离的细胞，包括悬浮培养物，和完整或部分完整的组织中的细胞，所述组织是例如胚、小盾片、小孢子、来源于小孢子的胚或来自植物器官的体细胞。类似地，尽管特定的实施方案限定于玉米和小麦，本发明同样应用于广泛的可使用合适的植物细胞转化方法进行转化的农作物中。

本发明提供了D-氨基酸氧化酶的突变体形式和编码其的基因，其中在对应于野生型纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的位点58苯丙氨酸的位点上存在赖氨酸。在优选的实施方案中本发明提供了在位点58上具有赖氨酸(F58K)和在位点213上具有丝氨酸(M213S)的纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的双突变体形式。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了在位点58上具有赖氨酸(F58K)和在位点213上具有苏氨酸(M213T)的纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的双突变体形式。这些酶能够有效地氧化D-膦丝菌素和其它类似的带负电荷的D-氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。

在本发明的进一步实施方案中，这些酶和编码其的基因用于除了产生杂交作物外的进一步应用中，例如，

1)所述酶可应用于用于D-氨基酸例如D-膦丝菌素的检测设备中(例如作为检测杀虫剂残留物的手段)。例如氧气的还原和过氧化物离子的产生可与许多化学或电化学的检测方法结合并用于传感器设备。

2)所述酶可应用于用于酸性氨基酸的DL混合物的对映异构体解析的生物催化方法。例如，尽管只有L型膦丝菌素是有活性的除草剂，但除草剂膦丝菌素通常以DL外消旋物形式进行生产。将所有的D型转化成L型以获得更纯的和每化学重量两倍活性的除草剂制剂是想要的。本发明的基因和酶提供了获得其的方法。例如，将外消旋DL膦丝菌素加入经转化的表达F58K、M213S或F58K、M213T纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的宿主细胞(例如大肠杆菌或酵母等)的生长培养基中。任选地，也将所述宿主细胞进行基因工程改造以表达高水平的L-谷氨酸氨基酸转移酶。所述生长培养基优选地包含谷氨酰胺来源，从而使所述细胞仍能生长，尽管谷氨酰胺合成酶被膦丝菌素的L组分抑制。在合适的时间后，发现培养基中的外消旋的膦丝菌素基本上都转化成L型。然后收集所述培养基以提供基本纯的L-膦丝菌素。除了细胞培养方法外，类似的对本领域技术人员来说是显而易见的方法可任选地使用分离的酶并且任选地可利用层析从残留的L-膦丝菌素中分离2-酮酸产物。这些方法可同样地应用于许多酸性氨基酸的对映异构体解析中。

从下面的与相关序列表和附图结合的非限定性实施例中可进一步阐明本发明。

SEQ ID NO：1和2描述了用于获得TA29启动子区域的PCR引物。

SEQ ID NO：3描述了分离自纤细红酵母的DNA序列，所述DNA序列编码具有D-氨基酸氧化酶活性的酶。

SEQ ID NO：4和5描述了用于提供变异的D-氨基酸氧化酶的简并寡核苷酸。

SEQ ID NO：6和7描述了基序，为了提供变异的D-氨基酸氧化酶可替代所述基序中的可选择的氨基酸。

图1是用于烟草转化的构建体的示意图，其中所述构建体具有在stig1启动子区域有效控制下的红酵母D-氨基酸氧化酶。标明的组分是LB(左边界序列)、AOPR1(AoPR1启动子)、PSTIG1(EMBL目录号X77823)、RGDAO(OPT)(SEQ ID NO：7)、PC PROMOTER(EMBL目录号X16082)、PAT(EMBL目录号A02774)、NOS(获自EMBL目录号ATU237588的终止子)和RB(右边界序列)。

图2是用于烟草转化的构建体的示意图，其中红酵母D-氨基酸氧化酶编码序列在3’端截去3个密码子并在5’端(RGDAO(OPT)-SKL)融合至编码最优化的转运肽(FR2673643)的区域。

根据已建立好的方法进行一般的分子生物学方法。

对于绝大部分下列实施例，各包含本发明的多个范例。此处所用术语‘基因的启动子区域’表示DNA序列，所述DNA序列包含启动子、所述启动子的上游序列和任选地也包含全部或部分编码mRNA 5’非翻译前导区域的DNA序列。

实施例1.依赖于外源施用D-膦丝菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的条件性雌性不育的烟草植物

通过RT-PCR从类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)(纤细红酵母)的mRNA中获得编码在EMBL序列A56901内的D-氨基酸氧化酶蛋白序列P80324(Swissprot)的DNA序列或通过合成(使其更容易控制内部限制性内切酶位点和建立有助于克隆的侧翼连接位点)获得相似的DNA序列例如SEQ ID NO：3，所述SEQ ID NO：3设计时考虑了植物(在该情况下是小麦)密码子的利用和使潜在地不利于表达的DNA特性减小到最低程度。通过PCR诱变改变DNA序列以使其编码在位点58上具有赖氨酸(F58K)而不是苯丙氨酸和任选地在位点213上具有丝氨酸或苏氨酸而不是甲硫氨酸(M213S或M213T)的D-氨基酸氧化酶的突变体形式。设计PCR引物和合成的DNA序列侧翼以放置有用的单一限制性位点以便进行亚克隆。优选地和在当氧化酶编码序列不含有易混的内部位点的情况下，将Ncol或Ndel置于5’末端以促进符合读码框的融合体的克隆，所述融合体是与在ORF的5’加入的序列例如叶绿体转运肽编码序列的融合体。在一些例子的变体中以这样的方式克隆D-氨基酸氧化酶：截去末端3个氨基酸从而使编码的酶不再被靶向过氧化物酶体。在所述方法的另外的系列变体中，通过PCR对基因进行基因工程以编码在位点213、223和238上具有替换氨基酸的纤细红酵母D-氨基酸氧化酶，特别是在位点213，野生型的甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在223位点野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或在238位点野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。将天然的蛋白序列基序RCTMDSS中‘213’位点上的甲硫氨酸标记为M。将天然蛋白序列基序GGTYGVG内位点238上的酪氨酸标记为‘Y’。

任选地，将限制性位点置于ATG翻译起始位点间插序列的上游以符合植物翻译一致序列(例如根据Kozack)。

‘ΔS13启动子’是用于在雌花部分获得优先表达的启动子区域。其包含与CMV35S核心启动子(Dzelkalns等人(1993)Plant Cell，5，833-863)-46至+8融合的来自SLG13启动子区域的-339至-79区域。将该S13启动子区域克隆入bluescript sk中，然后将所述质粒进一步限制性酶切割并用包含nos3’转录终止子区域和一个或其它的氨基酸氧化酶编码序列连接以在bluescript sk质粒中产生‘ΔS13-D-氨基酸氧化酶-Nos终止子’表达盒。然后将其合适地以例如EcoR 1片段限制性切出并原样将其连接入载体例如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或pCIB200或pCIB2001(WO98/39462)的合适位点上以用于使用农杆菌的转化。如WO 98/39462中所描述的，pCIB200包含下列单一的多接头限制性位点：EcoR1、Sst1、Kpn1，BglII、Xba1和SalI。PCIB2001在多接头中包含插入片段，所述插入片段加入进一步的单一限制性位点，包括MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaT和StuI。PCIB200和pCIB2001也提供了用于在卡那霉素上筛选植物和细菌的选择标记基因、左和右T-DNA边界、来源于RK2的在大肠杆菌和其它宿主细胞之间转移的trfA功能以及来自RK2的oriT和oriV。可选择地使用了包含来自具有广泛宿主范围的质粒pRK252(Rothstein等人(1987)Gene53，153-161)的序列的二元载体pCIB10或使用了一个其衍生物，所述衍生物包含卡那霉素抗性基因和潮霉素磷酸转移酶基因，例如pCIB715(Gritz等人(1983)Gene25，179-188)。

可选择地使用了大约1.6kb的Stig 1启动子区域(来源于EMBL登录号X77823)。例如通过使用合适的限制性酶，用编码P80324或Q99042编码序列的DNA序列取代Goldman等人(1994)在EMBOJ.13，2976-2984中描述的stig1-GUS构建体中的GUS基因编码区，并将所得的stig1-D-氨基酸氧化酶表达构建体在邻近合适的标记基因的3’终止子序列的上游位点和在T-DNA的边界序列之间克隆入合适的载体例如pCIB200中。

