ShK毒素类似物及其在选择性抑制Kv1.3钾通道中的应用

摘要

本发明涉及ShK毒素类似物以及应用所述ShK类似物的方法。ShK类似物通常包括与具有阴离子电荷的化学体(如原子、分子、基团、残基、化合物、部分)连接的ShK毒素。在一些实施方案中，与ShK毒素连接的化学体可以包含氨基酸残基。ShK类似物可以施用给人或非人的动物受试者，导致钾通道的抑制或者治疗疾病或病症。在一些实施方案中，可以选择ShK毒素所连接的化学体，以提供对某些钾通道(如Kv1.3通道)的选择性抑制超过其它钾通道(如Kv1.1通道)。在一些实施方案中，ShK毒素所连接的化学体可以包括荧光团，从而提供有荧光团标记的ShK类似物。这样的荧光团标记的ShK类似物可以单独用于流式细胞术，或者与能检测自身反应细胞的II类四聚体结合使用。

说明书

相关申请

本申请要求2004年10月7日提交的美国临时申请60/617,395的优先权，该临时申请全文引入在此作为参考。

技术领域

本发明提供了：a)新型组合物，b)体内和/或体外抑制T-和B-淋巴细胞与其它细胞类型中Kv1.3通道的方法和试剂盒；和c)治疗人类或动物受试者自身免疫和其它病症的方法。

背景技术

细胞质膜形成了真核细胞的外表面。各种离子(如钠、钾、钙等)被动扩散穿过细胞质膜进出细胞。这种进出细胞的离子扩散被细胞膜内存在的“离子通道”推动。离子通道是埋在细胞膜内的蛋白，其控制选择性跨膜离子流，从而使细胞的胞内成分和周围的细胞外液之间形成浓度梯度。由于离子浓度直接参与可兴奋细胞(如神经元)的电活动，离子通道的功能(或功能失常)能显著控制所述细胞的电学特性和状态。事实上，各种失调，泛称“通道病”，据相信与离子通道的功能不足或功能障碍相关。

离子通道如果可以开闭，则称作“门控”。门控离子通道的基本类型包括：a)配体门控通道，b)机械门控通道和c)电压门控通道。特别是，电压门控通道发现于神经元、肌细胞和非兴奋细胞如淋巴细胞上。它们响应跨质膜的电荷改变进行开放和关闭。

Kv1.3通道和自身免疫性疾病

自身免疫病如多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1DM)、风湿性关节炎(RA)和牛皮癣感染了世界范围内数以亿计的人。在这些病症中，据相信特异性自身反应性T细胞-例如MS患者中的髓鞘特异性T细胞-在疾病过程中经历了反复的自身抗原刺激，分化为慢性激活的记忆细胞，通过迁移到炎性组织和分泌细胞因子，促使发病(Viglietta等，2002；Vissers等，1002；Wulff等，2003b)。优先靶定慢性激活的记忆T细胞的疗法将对自身免疫病具有重要价值。

记忆T细胞基于化学因子受体CCR7和磷酸酶CD45RA的表达，分成两个亚群-中枢记忆性(T_CM)和效应记忆性(T_EM)(Geginat等，2001；Sallusto等，1999)。原初和T_CM细胞在迁移到炎症部位之前，寄留在淋巴结中，而T_EM细胞直接朝向炎症部分，在此它们分泌大量IFN-β和TNF-α，并展现出即时效应功能。最近已经表明，MS患者的髓鞘特异性自反应T细胞是主要激活的T_EM细胞(Wulff等，2003b)，髓鞘特异性激活的大鼠T_EM细胞过继转移进入原初受体诱导的严重EAE(Beeton等，2001a；Beeton等，2001b)。一种令人兴奋的T_EM细胞进行免疫调节的新治疗靶标是电压门控Kv1.3 K⁺通道。T_EM细胞依靠激活上调Kv1.3通道，并且其抗原驱动的增殖对Kv1.3阻滞剂极为敏感(Wulff等，2003b)。相反，原初和T_CM细胞对Kv1.3阻滞剂的起始敏感性明显低得多，并且通过上调钙激活的K⁺通道IKCal，迅速变得对Kv1.3阻断有抗性(Ghanshani等，2000；Wulff等，2003b)。