在进一步特定实施例中，根据图1构建二元载体内的T-DNA插入物。将包含合成DNA序列(SEQ ID NO：3)(在stig1启动子区域的有效控制之下)和编码L-膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)的DNA序列(在豌豆质体蓝素启动子区域的有效控制下)的构建体克隆入二元载体的LB/nptII基因和T-DNA的RB之间的位点，所述合成DNA序列编码纤细红酵母D-氨基酸氧化酶，且已通过PCR诱变使其编码D-氨基酸氧化酶的突变体形式，所述突变体在位点58上具有赖氨酸而不是苯丙氨酸(F58K)和，在位点213上具有丝氨酸或苏氨酸而不是甲硫氨酸(M213S或M213T)。简而言之，将编码双(F58K，M213S or F58K，M213T)突变体的经改变的SEQ ID NO：3在Stig 1启动子之后和在nos终止子区域(包含于EMBL：ATU237588)之前以NcoI/PstI片段克隆入质粒pFse4-Stiglnos(描述于WO 99/42598)中。通过PCR从豌豆基因组DNA中获得豌豆质体蓝素启动子区域(来源于EMBL登录号X16082)并将其克隆在PAT基因/nos终止子之前。将所得的PC-PAT-nos盒以Not I片段克隆在Stig1-RGDAMOX-nos之后并且将这完整的二个基因构建体以FseI片段转移至二元载体(pVB6，Bin19衍生物)中。

在进一步的方法变体中，按照图2中的示意图构建所用的构建体。红酵母D-氨基酸氧化酶编码序列SEQ ID NO：3经定向突变以编码所述酶的F58K，M213S或F58K，M213T双突变体形式，然后在突变体3’端截去3个密码子并将其克隆，使其5’端正好位于编码叶绿体转运肽的区域的下游，从而编码叶绿体转运肽/D-氨基酸氧化酶融合蛋白。所述叶绿体转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶小亚基(Klee，等人1987，Mol.Gen.Genet.，210，437)的拟南芥基因。任选地对其进行修饰以在CTP加工位点包含Sph1位点从而在该位点用Cys-Met取代Glu-Lys(WO 92/044490的图9中的SEQ)。相应地，可在D-氨基酸氧化酶编码序列的N末端通过基因工程引入SPh 1位点(将紧随甲硫氨酸后的氨基酸转化成亮氨酸)。可选择地，所述叶绿体转运肽编码序列来源于编码EPSP合酶(WO 92/044490中的图11)的Petunia基因。可选择地叶绿体基因编码序列是大量可能序列中的任何一个，所述可能序列包括来源于编码Rubisco小亚基的基因的那些和包括所谓的‘最优化的’嵌合转运肽序列(FR2673643)的那些。在所有情况下，不依赖于亚克隆，可简单地通过合成获得整个想要的编码叶绿体转运肽/双突变红酵母D-氨基酸氧化酶融合多肽的DNA序列。将该序列克隆入合适的载体内的stig 1启动子区域下游和终止子(例如nos)序列的上游位点(例如在Goldman等人(1994)在EMBO J.，13，2976-2984中描述的包含stig 1→GUS构建体的载体中取代GUS编码序列)。然后将整个基因表达构建体克隆入PVB6载体的T-DNA的右和左边界之间的合适位点上。

使用类似于Horsch等人(1985)Science，227，1229-1231中描述的方法用重组二元载体转化烟草叶片。可使用许多该方法的变体。使用冷冻解冻的转化方法可将二元载体转化入例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。按照Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)描述的实验方法使用Nicotiana tabacum var.Samsun进行烟草转化和完整的植物再生。在含有卡那霉素或其它合适的抗生素的MS培养基上选择转化事件。通过PCR确定整合的转基因的存在。再生植物并使其长到成熟并自交产生种子。使用Northern和/或Western分析来确定D-氨基酸氧化酶基因的组织特异性表达。所选择的植物是自花能稔的但具有条件性雌性不育的条件。将T1代的种子播种到地里。当植物长到足够大时通过PCR就转基因的存在对其进行检测。将PCR阳性植物转移至温室中。在没有外源施用前除草剂的情况下这些植物是完全能育的。以各种量和在各生长阶段用D-膦丝菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理这些(假定的)条件性不育植物亚组。对D-氨基酸氧化酶基因被确定为PCR阳性的T1植物进行这些处理，或等同地，直接对T0代(无性繁殖所述植物以使可留出各事件的未处理克隆用于种子生产)植物进行这些处理。然后以观察到的能育性作为选择合适的表现最明显的条件性不育表型的植物系的基础。例如这些氨基酸是纯D对映异构体或可选择地是DL外消旋物。例如，其可以在花形成的早期阶段之前或期间以通常0.25-20kg/ha通过叶片喷雾的方式施用。通过进一步的喷雾方式施用水可使氨基酸(所述氨基酸在叶片施用后可从叶上的溶液中结晶出来)重新溶解和重新流动以便叶片吸收。例如，也可以根部浸润的方式施用氨基酸和任选地以大约50μl 10-200mM的溶液直接灌入冒出花芽的花蕾中施用。收集来自经处理的植物的花粉并检验生存力。获取在用D-膦丝菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理后产生相对少的或无种子但在相同的处理条件下却产生接近正常水平的有生活力的花粉的植物。对照包括转基因和非转基因植物并且生长在同一条件下和同一物理处理方案(除了处理溶液是水或等浓度的纯L氨基酸)下。

在一个方法的变体中，所施用的氨基酸是外消旋DL膦丝菌素。在这种情况下，用于转化的DNA构建体除了包含在组织特异性雌花启动子区域例如‘stig 1’有效的表达控制下的编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列，还包括在启动子区域例如Pisum sativum质体蓝素基因(EMBL登录号X16082)的质体蓝素基因的翻译起始5’区域的有效的控制下的‘PAT’基因的DNA序列(EMBL：A02774)。例如，所述构建体与图1中描述的相同。

质体蓝素启动子区域提供了在植物绿色组织中优先的表达。意外地发现，与例如35S启动子区域不同，所述质体蓝素启动子基本上只在某些植物的组织中表达并且最显著地在绿色组织中表达，当与PAT基因一起使用时提供了对除草剂DL PPT(甚至在超过2kg/ha时)的基本上完全的生殖耐受性。此外，当缺少在花组织中共表达的异源D-氨基酸氧化酶的情况下，尽管PAT表达(当在该启动子区域的控制之下表达时)水平在许多至关重要的花组织中非常低或不存在，但质体蓝素/PAT基因组合提供了基本完全的生殖耐受性而无显著的产量损失。因此，在实施例的这个变体中，以其最低成本和最容易获得的形式如商业除草剂DL膦丝菌素外消旋物施用非毒害植物的物质D-膦丝菌素。在合适的喷雾时间和以250g/ha至5kg/ha DL膦丝菌素处理的植物没有受到显著的损害但在保持正常或接近正常的雄性能育的同时造成条件性雌性不育。

实施例2.依赖于外源施用D-膦丝菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的条件性雄性不育的烟草植物

突变体D-氨基酸氧化酶蛋白序列和编码其的DNA序列与前面实施例1中的一样。

通过使用引物进行PCR从烟草基因组DNA中克隆TA29启动子区域(Kriete等人(1996)Plant J.，9，808-818)，所述引物是：

5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID NO：1)和5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID NO：2)。通过一系列的限制性酶切割和亚克隆步骤将所获得的PCR片段置于D-氨基酸氧化酶编码序列的上游并将nos转录终止子加入到所述编码区域的3’。然后以合适的限制性片段克隆并获得所得TA29-D-氨基酸氧化酶-nos终止子表达盒，并将其克隆入实施例1中的二元载体中。

可选择地，以合适的限制性片段(例如BamH1，Bgl/II，其中设计合成的编码序列的变体以除去内部的限制性位点)克隆任何一个上述D-氨基酸氧化酶编码序列区域并通过以有义构型插入(例如)二元载体pROK1(Baulcombe等人(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位点将其与CaMV35S启动子和胭脂碱合酶终止子区域融合。然后切割携带35S启动子的EcoR1-BamH1片段并用来自携带TA29s启动子区域片段(-810至+54)的pAP30(Kriete等人(1996)The Plant Journal9，809-818)的EcoR1-BamH1片段取代。根据编码的蛋白质序列，所得载体可称为pGKTA29_Q99042、pGKTA29_P80324、pGKTA29_Q9HGY3和pGKTA29_P24552等。

通过农杆菌用载体转化烟草植物材料并以前面实施例中描述的类似方式再生转基因植物。所产生的植物是自花能稔的但也是条件性雄性不育的。将T1代的种子播种在土壤中。当幼苗长到充分大时通过PCR就转基因的存在对其进行检测。将PCR阳性的植物移入温室。这些植物在没有外源施用前除草剂的情况下是完全能育的。以不同的量和在不同的生长阶段用D-膦丝菌素或D-天冬氨酸或D-谷氨酸处理这些假定的条件性不育T1植物亚组或可选择地处理T0‘事件’的幼苗(直接从转化体中再生的)。在处理T0植物时对其进行无性繁殖以留出所述事件的未处理娣妹成员用于种子生产。然后以观察到的能育性作为选择合适的表现最显著的条件性不育表型的植物的基础。例如这些氨基酸是纯D型对映异构体或可选择地是DL外消旋物。例如，其可在花形成的早期阶段之前或期间以通常0.25和20kg/ha之间的比率通过叶片喷雾的方式进行施用。通过进一步的喷雾方式施用水可使氨基酸(在叶片施用后从叶上的溶液中结晶出来的氨基酸)重新溶解和重新流动以便叶片吸收。也以例如根部浸润的方式施用氨基酸，进一步地以10-200mM溶液直接施入冒出小花的花蕾中。

收集来自经处理的植物的花粉并检验其存活力。获取没有散发花粉或散发很少花粉和/或无存活力的花粉的植物。对从一些经处理的植物中收集的花粉进行检验并发现其是畸形和无存活力的。然而，这种雄性不育植物保持雌性能育，并且当用收集自其它未处理的非转基因或条件性雌性不育烟草植物的花粉授粉时产生(杂交)种子。对照包括转基因和非转基因植物并且生长在同一条件下和同一物理处理方案(除了处理溶液是水或等浓度的纯L氨基酸外)下。

在另一可选择的实施方案中，所使用的启动子区域是来自金鱼草的tap 1基因(Spena等人(1992)，Theor.Appl.Genet.，84，520-527)上游的2.2kb区域(EMBO号X57295)。

类似于实施例1，在该实施例的一个变体中，施用的氨基酸是外消旋DL膦丝菌素。在这种情况下用于转化的DNA构建体除了包含在组织特异性雄花启动子区域例如‘TAP1’或‘TA29’有效的表达控制之下的编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列，还包含在启动子区域例如来自质体蓝素基因(在这种情况下所述区域来自Pisum sativum质体蓝素基因)的启动子区域的有效的表达控制之下的编码膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因例如‘PAT’基因的DNA序列。在合适的喷雾时间和以250g/ha至5kg/ha DL膦丝菌素的比例处理的植物没有受到明显的伤害但在保持正常或接近正常的雌性能育性的同时导致条件性雄性不育。

实施例3.能够优先地在小麦的雄性生殖结构中表达和编码能够氧化D-膦丝菌素、D-谷氨酸或D-天冬氨酸的酶的嵌合基因。

突变体D-氨基酸氧化酶蛋白序列和编码其的DNA序列与实施例1中的相同。质粒pGK73携带从-810到+54的TA29s启动子区域EcoR1-BamH1片段(Kriete等人(1996)，9，809-818)。优选地以符合读码框的融合方式在编码例如双突变体(F58K、M213S或F58K、M213T)纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的DNA序列的上游位点上将该限制性片段或相似的合适的PCR-产生的片段克隆入bluescript sk。使用合适的一系列限制性酶切割、连接和亚克隆步骤将nos转录终止子加到编码区域的3’以根据编码序列在Bluescript sk质粒中产生可选择的类型TA29-羧酸酯酶-nos表达盒，如pBLTA_RGF58KM213T、pBLTA_RGF58KM213S等。

在进一步的例子中，使用了USP 5470359的花药特异性SGB6启动子区域SEQ ID NO：1。例如，将包含来自pSGB6g1(USP 5470359)的3kb基因组EcoR1-Nhe1亚克隆片段的pSGBNE1进一步亚克隆以将平端1558bp ApaII/Xba1片段克隆入bluescript sk，置于Sma1位点。如前面所述，通过进一步限制性酶切割和克隆步骤将该片段以符合读码框的形式融合到突变体D-氨基酸氧化酶DNA编码序列的上游。再在所述编码区域的3’加入nos终止子以建立可选择的包含可选择的SGB6-DAMOX-nos表达盒的Bluescript sk质粒，pBLB6_RGF58K等。

在相似的一组实施例中，类似地也将来自水稻的RA8花药特异性启动子区域(EMBL/genbank目录号AF042275；Jeon等人(1999)PMB，39，35-44；WO 00/26389)以符合读码框的融合方式融合到一个或其它编码F58K突变体D-氨基酸氧化酶的DNA序列的上游并在编码序列的3’融合nos终止子，从而产生系列包含可选择的RA8-DAMOX-nos表达盒的bluescript sk载体，pBLRA8_RGF58K、M213S等。

实施例4.能够优先地在小麦的雌性生殖结构中表达和编码能够氧化D-膦丝菌素和/或D-谷氨酸和/或D-天冬氨酸的酶的嵌合基因。

如实施例1中所描述的，获取编码D-氨基酸氧化酶蛋白序列的DNA序列。

按照布达佩斯条约于1998年2月27日在NRRL保藏了基因组克隆pSH64，保藏号为NRRL B-21920。据检测其为能与穗丝特异性cDNA克隆B200i4-2(WO98/39462)杂交的基因组克隆。如下构建优先地在雌性生殖结构中表达的嵌合基因。如WO 98/39462所描述的，构建类似于具有‘空’表达盒的pSH70的bluescript ks来源的质粒，所述质粒从5’至3’包含：由WO98/39462的SEQ ID No 11的核苷酸1-3790构成的B200i 5′启动子区域、BamH1位点和包含WO 98/39462中的SEQ ID No.11的核苷酸4427-6397的B200i 3′非翻译终止区域。使用部分BamH1降解，或可选择地通过进一步亚克隆，PCR和连接步骤，将可选择的D-氨基酸氧化酶编码序列连接入BamH1位点或其附近的位点以使其正好在B200i启动子的3’和B200i终止子区域的5’。由此，建立编码可选择的突变体D-氨基酸氧化酶-B200i表达盒的bluescript载体pBLB200_RGF58K、pBLB200_RGF58KM213T、pBLB200_RGF58KM213S等。

可选择地，如WO 98/39462中所描述的，将P19基因5’启动子区域的Pst I/Nco I片段从基因组克隆X2-1中切割出来，所述基因组克隆X2-1是按照布达佩斯条约于1998年2月27在NRRL保藏的，保藏号为B-21919。WO 98/39462中的SEQ ID No 14的核苷酸1088位的Nco I对应于P19基因的ATG转录起始位点。通过使用合适的亚克隆、限制性酶切割、连接和PCR步骤将该片段连接以和一个或其它编码D-氨基酸氧化酶的DNA序列形成符合读码框的融合体并在所述编码序列的3’加上nos终止子序列。由此，建立了编码可选择的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒的一系列bluescript载体pBLP19_RGF58KM213S、pBLP19_RGF58KM213T等。可选择地，使用相似的标准方法，获得具有代替P19启动子区域的P26基因的5’启动子区域(包含一些或所有WO 98/39462中的SEQ ID No.2的核苷酸1-3987)的类似质粒。如WO 98/39462中所描述的，亚克隆基因组P26-A4克隆pCIB10302，所述基因组克隆按照布达佩斯条约于1997年1月21日在the Agricultural Research Service patent culturecollection保藏，(NRRL)保藏号为NRRL B-21655。由此，建立了编码可选择的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒的一系列bluescript载体pBLP26_RGF58KM213T、pBLP26_RGF58KM213S等。

实施例5.用于提供(a)雌性近亲交配亲本系和(b)互补雄性近亲交配亲本系的方法的成对互补构建体，所述雌性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育，所述互补雄性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育。

适合提供雌性近亲交配亲本谷物或水稻植物系的第一DNA构建体包含三个基因A)、B)和C)，所述雌性近亲交配亲本谷物或水稻植物系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育。A)由在来自大麦质体蓝素基因(EMBL：Z28347)的大约1kb启动子区域有效控制之下的编码能够N乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列和合适的终止子区域例如来自nos或35S基因的终止区域组成，B)由编码类似于第一但此时在组织特异性雌花启动子区域(例如上面描述的P19或P26)有效控制之下的PAT编码序列和合适的终止子组成，C)由描述于实施例1、10和11中的在组织特异性雄花启动子区域(例如上面描述的SGB6或RA8)有效控制之下编码例如纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突变体形式的双、三突变体的合适的DAMOX编码序列和合适的终止子区域组成，所述突变体在位点213、223和238上具有改变，并且特别地在位点213上，野生型甲硫氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位点223上野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代和/或在位点238上野生型酪氨酸被His、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。在优选的实施方案中，被编码的纤细红酵母DAMOX酶是双重突变F58K、M213S或F58K、M213T突变体形式。使用本领域标准的方法和前面实施例提供的信息装配该构建体。

适合提供雄性近亲交配亲本谷物或水稻植物系的第二DNA构建体包含3个基因A)、D)和F)，所述雄性近亲交配亲本谷物或水稻植物系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育。A)由在来自大麦质体蓝素基因的启动子区域有效控制之下的编码能够N乙酰化L-膦丝菌素的PAT酶的DNA序列和合适的终止子区域例如来自nos或35S基因的终止子区域组成，D)由与第一相似的但此时在与构建体1中所用的相同的组织特异性雄花启动子区域(例如SGB6或RA8)有效控制之下的PAT序列和合适的终止子组成，F)由例如用于构建体1和在与用于构建体1中的相同的组织特异性雌花启动子区域(例如P19或P26)控制之下的合适的DAMOX基因和合适的终止子区域组成。使用本领域标准的方法和前面实施例提供的信息组装该构建体。