Kv1.3在T_EM细胞中的统治地位为用特异性Kv1.3抑制剂调节该亚群活性提供了有力的途径。通道的功能限制性组织分布，以及在动物模型中，体内阻断Kv1.3减轻了T_CM介导的EAE、牙周病中的骨重吸收和延迟型超敏反应而不导致明显的副作用的事实，提高了Kv1.3作为治疗靶标的吸引力(Beeton等，2001b；Koo等，1997；Valverde等，2004)。尽管阻滞剂会抑制所有激活的T_EM细胞(例如，对疫苗抗原特异的T_EM细胞)，但以Kv1.3为基础的治疗将会是对泛泛无差别地调节整个免疫系统的现有治疗的显著改进。Kv1.3阻滞剂另外的优势是它们可逆。因此，需要时可以递增Kv1.3阻滞剂的治疗作用，并在面临感染时停止治疗，不像化疗药，需要数月来消退。

Kv1.3通道与肥胖

已经发现Kv1.3通道在能量稳态和能量平衡中发挥作用(Hum MoIGenet.2003 12：551-9)。Kv1.3通道基因敲除的小鼠能食用高脂饮食而不增加体重，而对照小鼠给予同样饮食则变得过重。药理阻断Kv1.3通道重述了基因敲除Kv1.3通道的作用。因此，Kv1.3阻滞剂可能应用于控制肥胖症。

Kv1.3通道和2型糖尿病

Kv1.3通道在外周靶器官如肝脏和肌肉调节胰岛素-敏感性中发挥作用(Proc Natl Acad Sci U S A.2004 101：3112-7)。小鼠基因敲除Kv1.3通道提高了肝脏和肌肉对胰岛素的敏感性。因此，Kv1.3阻滞剂通过提高胰岛素外周作用并因此降低血糖水平，在治疗2型糖尿病中具有用途。

已知抑制Kv1.3通道的自然发生多肽

最有力的Kv1.3抑制剂是加勒比海海葵Stichodactyla helianthus的ShK肽。ShK是被3个二硫键交联的35个残基的多肽。ShK在皮摩尔(pM)浓度即可阻断Kv1.3(K_d＝11pM)和抑制T_EM细胞增殖，并在大鼠中改善髓鞘特异性T_EM细胞的过继转移诱发的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。ShK潜在的缺点是对神经元Kv1.1通道的低皮摩尔亲和性(K_d 28pM)。虽然在EAE试验中没有观察到ShK的副作用，但高浓度的ShK进入大脑，这在MS中血脑屏障受损害时可能发生，可能导致有害的神经毒性。因此发展高度特异性的Kv1.3抑制剂是必要的。药物产业和学术团体的广泛努力已经产生了在中等纳摩尔范围抑制Kv1.3的几个小分子，但这些化合物不具有选择性或效力能使其作为可行的药物候选。

以前报告过几个截短的ShK肽类似物。这些ShK类似物中的一种，其天然序列被截短，然后通过引入另外的共价连接(一个非天然的二硫键和两个内酰胺键)稳定。其它类似物中，通过二硫键和内酰胺键稳定的非天然构架被修饰，用于包括来自天然毒素的关键氨基酸残基。这些ShK类似物表现不同程度的Kv1.3抑制活性和特异性。Lanigan，M.D.等；Designed Peptide Analogues of the Potassium Channel BlockerShK Toxin；Biochemistry，25；40(51)：15528-37(December 2001)。

本领域中一直需要发展新型ShK类似物，其选择性抑制淋巴细胞中的Kv1.3通道、而对Kv1.1通道或其它钾通道有最小抑制或没有抑制作用。

发明概述

本发明提供了新型组合物(这里称作“ShK类似物”)，其包含与带有阴离子电荷的有机或无机化学体(如原子、分子、基团、残基、化合物、部分等)相结合(如键合，通过连接剂连接或者缔合)的ShK毒素。