本实施例的成对DNA构建体包括例如下列元件

构建体1

A＝大麦质体蓝素启动子区域→PAT编码序列，Nos终止子；

B＝P26启动子区域→PAT编码序列，35S终止子；

C＝RA8启动子区域→红酵母D-氨基酸氧化酶(F58K，M213T突变体)编码序列，Nos终止子；

构建体2

A＝大麦质体蓝素启动子区域→PAT编码序列，Nos终止子；

D＝RA8启动子区域→PAT编码序列，35S终止子；

E＝P26启动子区域→红酵母D-氨基酸氧化酶(F58K，M213T突变体)编码序列，Nos终止子

实施例6.用于小麦转化的多核苷酸载体

实施例3、4和5描述了通常被克隆入bluescript sk中的表达盒中的各种嵌合基因构建体。任选地大量制备这些载体以用于直接的DNA转化，所述载体与共轰击的选择标记例如WO 98/39462中所描述的pSOG35(DHFR/氨甲蝶呤)或pUbi-Hyg(潮霉素磷酸转移酶/潮霉素)一起用于直接的DNA转化。优选地，在大量制备后，使用合适的限制性酶线性化所述载体以除去bluescript的氨苄青霉素抗性基因。

任选地，除了使用共轰击外，通过标准方法进一步对所述bluescript载体进行遗传工程改造以使其进一步包含植物选择性标记基因例如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、氨甲蝶呤抗性或草甘膦抗性基因，并直接进行使用。在一些上述的示例中，将PAT基因整合入设计的载体中，并且在这些情况下，任选地在转化后的一些阶段可用DL膦丝菌素进行选择。

可选择地，在合适的限制性片段内切割表达盒并将其克隆入pIGPD9来源的载体(描述于WO 00/66748的图12)中。使用这种载体进行转化避免了将抗生素标记基因转移到植物中，因为其在细胞中的保持依赖于营养缺陷型大肠杆菌突变体的互补作用。所述载体包含表达IGPD(HisB产物)的基因并经进一步的基因工程改造以包含植物选择性标记基因例如克隆入例如WOO0/66748的pZEN16i和pZEN18i的Xma I位点的EPSPS基因。可选择地使用了在甘露糖或木糖上提供阳性选择的标记基因(USP 5767378)。

在使用pIGPD9载体的特定的实施方案中，构建用于小麦转化的质粒。说明性示例是pZEN18_BLB200_Q99042和pZEN18_BLRA8_Q01470。这些是包含pZEN18 EPSPS基因(WO 00/66748)的pIGPD9来源的载体，并且在这种情况下，分别是B200i-)D-氨基酸氧化酶-B200i或RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒。

通过使用厂商提供的实验方案使用Maxi-prep procedure(Qiagen)获得用于植物转化的大规模DNA制剂。

实施例7.用多核苷酸转化/再生小麦，所述多核苷酸包含优先地在雄性或雌性生殖结构中表达的和编码能够氧化D-膦丝菌素和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸的嵌合基因

在一个实施例中，将基因型UC703的未成熟胚(长度为0.75-1.0mm)置于含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培养基上。大约4小时后，将胚置于含有15％麦芽糖、3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基上，该培养基上覆盖有滤纸支持的含有相同组分的琼脂板。在轰击前使胚进行质壁分离2-3小时。

使用标准方法将如实施例6和前面的实施例中所描述的制备的DNA沉淀在微米尺寸的金颗粒上。使用DuPont Biolistics氦气设备用1100psi的爆破压轰击4个靶板(每个靶含16个胚)各二次。在载体台和靶之间放置80目的阻挡屏，对板进行轰击。轰击后，在将载有胚的板放置到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基的板上之前，将靶在25℃下于暗处放置24小时。再经过48小时后，将单个胚从板上取出并直接放在相同组分的新鲜培养基上。在基因递送大约6周后，将所述组织放置在含有3mg/l 2，4-D、3％蔗糖和0.2mg/l氨甲喋呤的MS培养基上进行3周。然后将组织置于包含含有1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲喋呤的MS培养基的再生培养基中。2周后，将再生小苗置于装有含有2％蔗糖、1mg/l萘乙酸和4mg/l氨甲喋呤的半强度MS培养基的灭菌容器中。

在特定的实施例变体中，包含优先地在雄性生殖结构中表达的嵌合基因的载体与可选择的选择性标记基因一起用于共轰击。因此，例如，制备质粒DNA并与pUbiHyg(编码在玉米聚泛素启动子有效控制之下的潮霉素磷酸转移酶的质粒)一起被包被在金微粒上。在这种情况下，除了在轰击后再生培养基含有在2和20mg/l之间不断增加的潮霉素浓度外，如上所述进行转化和再生。

在进一步的实施例中，用pZEN18_BLB200_RGF58KM213S(D-氨基酸氧化酶)转化小麦，使用草甘膦进行选择和如WO 00/66748的实施例15中所描述的进行再生。

从来源于转化体的植物的叶组织中提取DNA和进行PCR以检验选择性标记基因和编码D-氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR阳性植物。在开花期间，收集雌蕊和花药并制备RNA。通过Northern分析确定DNA表达。此外，使用pET载体在大肠杆菌中表达D-氨基酸氧化酶基因并部分纯化。从SDS凝胶上切下所表达的蛋白的蛋白带并用于产生多克隆抗体。通过Western分析将这些抗体用于检测在花组织或其它组织中的表达。

实施例8.有效地产生杂交谷类作物的方法，其中DL膦丝菌素用于杂草控制和同时用作化学杂交剂，其中由所产生的杂交种子产生的F1代杂交植物在营养和生殖上基本上都对DL膦丝菌素的施用具有耐受性。

化学杂交剂(chemical hydridising agent)很昂贵。使用相对便宜的物质例如商业除草剂如化学杂交剂是想要的。这也会达到更好的效果，因为可将杂草控制与化学杂交相结合。然而为了实现这个建议有许多问题需要克服。首先，需要建立对所述的除草剂具有耐受性的雄性和雌性亲本系。此外，为了获得想要的响应除草剂施用的‘条件性’能育，需要以这样的方式对两个系进行基因工程改造，所述方式使得对除草剂的耐受性不扩展到所有组织中，而是以组织特异性的方式表达以使各个所要求的花组织保持选择性易感性。因此，在一个系(雌性亲本系)中，必须使植物的营养组织和雌性组织具有对除草剂施用的耐受性同时雄花组织的关键部分必须保持对除草剂施用的易感性，而在另一个系(雄性亲本系)下，相反地只需要雌配子形成组织的一些关键部分保持易感性。即使可以实现这个，仍有许多关于杂交种子和F1代的进一步问题需要克服。假定该代作物必定包含至少两个能够提供对除草剂抗性的基因，也需要该相同的除草剂也可用于作物中杂草的控制。然而，很难想象除草剂、组织特异性启动子区域和可允许相同除草剂在F1代中这样使用的耐受性基因的组合。很可能在对F1代施用除草剂后，杂交作物展现营养耐受性但却产生很少量或不产生谷粒。例如，对于除草剂草甘膦，通常的抗性机制是表达EPSP合酶的抗性形式。鉴定允许R-EPSPS在所有组织中和在所有时间(除了在雄蕊或柱头发育的关键阶段外)充分表达的启动子区域或启动子区域组合是非常困难的。关于这个问题最直接的方式是使用反义或类似的方法，其中R-EPSPS基因的表达由组织非特异性/组成型启动子驱动而在例如雄蕊中由于反义EPSPS基因(参见例如WO99/46396)的表达导致只有局部和短暂地抑制。然而，在这种情况下，在雄蕊(或柱头)中表达的抑制由显性基因驱动。很清楚，对于任何这样的机制，对F1代施用除草剂可导致由于显性雄性和雌性条件性不育基因的相加效应造成的不育无收益的作物。

本发明提供了克服使廉价商业除草剂DL膦丝菌素能够用于杂草控制和在杂交谷物生产中用作杂交试剂的问题的方法，此外，所述方法提供了所得的杂交谷物或水稻，在所述作物中可安全地将DL膦丝菌素(或L-膦丝菌素)用于杂草控制而基本上没有产量损失。作为进一步的利益，来自F1代的自交种子(以后可在随后的作物中产生自生植物)更容易管理，因为如果用控制量的DL膦丝菌素喷雾其自身通常是不育的。对于从F1代植物到野草(例如红米)或其它谷类作物的花粉异型杂交的后代也是如此。本发明提供了将商业除草剂制剂DL膦丝菌素的非毒害植物的组分D-膦丝菌素转化成有活性的L型的基因和酶。将L-膦丝菌素转化成N-乙酰L-膦丝菌素的PAT基因也是已知的并且被商业地用于在作物中提供对DL膦丝菌素的耐受性。进一步与本实施例紧密相关的观察是令人吃惊地发现包含在大麦质体蓝素启动子区域的有效表达控制之下的PAT基因的小麦基本上在生殖上对以高达至少2kg/ha比例施用的DL膦丝菌素具有耐受性。因此描述于实施例6中的构建体的至关重要的特征是提供抗性性状的PAT基因在启动子区域的有效控制之下表达，所述构建体用于提供本实施例的植物，所述启动子区域提供基本上只在绿色组织中的表达。这种有用的启动子区域的特征在于其应当以这样的方式表达PAT，所述方式使其充分保护所有的非绿色花组织免受叶片施用的DL膦丝菌素的损害，同时仅在花组织中自身提供最低水平的PAT表达并且在被靶向条件性不育的部分中水平尤其低。当PAT在大麦质体蓝素启动子区域的有效控制之下表达时，这种状况似乎是相符的，因为基本上所有喷施的L-膦丝菌素通过叶片进入体内并且在其被转运到发育中的花组织之前被截住并被转化成非毒害植物的N-乙酰-L-膦丝菌素。因此，在本发明中，在亲本系中导致组织选择性不育效果的L-膦丝菌素只是通过D-氨基酸氧化酶从韧皮部流动的非毒害植物的D-膦丝菌素中短暂和局部地产生。通过将驱动PAT表达的花控制元件与在互补的成对构建体(实施例5)中驱动D-氨基酸氧化酶表达的元件进行精确配比，可以确保在F1杂种中，在靶花组织中L-膦丝菌素的瞬间爆发被相应的在相同时间内和相同局部组织中的PAT表达的暴发快速中和。因此，在杂种中所述除草剂的施用不会诱导不育性效果。然而，在进一步的代中，杂交种的花对应PAT和D-氨基酸氧化酶将会分离，从而所得的植物再次成为依赖于控制量的DL膦丝菌素施用的雄性或雌性不育。

使用实施例6和7中描述的方法，将描述于实施例5中的构建体转化入小麦或(使用标准的超二元载体方法)转化入水稻中，接着被选择和再生出幼苗。选择T0转化体事件(使用农民用的无性繁殖以保持未处理的系)并且可选择地使用基本上如实施例1和2中所描述的方法选择适合事件用于培育雄性近亲交配亲本或雌性近亲交配亲本系，所述雄性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雌性不育，所述雌性近亲交配亲本系是依赖于DL膦丝菌素施用的条件性雄性不育。最好的系表现最好的除草剂耐受性，最少的产量损失，最明显的条件性不育表型等。选择可选择的雄性亲本和雌性亲本系并任选地与合适的优良系回交多代。全面表征在这些最终选择的事件中的基因插入，如对条件性能育的遗传和除草剂抗性性状的基因表征和所表达的基因产物的表征。

然后以合适的比例在田间将所选择的雌性和雄性亲本系一起间作，并以合适的0.05至5kg/ha比例喷施DL膦丝菌素直至开花早期(选择以最优化杂交种子的产量)。所产生的种子具有有利方面：其可长出不仅受益于杂种优势而且对含有DL膦丝菌素的除草剂制剂具有耐受性的植物，从而可使用DL膦丝菌素在作物中选择性控制杂草。所述杂交种子也具有有利方面：其表达的除草剂耐受性性状仅能部分地传递给之后的自交代或异型杂交入相关的杂草中。因此，例如，由本发明产生的杂交水稻可在使用DL膦丝菌丝作为杂草控制剂的情况下生长而无明显的产量损失。然而作为来自杂交水稻的花粉与红米雌性亲本的异型杂交后代的红米植物的后代，其在营养生长上对DL膦丝菌素的处理具有耐受力但却具有减少的自稔性(归因于花组织中D-氨基酸氧化酶的表达)，从而产生很少的谷粒。因此通过使用本发明的杂交水稻，可使用DL膦丝菌素控制杂草，同时大大减少红米污染谷粒的未来风险，所述污染是由于通过异型杂交转入紧密相关的红米中的除草剂抗性性状造成。类似地，在喷施DL膦丝菌素后，从杂种作物中长出的的第二代自生(volunteer)水稻或小麦绝大部分不产生谷粒。

实施例9.使用多核苷酸的玉米的转化/再生，所述多核苷酸包含优先地在雄性生殖组织中表达并编码能够氧化D-膦丝菌素的酶的嵌合基因。

将RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表达盒克隆入上述的系列bluescript sk载体pBLRA8_RGF58KM213T、pBLRA8_RGF58KM213S等。任选地，将这些载体和包含选择标记的DNA例如pUbiHyg或pSOG35一起用于共轰击；如例如WO 98/39462的实施例11中所描述的，使用潮霉素或氨甲喋呤进行选择和再生。

可选择地，将pZEN18_BLRA8_RGF58KM 213S等直接用于轰击或转移至硅碳化物须晶(whisker)上再导入玉米细胞中，如例如WO00/66748的实施例12和13中所描述的，在草甘膦上选择和再生玉米植物。

可选择地，使用包含超二元载体的根癌农杆菌转化玉米。例如，在一系列与WO 00/66748描述的相似的步骤中通过一系列亚克隆和同源重组将pZEN18表达盒和BLRA8_F58KD-氨基酸氧化酶嵌合基因从pZEN18_BLRA8_RGF58K切出并克隆入来源于pSB1的超二元载体的T-DNA的右和左边界之间的位点上。用包含超二元载体的农杆菌感染来自未成熟胚的植物材料，所述载体包含草甘膦标记基因和本发明的嵌合基因。如WO 00/66748中所描述的使用草甘膦选择和再生植物。

从来自转化体的植物的叶组织中提取DNA并进行PCR以检测选择性标记基因和编码突变体D-氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR阳性的植物。在开花期收集雄蕊和花药并制备RNA。通过Northern分析确定DNA的表达。此外，使用pET载体在大肠杆菌中表达突变D-氨基酸氧化酶基因并部分纯化。从SDS凝胶上切下所表达的蛋白的蛋白带并用于产生多克降抗体。通过Western分析将这些抗体用于在花组织和其它组织中检测表达。

实施例10.定点诱变以产生具有进一步提高的氧化D-膦丝菌素和/或D-天冬氨酸等的能力的、来源于纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突变体形式的进一步的突变体。

本实施例关注编码纤细红酵母D-氨基酸氧化酶变体的基因的产生，所述D-氨基酸氧化酶的变体具有提高的氧化D-膦丝菌素和/或其它酸性侧链D-氨基酸的能力。这些基因用于本发明的优选实施方案(描述于其它实施例中)中，在所述实施方案中产生了依赖于D-膦丝菌素或D-天冬氨酸施用的条件性不育。在特定的本实施例中，除了F58K突变之外，这些基因还编码具有在位点‘213’和/或在位点‘238’上存在单个氨基酸变化的酶。本领域技术人员知道使用完全类似的方法用相同组的可选择的氨基酸在同等优选的位点223上取代酪氨酸以产生相似的系列突变。在天然的蛋白序列基序RCTMDSS(SEQ ID NO：6)中在‘213’位点上的甲硫氨酸被标志为M。在天然的序列基序GGTYGVG(SEQ ID NO：7)中在位点238上的酪氨酸被标志为‘Y’。存在许多本领域已知的方法，所述方法提供编码在这些位点中的一个或两个位点上具有氨基酸变化的系列D-氨基酸氧化酶变体的系列基因。用于诱变的DNA模板的选择也依赖于想要的用途。因此，例如，当想要突变基因在植物中表达时，编码纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的植物最优化的合成DNA例如编码SEQ ID NO：3的突变体形式F58K突变体是合适的起始点。在另一方面，当想要直接使用突变体基因作为起始点以进一步进行多轮的随机诱变和在基于酵母或大肠杆菌的选择系统(如实施例11中的)中得到改进，那么天然DNA序列的或经最优化用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)表达的合成序列的F58K突变体更合适。

用于提供合适的纤细红酵母D-氨基酸氧化酶变体的优选的方法是通过使用Strategenes Quickchange mutagenesis试剂盒使用简并寡核苷酸进行的。根据厂商说明书进行所使用的方法。

例如在编码天然纤细红酵母DNA序列(所述序列编码D-氨基酸氧化酶)的突变体形式的F58K突变体是用于诱变的模板DNA的情况下，成对的‘上’(RGMUTTOP)和‘下’(RGMUTBOT)简并寡核苷酸的合适长度可以是50-250个核苷酸并且经设计在其中包含下列序列区域：

RGMUTTOP在其中包含序列(SEQ ID NO：4)

tccccatgcaagcgatgcacgNNNgactcgtccgaccccgcttctcccgcctacatcattccccgaccaggtggcgaagtcatctg

cggcgggacgNNNggcgtgggagactgggacttg.