进一步依照本发明，提供了通过对受试者施用有效量的本发明ShK类似物，在人类或动物受试者中抑制钾通道和/或治疗疾病或病症的方法。在一些实施方案中，可以选择ShK毒素连接的化学体，提供对某种钾通道(如Kv1.3通道)超过其它钾通道(如Kv1.1通道)的选择性抑制。

还进一步依照本发明，前述特性的ShK类似物可包括荧光团标签，并且本发明的这种荧光团标签的ShK类似物可单独或联合能检测自身反应细胞的II类四聚体，用于流式细胞术中。

本发明的其它方面、元素和细节通过阅读详细说明书和下面提出的实施例，对于本领域技术人员是显见的。

附图简述

图1显示多个本发明ShK类似物的化学结构。

图2A显示在发表的NMR结构基础上的ShK分子模型，其中对于通道阻滞至关重要的Lys²²，以一种灰色色调突出。L-pTyr通过Aeea接头(右)连接到ShK的Arg¹的α-氨基基团(以第二种灰色色调突出)。接头和L-pTyr的结构在Hyperchem中用AM1制作模型。

图2B显示在稳定转染细胞上，ShK(上)和ShK(L5)(下)对Kv1.3和Kv1.1电流的作用。

图2C显示ShK(深)和ShK(L5)(浅)对Kv1.3(空心符号)和Kv1.1(实心符号)的剂量依赖性抑制作用。K_ds对Kv1.3＝10±1pM(ShK)和69±5pM(ShK(L5))；K_ds对Kv1.1＝28±6pM(ShK)和7.4±0.8nM(ShK(L5))。

图2D显示ShK(L5)洗入和洗脱对Kv1.3的时间过程，其中细胞保持在80mV钳制电压，并且每30秒去极化200msec到40mV。

图2E显示ShK类似物抑制Kv1.3和Kv1.1的K_d值。ShK-F6CA和ShK-Dap²²的K_ds以发表的资料为基础

图3A显示，在用抗CD3、CD45RA和CCR7的抗体染色的人PBMC的CD3⁺-门控群中，通过流式细胞术测定的CD45RA和CCR7的染色强度。

图3B显示，在用抗CD3、CD45RA和CCR7的抗体染色的人T_EM系细胞的CD3⁺-门控群中，通过流式细胞术测定的CD45RA和CCR7的染色强度。

图3C显示，通过抗-CD3抗体刺激48小时的PBMC(空心符号，原初/T_CM细胞混合物)和T_EM细胞(实心符号)，ShK(深灰)和ShK(L5)(浅灰)对[³H]胸苷掺入的抑制作用。

图3D显示，上调KCa3.1表达的预活化的人PBMC(原初/T_CM细胞)，用抗-CD3抗体再次活化时，变得对ShK(L5)抑制作用产生抗性。以前曾经报道，这些细胞变得对Kc_a3.1特异抑制剂TRAM-34敏感。

图4A显示，流式细胞术检测的大鼠脾脏T细胞(左)和PAS T细胞(右)的CD45RC染色。

图4B显示，静息(上)和髓鞘抗原激活(下)的PAST细胞显示出的Kv1.3电流。

图4C提供了图像展示了静息(上)和髓鞘抗原激活(下)的PAST细胞中，ShK-F6CA-染色的流式细胞术图形。未染色的细胞(黑色线)和用ShK-F6CA染色的细胞(浅灰区)。未标记的ShK(L5)对ShK-F6CA染色的竞争用深灰区表示。

图4D显示，在静息(上)和髓鞘抗原激活(下)的PAST细胞中，Kv1.3免疫染色的共焦图像。用Mann-Whitney U检验进行统计分析。

图4E通过用Con A(1μg/ml)激活的大鼠(左)原初/T_CM(空心符号)和T_EM(实心符号)细胞显示，ShK(深色线)和ShK(L5)(浅色线)对[³H]胸苷掺入的剂量依赖性抑制作用。