RGMUTBOT在其中包含序列(SEQ ID NO：5)

caagtcccagtctcccacgccNNNcgtcccgccgcagatgacttcgccacctggtcggggaatgatgtaggcgggagaagcggg

gtcggacgagtcNNNcgtgcatcgcttgcatgggga

此外，这两个寡核苷酸，RGMUTTOP和RGMUTBOT在各端包含序列，所述序列在两个寡核苷酸相互退火时将形成5’和3’末端，所述末端恰好与在合适的单一限制性位点对上切割所述模板DNA建立的末端匹配(即经设计以使退火的寡核苷酸可取代从编码D-氨基酸氧化酶的模板DNA切出的单一限制性片段)。

将0.5至1.0μg各寡核苷酸转入0.5ml Eppendorf离心管中并在合适的温度(例如94℃，依赖于经计算的解链点)下加热5分钟，然后通过冷却到室温慢慢退火。然后用两种限制性酶(根据模板DNA上的两个单一限制性位点，所述位点横跨包含两个要被取代的密码子的区域和表征退火DNA末端)切割模板DNA(例如pYES6/CT酵母穿梭载体)，凝胶纯化，用退火的寡核苷酸连接，转化入酵母中以表达通过诱变建立的可选择的D-氨基酸氧化酶。然后，如描述的，选择在以D-膦丝菌素类似物(例如D-高半胱氨酸)或D-膦丝菌素(当PAT基因共表达时)作为唯一氮源时生长最好的酵母克隆作为包含具有想要性质的突变体D-氨基酸氧化酶编码序列的酵母。可选择地在除了酵母以外的一些微生物中和例如在大肠杆菌溶原性细菌中的pET载体的T7启动子表达控制之下进行D-氨基酸氧化酶的表达。在这种情况下，在转化之后，可挑拣单个菌落，重复涂板、生长、诱导、裂解和使用本领域已知的方法(例如，测定过氧化物产生的荧光测定筛选法或测定氨或2-酮酸产生的比色测定法)筛选想要的针对D-膦丝菌素的底物活性。可在2ml的微量滴定板小孔中合适地培养受试生物体转化体，原位裂解并就D-氨基酸氧化酶的活性可选择地使用膦丝菌素或D-天冬氨酸作为底物(依赖于最想检测的活性)进行比色测定。选择产生最高活性水平的系。可选择地，进一步转化转基因大肠杆菌系以使其表达PAT基因(例如，组成型地表达)和用IPTG诱导以使其表达‘受试’突变体D-氨基酸氧化酶。选择在基本培养基上表现最佳生长的经诱导的系，所述基本培养基以膦丝菌素(或，任选地，膦丝菌素类似物)作为主要的氮源(任选地包括少量的铵离子)。

任选地，不仅基于最大化利用D-膦丝菌素或其它酸性侧链D-α氨基酸的能力而且基于提高的热力学稳定性(例如在酶测定之前将提取物或细胞系接受短时间热处理或将细胞在升高的或降低的温度下培养)或其它性质来筛选系。

培养所选择的酵母或其它微生物克隆，制备DNA和通过校正(proofreading)PCR克隆全长D-氨基酸氧化酶DNA序列并通过使用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒将其克隆入pCRBlunt II。确定所选择的克隆的特征性D-氨基酸氧化酶编码序列。将这些D-氨基酸氧化酶编码序列进一步亚克隆以在pET载体(例如Novagen pET 24a)中表达和转化到大肠杆菌BL21 DE3中。在发酵罐中将细胞培养在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培养基中，用IPTG诱导，收获，破碎和部分纯化提取物并就D-氨基酸氧化酶活性(如下面描述的)进行测定。选择编码D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因，所述选择的酶产生可接受的稳定性和在pH7.0下对D-膦丝菌素具有每mg纯蛋白最高活性(kcat/Km)。

此外，产生编码特定地被靶向的D-氨基酸氧化酶的一系列特定DNA序列。特别是产生编码纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突变体形式的基因，所述D-氨基酸氧化酶突变体在位点213、223和238上具有进一步的突变变化，并且特别是在位点213上，野生型甲硫氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位点223上野生型酪氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代，和/或在位点238上野生型酪氨酸被His、Lys、Arg、Thr、Gly、Pro、Gln、Ser、Cys、Asn或Ala取代。所使用的方法与上述方法相同，所不同的是：不用寡核苷酸混合物，设计单个寡核苷酸对，并用于实现各个单或双氨基酸的改变。克隆各所得到的突变体D-氨基酸氧化酶编码序列以使其在Novagen pET 24A的T7启动子后面以进行表达(未标记)并转化入大肠杆菌BL21 DE3中。在1.0升发酵罐中将所述细胞培养在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培养基中，用1mM IPTG诱导表达并通过低速离心收获。

LC50培养基包含(1升)

KH₂PO₄(3g)、Na₂HPO₄(6g)、NaCl(0.5g)、酪蛋白水解物(Oxoid)(2g)、(NH₄)₂SO₄(10g)、酵母提取物(Difco)(10g)、甘油(35g)(在溶液中制备这些组分并高压灭菌)。将下列额外组分以液体形式过滤灭菌并加入到培养基中：MgSO₄(2.5ml，246.5mg/ml溶液)、盐酸硫胺素(1ml，8mg/ml溶液)CaCl₂.2H₂O(0.2ml，147g/l溶液)，*FeSO₄.7H₂O/柠檬酸母液(2ml)、**微量元素溶液(5ml)并配制到1升。

*每100ml FeSO₄.7H₂O/柠檬酸母液由FeSO₄.7H₂O(0.415mg)、柠檬酸(0.202mg)组成。

**每1ml微量元素溶液组合物含有AlCl₃.6H₂O(20mg)、CoCl₂.6H₂O(8mg)、KCo(SO₄)₂.12H2O(2mg)、CuCl₂.H₂O(2mg)、H₃BO₃(1mg)、KI(20mg)、MnSO₄.H₂O(0.8mg)、N₂MoO₄.2H₂O(4mg)、ZnSO₄.7H₂O(4mg)。

在水中清洗大约7g湿重的细胞。将细胞悬浮在等体积的含有2mMEDTA、2mM DTT和0.01mM FAD的pH7.050mM/Mops/KOH缓冲液中。使用玻璃匀浆器使细胞均匀地悬浮，然后在Constant Systems(BudBrooke Rd，Warwick U.K.)Basic Z细胞破裂器中使用一个棒杵(shot head)以13500psi破坏细胞。将粗提取物在30,000g下保持冷冻(大约4℃)离心1小时并弃去沉淀。将一些提取蛋白跑SDS PAGE凝胶并用考马斯亮兰染色，并且通过与类似方法制备的只含有‘空’pET载体的细胞提取物进行平行比较，估计在提取物中2-50％的总可溶性蛋白是D-氨基酸氧化酶。将一些提取蛋白交换到含有0.01mM FAD的pH7.0 50mM Mops/KOH缓冲液中。在标准的氧电极小室(在25℃下在0和饱和浓度的氧之间校正)中用相同的缓冲液稀释该溶液。任选地，进一步使用离子交换、苯基琼脂糖、分级硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化D-氨基酸氧化酶。在25℃下通过向稀释的酶中加入200mM DL膦丝菌素的铵盐溶液或通过加入25mM D-天冬氨酸开始进行测定。为了测量V_max和K_m值，以正常的方式改变底物浓度。在总蛋白和据估计的D-氨基酸氧化酶的纯度基础上估计V_max值。基于SDS PAGE，突变体D-氨基酸氧化酶在粗蛋白提取物中通常构成15-35％的可溶性蛋白(或更高，当D-氨基酸氧化酶进一步纯化时)。在氧电极小室中最终的反应体积是2ml。小室中蛋白的最终量最高可以达到5mg，依赖于被测量的活性水平。测量氧消耗(在减去基线的偏差后)速率。

在上述条件下获得的实施例结果如下。野生型纤细红酵母D-氨基酸氧化酶没有表现出可检测的氧化D-膦丝菌素的能力并且当D-天冬氨酸用作底物时只表现较低的活性(大约30nmol/min/mg)(与当使用25mM D-丙氨酸作为底物时＞40μmol/min/mg的对照速率相比)。F58K突变体形式对膦丝菌素表现较低的活性(＞大约15nmol/min/mg)和对D-天冬氨酸表现中等活性(大约1.8μmol/min/mg)。F58KM213S双突变体形式对D-天冬氨酸表现非常高的活性大约为40μmol/min/mg，而对DL膦丝菌素，大约为3.2μmol/min/mg的高水平活性。F58KM2X3S双突变体针对D-膦丝菌素的K_m估计约为12mM。三突变体F58K，M213S，Y223H针对D-膦丝菌素表现大约0.4μmol/min/mg和针对D-天冬氨酸表现大约0.7umol/min/mg的中等活性。