图4F PAST用MBP刺激7小时后，ShK(深色线)和ShK(L5)(浅色线)对IL2分泌的剂量依赖性抑制作用。G，ShK(L5)-诱导对PAST细胞(空心符号)髓鞘抗原引发的[³H]胸苷掺入的抑制作用，被添加20u/ml IL2(实心符号)所逆转。

图5A显示，在L929细胞中稳定表达的Kv1.3通道上测定的、ShK(L5)的Kv1.3阻滞活性。

图5B显示，四只大鼠皮下单次注射ShK(L5)200mg/kg后，不同时间的ShK(L5)血浓度。血液在指定时间抽取，血清用膜片钳检验，确定ShK(L5)的量。

图5C是图5B的数据拟合为单指数衰减，表明半衰期大约50分钟。

图5D显示，5只Lewis大鼠每天接受皮下单次注射ShK(L5)10μg/kg/天，为期5天，ShK(L5)的血液水平。血液在每天早晨(前一次注射后24小时)抽取，通过膜片钳检验Kv1.3通道的阻滞活性。

图5E显示，大鼠皮下(空心柱；n＝4)或静脉内(实心柱；n＝4)单剂给药ShK(L5)10mg/kg后，不同时间的ShK(L5)血清水平。血液在指定时间抽取，血清用膜片钳检验，确定血中ShK(L5)的量。在单次皮下注射后大约24小时，ShK(L5)在血中保持稳态水平300pM。该浓度足以选择性抑制T_EM细胞的功能。

图5F显示，在大鼠血浆或含有2％大鼠血浆的PBS中加入ShK(L5)的半数阻滞剂量，并在37C下孵育不同时间后，ShK(L5)的回收(％)。在指定时间取出等分试样，在Kv1.3通道上测定阻滞活性。ShK(L5)在血浆中极为稳定。

图6A显示EAE预防的评分。PAST体外激活，清洗，第0天行腹膜注射。EAE的临床评分为：0＝没有临床症状，0.5＝尾稍不举(distallimps tail)，1＝尾巴不举，2＝轻度下肢轻瘫或共济失调，3＝中度下肢轻瘫，4＝完全后肢瘫痪，5＝4+失禁，6＝死亡。大鼠(n＝6/组)从第0天至第5天，皮下仅注射介质(n＝6)或注射ShK(L5)(n＝6；10mg/kg/天)。

图6B显示EAE治疗的评分。PAS T体外激活，清洗，第0天行腹膜注射。当大鼠显现EAE临床症状时开始用ShK(L5)10mg/kg/天治疗，持续3天。

图6C显示耳朵厚度，作为大鼠对抗卵清蛋白引发的DTH反应的指标。动物(n＝6/组)用ShK(L5)10mg/kg/天处理2天，之后测定耳朵肿胀度。用Mann-Whitney U-检验进行统计分析。

图7A显示ShK(L5)的结构，和显示T_EM细胞中Kv1.3通道的抑制作用作为ShK(L5)浓度的函数的图。各数据点代表三个测定值的均值。

图7B是含Kv1.3信号复合体的简图。

图7C显示在IS上CD4，Kv1.3，Kvβ2，SAP97，ZIP和p56^lck的共定位。

图7D显示没有可见的T_EM-APC接触时，CD4和Kv1.3染色。

图7E显示在暴露于MBP-负荷APC下的GAD65-特异性T_EM细胞中，CD4和Kv1.3染色。

图7F显示ShK(L5)100nM不阻止IS形成。

图7G显示ShK(L5)100nM不破坏IS。

图8A图示了三个T1DM患者的GAD特异性T_EM细胞，在没有(黑色)或存在ShK(L5)0.1nM(深灰)、1nM(中等灰)或100nM(浅灰)下，被抗-CD3+交联的二抗(箭头)引发的钙信号。

图8B显示原初/T_CM和T_EM细胞的[³H]胸苷掺入(左)以及T1DM和RA患者的原初/T_CM效应细胞和T_EM效应细胞的[³H]胸苷掺入(右)。T_EM细胞：三个T1DM患者的GAD65-激活的T_EM克隆和来自三个RA患者的抗CD3抗体激活的SF-T_EM细胞。原初/T_CM细胞：来自相同的三个RA患者的抗CD3抗体激活的PB-原初/T_CM细胞。

图8C是系列柱图，显示图8B中用的T_EM和原初/T_CM细胞产生的细胞因子。

图8D显示在MS、T1DM和RA中，疾病相关和疾病不相关自身反应性T细胞的表型。

图8E是图示ShK(L5)抑制钙信号、淋巴细胞增殖和细胞因子产生但不抑制IS形成的方式。

图9是图像表现效应记忆T细胞导致的延迟型超敏(DTH)的大鼠模型。

图10是图像显示在效应记忆T细胞导致的延迟型过敏(DTH)的大鼠模型中，ShK(L5)的治疗方案。

图11是图像表现ShK(L5)在大鼠体内特异性抑制效应型记忆反应，而不损害原初和中央记忆T细胞或B细胞的功能。

图12A显示在新发作的1型糖尿病患者(T1DM)、健康对照和多发性硬化症患者的GAD65-胰岛素和髓鞘特异性T细胞中，Kv1.3电流(上)和通道数量/细胞(下)。

图12B显示这些患者的单个T细胞的Kv1.3染色(上)和荧光强度(下)。

图12C是显示相对细胞数对CCR7染色强度的图。表达高水平Kv1.3的细胞是CCR7-阴性的，即它们是T_EM效应细胞。表达低水平Kv1.3的细胞是CCR&-阳性的，即它们是原初或T_CM细胞。

图12D显示患有T1DM和MS的患者(左)、患有T1DM超过5年时间的患者(中)和患非自身免疫型-2DM的患者，其自身反应型T细胞中的Kv1.3数量/细胞。

图12E显示，新发作T1DM患者的CD4⁺GAD65-四聚体⁺T细胞中的Kv1.3数量。

图13A显示在RA患者的外周血T细胞和滑液T细胞以及OA患者的滑液T细胞中，每个细胞的Kv1.3通道数量。

图13B显示图13A中所示细胞中Kv1.3(浅灰)和Kvβ2(深灰)染色的共焦图像。

图13C是显示相对细胞数对CCR7染色强度的图。

图13D显示RA和OA患者的滑膜用抗CD3或抗Kv1.3抗体染色并用苏木精/伊红(40X)复染色的显微照片(上)和炎症指数的柱状图(下)。

发明详述

下面的具体说明和附图只是为了描述一些，但不必然是全部，本发明的实施例或者实施方案。该具体说明和附图不以任何方式限制本发明的范围。

本发明提供了新型ShK类似物，制造这样的组合物的方法，以及用所述组合物抑制人类或动物细胞中Kv1.3通道(或其它离子通道)的方法，以及用于治疗或预防疾病和病症如T细胞介导的自身免疫病症的方法。本发明的组合物包含与带有阴离子电荷的有机或无机化学体(如原子、分子、基团、残基、化合物、部分等)相连接(如键合，通过连接剂连接或者缔合)的ShK毒素。在本发明的至少一些实施方案中，可以选择带有阴离子电荷的有机或无机化学体，增加或优化化合物的亲和力，抑制Kv1.3通道超过Kv1.1通道。依照本发明，可以与ShK连接或结合的带有阴离子电荷的有机或无机分子或基团的实例，包括但不必然限于：

氨基酸；

多肽；

氨基酸残基；

非天然氨基酸残基；

苏氨酸；

苏氨酸衍生物；

磷酸苏氨酸

丝氨酸；

丝氨酸衍生物；

磷酸丝氨酸；

谷氨酸；

谷氨酸衍生物；

γ羧基-谷氨酸；

天冬氨酸；

天冬氨酸衍生物；

无机化合物或基团；

有机化合物或基团；

琥珀酸酐；和

邻苯二甲酸酐。

依照本发明，本发明组合物的一些非限制性实施例，其中阴离子电荷化学体包括氨基酸残基，示于图1和2C，并在此通过字母数字命名称呼，如下表1所示：

表1

名称 与ShK在2位结合的 氨基酸残基ShK-L1 AEEAc-L-Pmp(OH₂)ShK-D1 AEEAc-D-Pmp(O₂)ShK-D2 AEEAc-D-Pmp(OH，Et)ShK-L3 AEEAc-L-Pmp(Et₂)ShK-D3 AEEAc-D-Pmp(Et₂)ShK-L4 AEEAc-L-TyrShK-L5 AEEAc-L-Tyr(PO₃ H₂)ShK-L6 AEEAc-L-Phe(p-NH₂)ShK-L7 AEEAc-L-Phe(p-CO₂H)