在对照实验中，在可检测水平上没有观察到纯L型被氧化而，依赖于浓度，纯D型被氧化的速率高达DL外消旋体被氧化速率的2倍。

使用基于Konno的‘Methods for the Detection ofD-Amino-Acid Oxidase’.Biol.Proced.Online.(1998)May 14；1：27-31中的方法的更高通量的测定方法获得额外的结果。这是个在使用氧电极测定进行更精确分析之前用于进行最初的突变体筛选的特别有用的方法。将如上所述获得的D-氨基酸氧化酶基因的随机/定点突变体以Ndel/EcoRI片段克隆入PET24或PET21载体(Novagen)并通过热激转化入BL21-CodonPlus(DE3)-RP Competent细胞(Stratagene)中。在选择和涂板后，挑出单个菌落并在30℃下在包含大的2ml小孔的96孔板中在1ml L Broth(+卡那霉素或氨苄青霉素+氯霉素)中培养过夜。然后将板低速离心，将细胞沉淀到板底部并小心移走上清液。然后通过在0.5ml新鲜L培养基(无抗生素)中涡旋重新悬浮细胞并在30℃下进一步振荡温育2小时。再加入0.5ml L Broth+4μl IPTG，然后把板放回振荡培养箱(30℃)中培养3小时。将板再次离心以使细胞沉淀下来，除去上清液并将板在-80℃下冷冻10分钟。然后将板回复到实验室温度并在酶测定之前裂解细胞沉淀。向各小孔中加入包含1mg/ml溶菌酶的0.4ml CelLyticB(Sigma)并放置10分钟。向各孔中加入玻璃珠，然后密闭小孔用玻璃珠研磨2分钟。然后将板离心将残渣分离出来。然后通过加入30μl受试D-氨基酸(例如，D-谷氨酸，D-天冬氨酸或DL草铵膦的铵或钾盐，以例如5、10、25、50/100或200mM在水中的浓度)和30μl 0.133M pH约8.3的焦磷酸盐缓冲液(包括1μl/ml的β巯基乙醇和5mg/ml过氧化氢酶)、20μl 0.1mM FAD和10μl 70％甲醇对10μl所得的上清液提取物进行测定。然后将板温育以使测定在室温下进行10-60分钟，之后加入100μl 10％的TCA终止各孔中的反应。然后从各孔中取出50μl放入新板的对应孔中，其中新板的各孔含有50μl 5M KOH。然后将含有0.5％Purpald’(4-氨基-5-肼-1，2，4-三唑-3-硫醇)的50μl 0.5M HCl加入各小孔并将板在室温下放置15分钟。过后，向各小孔中加入50μl包含0.75％高碘酸钾的0.2M KOH，最后向各小孔中加入5μl异丙醇以防止forming。然后在550nm测量板中各小孔的光密度。高水平的D-氨基酸氧化酶活性对应着高OD读数。通过使用标准的酮酸添加可对测定进行定量，并且基于蛋白浓度(使用标准的方法例如Bradford或Lowry方法测量的)计算比活性。基于提取物中总蛋白的百分比(通过考马斯染色SDS PAGE估计的)估计DAMOX的比活性，其是D-氨基酸氧化酶。通过使用上述测定显示，例如在25mM D-膦丝菌素底物浓度的情况下，纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的F58K，M213T双突变体形式的活性大约超过F58K，M213S形式的2-5倍(参见表1)。

表1

获自基于板的测定的实施例结果，所述测定用于比较以D-膦丝菌素为底物的D-氨基酸氧化酶的突变体形式的活性。

在上述条件下使用25mM DL膦丝菌素为底物进行测定。在这些条件下包含酶的野生型形式的提取物不产生任何可检测的颜色。在对纤细红酵母DAMOX的F58K，M213T突变体形式的提取物进行30分钟的测定后在550nm获得的光密度超过F58K，M213S突变体形式的类似提取物的两倍。因为在高光密度时测定变成了非线性，因此估计在所述测定条件下F58K，M213T突变体形式的活性绝对超过F58K，M213S形式2-5倍。

  突变体  实验  550nm的吸收值  F58K，M213T  1  2.2019  F58K，M213T  2  2.2966  F58K，M213T  3  1.5633  F58K，M213T  4  1.4484  F58K，M213T  平均值  1.8775  F58K，M213S  1  0.9843  F58K，M213S  2  0.8374  F58K，M213S  平均值  0.9109  F58H，M213S  1  0.5982  F58H，M213S  2  0.6030  F58H，M213S  平均值  0.6006

实施例11.进行随机诱变和选择以产生F58K D-氨基酸氧化酶基因的进一步突变体，所述突变体编码具有提高的氧化D-膦丝菌素的特异性(kcat/K_m)的酶

将密码子最优化的用于在酵母中表达并编码纤细红酵母D-氨基酸氧化酶的F58K突变体形式或F58K，M213S或F58K，M213双突变体形式的DNA序列以HindIII/PmeI片段克隆入Invitrogen的pYES6/CT穿梭载体中并位于GAL1启动子的下游。类似地，将这些DNA序列以XbaI片段克隆入pAUR123蛋白表达穿梭载体(Panvera)并位于ADHI组成型启动子的下游。在大肠杆菌中进行这些载体的构建然后将其转化入S288C啤酒糖酵母中。如果合适，使用PAT基因分别取代pYES6/CT/pAUR123载体上的杀稻瘟素或aureobasidin抗生素抗性基因并使用DL膦丝菌素而非抗生素保持选择。使用各种诱变方法建立D-氨基酸氧化酶的进一步突变体变体。例如，通过Mn2+毒化的PCR产生多个D-氨基酸氧化酶编码序列的变体，将所述混合群体克隆入两个穿梭载体的GAL1或ADH1启动子的前面，转化入酵母，用PAT基因进一步转化酵母，并就新序列提供给酵母在以膦丝菌素为主要氮源的基本培养基上快速生长的能力进行筛选。可选择地直接对经转化的酵母进行突变和选择。例如，将用上述质粒转化的酵母在化学诱变剂例如EMS存在的情况下在发酵罐中培养在氮受限的培养基中(所述培养基包含20-100mM DL膦丝菌素)并诱导D-氨基酸氧化酶表达(例如，培养在以半乳糖为碳源的培养基上)。在连续继代培养后，鉴定在以膦丝菌素作为主要氮源的培养基上生长最快的继代培养物，涂板并将所述D-氨基酸氧化酶编码序列进行亚克隆、测序和在大肠杆菌中表达以进一步表征。

在进一步优选的方法中，通过大肠杆菌株系XL1-red的扩增和传代在两个穿梭载体上进行诱变。该株系在三个主要的DNA修复途径中具有缺陷，mut S、mut D和mut T。在DNA复制过程中这导致突变率增加了大约5000倍。所使用的实验方案依照Stratagene。例如，将10ng穿梭载体转化入大肠杆菌XL1-red中，培养细胞，然后涂布在含有氨苄青霉素的L-Broth上培养24小时。通过从板上刮取菌落转入L broth中，各板汇集超过200个转化体菌落，然后以1∶100和1∶1000稀释培养并在37℃下在L-broth/氨苄青霉素上连续继代培养1-2周以使大量细胞分裂继续进行。从许多板开始进行类似的过程。从培养过夜的细胞中制备小批量的穿梭载体DNA并转化回酵母中。培养转化的酵母并且如上所述选择包含改进的D-氨基酸氧化酶的菌落。

可选择地，在除了酵母以外的一些微生物中和例如在大肠杆菌溶原性细菌中的pET载体的t7启动子的表达控制下进行D-氨基酸氧化酶的表达和选择。在这种情况下，将D-氨基酸氧化酶编码序列(任选地通过Mn2+毒化的PCR诱变)克隆入pET载体，转化入大肠杆菌XL1red中，在多代传代后，转化回大肠杆菌溶原性细菌例如大肠杆菌BL212DE3中。然后挑出单个菌落，影印铺板，培养，用IPTG诱导，裂解和使用本领域已知的方法(例如，用于检测过氧化物产生的荧光测定筛选方法或用于检测2-酮酸或铵产生的比色测定方法)筛选想要的针对D-膦丝菌素的底物活性。可选择地，进一步转化转基因大肠杆菌系以使其表达PAT基因(例如，组成型表达)和用IPTG诱导以使其表达‘受试’突变型D-氨基酸氧化酶。选择在基本培养基上表现最佳生长的经诱导的系，所述基本培养基以膦丝菌素(或，任选地，膦丝菌素类似物)作为主要的氮源(任选地包括少量的铵离子)。

任选地用于酵母选择的培养基含有低浓度的溶剂(例如，0.1％DMSO)。

实施例12.对映体纯的D型膦丝菌素的生产

用具有克隆(未标记)的在T7启动子后面表达的PAT编码序列(A02774)的Novagen pET 24A转化大肠杆菌BL21 DE3 codon plus RIL。将这些细胞在10升发酵罐内在含有卡那霉素的LCM50培养基中培养至大约40OD_600nm的密度，用0.2mM IPTG诱导，通过低速离心收集并迅速转移至含有9.91g D/L膦丝菌素(PPT)铵盐的基本培养基中。

基本培养基(1升内)为

将Na₂HPO₄(6g)、KH₂PO₄(3g)、NaCl(1g)、NH₄Cl(1g)溶解在水中并进行高压灭菌，过滤灭菌后加入下列溶液：CaCl₂(1ml，14.7g/l)、MgSO₄(1ml，246.5g/l)、盐酸硫胺素(5ml，1mg/ml)葡萄糖(30ml，单独高压灭菌的20％溶液)、DMSO 0.5ml。

发酵详述如下。用LB broth培养的含有PAT基因的大肠杆菌BL21DE3 codon plus RIL的接种体(200ml)接种在10升装有LCM50培养基的发酵罐中并保持在30℃，200rpm搅拌速度，pH6.5，达50％空气饱和的氧浓度下。大约12小时后，所述培养物长到OD_600nm大约为30。然后通过加入0.2mM IPTG诱导PAT表达。1.5小时后，所述培养物进一步培养至OD_600nm大约为40，接着离心收集细胞，在8升基本培养基中清洗细胞。再将细胞离心一次，然后在发酵罐中重新悬浮于终体积10升的基本培养基中，所述培养基含有9.91g商业可购得的D/L膦丝菌素的铵盐和进一步的0.2mM IPTG。将温度增加到37℃并且通过质子和磷NMR监控发醇罐培养基中的样品以确定a)葡萄糖显著降低和需要补料的时间和b)将膦丝菌素转化成N-乙酰膦丝菌素的程度。经过大约12小时的过程，向发罐中加入大约500克葡萄糖。在数小时后观察到N-乙酰膦丝菌素开始形成并且在大约20小时后达到超过93％的L-PPT(46.5％v的D/L)转化成N-乙酰-L-PP。迅速收获发酵培养基，通过低速离心取出细胞。

使用离子交换层析从发酵培养基中纯化D-PPT。将发酵培养基(约9.51)贮存在4℃。用H⁺形式的900mlDowex 50W-X8 200-400目阳离子交换树脂(用HCl预制的)与其混合以使树脂上部的上清液pH降到大约pH3.0。让Dowex树脂在重力作用下沉淀出来并将上清液连同21漂洗Dowex树脂的水轻轻倒出，然后离心澄清。弃去经洗涤的Dowex(最终被回收)。然后用乙酸乙酯(1/4上清液的体积)通过分液漏斗提取澄清的上清液，保留水相部分(约12l)。然后再加入2.3升H⁺形式的Dowex 50W-X8树脂并且搅拌大约12l的溶液。然后让树脂沉定出来。这个阶段树脂上方上清液的pH大约为pH1.6。轻轻倒出上清液并弃去，用大约12升水清洗树脂，再沉淀。再一次弃去上清液并将树脂倾倒在烧结的Buchner漏斗过滤器上并进一步用4.5l水(以除去绝大部分残留的N-乙酰-膦丝菌素)漂洗。用15L 0.4M氢氧化铵将主要包含D-膦丝菌素的级分从树脂中洗脱出来，接着用1.4l水漂洗树脂。该包含D-膦丝菌素的级分的pH大约为11.4。任选地，通过加入例如0.13摩尔醋酸和大约600mlH⁺形式的阳离子交换树脂将其降至大约pH10。如果已加入，让树脂沉淀出来。然后将D-膦丝菌素(上清液)级分加到565ml(5×28cm)的OH-形式的Dowex 1X8-400目阴离子交换树脂柱(用NaOH预平衡和用水清洗)上。对柱子使用超过17个柱床体积的0M至0.32M醋酸铵梯度。收集55ml级分。通过215nm的UV，还有通过质子和31P NMR监控级分。该分析表明在级分39和78之间洗脱出高纯度的膦丝菌素。N-乙酰膦丝菌素作为未结合材料被洗脱在早期的组分中，一些谷氨酸在更后的级分79-90中洗脱。级分63至78(对应于6-7.6床体积)构成了大量高纯度的膦丝菌素。将膦丝菌素级分冷冻干燥并且通过质子和磷NMR发现其非常纯(除了醋酸以外，没有其它可见的峰，超过95％的有机材料是膦丝菌素)，尽管基于计算的和观察到的干重之间的差异发现通常有一些无机盐(例如氯化铵)残留物残留在膦丝菌素样品中。为了实践目的，当使用D-膦丝菌素(例如喷施植物)时，可认为无机物是惰性的并且当D-膦丝菌素溶液由称量的干样品制备时无机物只需用来考虑调节计算的浓度。

预期根据上述方法分离的膦丝菌素应当基本上是对映体纯的D-膦丝菌素。根据Hori等人(2002)J.Chrom.B 776，191-198的荧光HPLC分析方法证实这点。例如，将50μl的商业购得的DL膦丝菌素(0.01-10μg/ml)或样品溶解在0.1M pH8.5的硼酸缓冲液中并与200μl相同的硼酸缓冲液混合。然后加入50μl 18mM FLEC((+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯)并将混合物在40℃下进一步温育30分钟。使用500μl乙酸乙酯振荡3分钟除去过量的FLEC。取出100μl底部的水层进行HPLC分析。

用77％10mM醋酸铵水溶液(pH5.0)：23％乙腈以0.8ml/分钟流速平衡Inertsil ODS2(15×4.6)5tμM partical HPLC柱。将2μl样品注射入柱中并等度洗脱60分钟，并且使用具有260nm激发波长和305nm发射波长的荧光检测进行监控。观察到膦丝菌素的D和L同分异构体被清楚地分开并且分别在12.4和13.4分钟被洗脱。对根据本方法分离的D-膦丝菌素样品进行检测并估计超过99％的对映体过量。这是基于掺加已知量的商业购得的DL膦丝菌素和下列观察结果的基础上估计的：相对于样品产生的12.4分钟的明显单峰背景，可以检测到右旋13.4分钟峰的多小的增加。

此外，基于峰的整合和与标准曲线的比较，HPLC方法用于估计膦丝菌素的量。此外通过NMR信号的整合来估计膦丝菌素的总量。

据估计，总体上，从大约9.91g DL外消旋体开始，产生大约1.9g(38％产率)纯D-膦丝菌素铵盐，超过99％的对映体过量。50-70％的样品干重包含始终携带的无机盐。任选地这些盐可通过进一步的离子交换和冷冻干燥(在交换成碳酸铵后)除去。

                           序列表

<110>Syngenta Limited

<120>选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

<130>PPD70629

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

aactgcagct ttttggttag cgaatgc                                  27

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac                         35

<210>3

<211>1107

<212>DNA

<213>纤细红酵母

<400>3

atgggatccc aaaagagggt tgtggtgctg ggttccggcg tgataggact cagctccgcg    60

cttatacttg cccggaaggg gtactccgtc cacatcctgg cccgggacct cccagaggat   120

gttagctcac agaccttcgc gtccccttgg gctggagcca actggacccc ttttatgacc   180

ctcactgacg gcccgaggca ggcaaagtgg gaggagtcta cattcaagaa gtgggtggaa   240

cttgtgccaa cggggcatgc catgtggttg aagggaacca ggcgtttcgc ccaaaatgag   300

gacggactgc tcggtcactg gtacaaagat atcaccccca attatagacc cttgccctct   360

tccgaatgtc caccaggcgc tattggcgtg acttatgaca cattgtcagt gcacgctcca   420

aagtactgcc aatacctcgc aagggagctc cagaagctgg gggcgacatt cgagcgccgc   480

accgttactt ccctcgagca agcttttgat ggggctgacc tcgtcgttaa cgcgacgggg   540

ctgggtgcca agtccatcgc tggcatcgat gaccaggcgg ccgagcctat tcgcggtcaa   600

acggtgctcg tcaagtcgcc ctgcaaaagg tgtactatgg acagctcgga cccggcatca   660

ccggcgtaca tcatcccgcg gccaggaggc gaagtgattt gcggcggtac gtacggggtc   720

ggagactggg atctctcggt caacccagag accgtccagc gcatcctcaa acactgcctg   780

cgcctggatc cgactatttc ttcggacggc acaatcgaag gcatcgaggt gctgcggcat   840

aacgtcggac tcagaccggc gaggagggga ggccctcgcg ttgaagccga gaggattgtt   900

cttccacttg acagaacgaa gagccccctc tcactgggcc gtgggagcgc tcgtgcggcc   960

aaggagaagg aggtgacttt ggtgcatgcc tacggtttct ccagcgctgg ctatcaacag  1020

tcttggggcg cagccgaaga cgtcgcacaa ttggtcgatg aggcgtttca gaggtatcat  1080

ggggccgccc gcgagtctaa gctctga                                      1107

<210>4

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(97)..(97)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(98)..(98)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(99)..(99)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<400>4

tccccatgca agcgatgcac gnnngactcg tccgaccccg cttctcccgc ctacatcatt    60

ccccgaccag gtggcgaagt catctgcggc gggacgnnng gcgtgggaga ctgggacttg   120

<210>5

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(97)..(97)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(98)..(98)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<220>

<221>misc_feature

<222>(99)..(99)

<223>其中n＝a，t，c或g.

<400>5

caagtcccag tctcccacgc cnnncgtccc gccgcagatg acttcgccac ctggtcgggg    60

aatgatgtag gcgggagaag cggggtcgga cgagtcnnnc gtgcatcgct tgcatgggga   120

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序

<400>6

Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser

1             5

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序

<400>7

Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly

1             5