具体参考图1，酪氨酸或苯基丙氨酸或其带电荷的非天然衍生物，通过在其N端(Arg1残基显示为灰色色调)连接的接头与ShK连接(左上)。通道阻滞所需的Lys22，显示为深灰色。ShK的分子模型建立在发表的NMR结构的基础上，并且接头和新残基的结构被模型化。本发明组合物的这些实施方案通常包括ShK毒素，其为多肽，结合(如化学结合，连接或缔合)到至少一个阴离子电荷的氨基酸残基上。在氨基酸残基具有手性中心的实施方案中，可以用所述氨基酸残基的D和/或L对映体。阴离子电荷的氨基酸残基可以是非天然残基，并可以结合或连接到ShK多肽的N-端。在一些实施方案中，阴离子电荷的氨基酸残基可以通过接头连接到ShK的N端，如氨基乙氧基乙氧基-乙酰基接头。这些ShK类似物抑制Kv1.3通道比ShK更特异，因为它们对其它钾通道(如Kv1.1)的亲和力降低。ShK可以从本领域已知的天然来源分离，或者可以是合成的。

ShK毒素的合成

ShK毒素可以用任何适当的方法合成。在一种这样的方法中，包括Arg(Pmc)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)和Thr(tBu)的Fmoc-氨基酸(Bachem Feinchemikalien)可以商购得到，并装配形成ShK毒素。氨基酸的逐步装配可以在Applied Biosystems 431A肽合成器上在0.25mmol等级从Fmoc-Cys(Trt)-R开始进行。残基34至22是单一结合的。其后，除去等分部分(如一半)的树脂，使更好混合。然后剩余肽序列与剩余树脂等分部分双连接。所有的连接在存在2当量(eq)的1-羟基苯并三唑下，通过二环己基碳二亚胺介导。最后两个残基也借助于HBTU/DIEA化学连接。这些残基是Aeea(Fmoc-氨基乙氧基乙氧基乙酸)并作为N-端残基Fmoc-Tyr(PO4)-苯甲基酯。最后除去Fmoc-基后，肽树脂(2.42g)从树脂中分解，同时用试剂K在室温下进行去保护2h。试剂K是本领域已知的并描述于文献中。参见，King，D.S.，Fields，CG.and Fields，G.B.(1990)Int.J.PeptideProtein Res.36，255-266。裂解后，过滤肽，除去用过的树脂珠，用冰冷的二乙醚沉淀。然后在精细过滤漏斗上收集肽，用冰冷的醚清洗，最后用含有20％AcOH的H₂O清洗。肽提取物随后稀释在2升H₂O中，pH用NH₄OH调节至8.0，并在室温下空气氧化36小时。2∶1比例的二硫键与与还原氧化谷胱甘肽氧化后，肽溶液酸化为pH2.5，并泵到Rainin DynamaxC₁₈柱(5.0×30cm)上。样品用5-30％乙腈至含0.1％TFA的H₂O的线性梯度洗脱。产生的级分用两种分析型RP-HPLC系统分析：TFA和TEAP。汇集提纯的级分并冻干(参见，Pennington，M.W.，Byrnes，M.E.，Zaydenberg，I.，Khaytin，I.，de Chastonay，J.，Krafte，D.，Hill，R.，Mahnir，V.，Volberg，W.A.，Gorczyca，W.and Kern，W.R.(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46，354-358.)。

或者，可以利用运用Boc-Bzl保护基策略的固相肽合成，装配初级结构以及肽的类似物。然后用无水HF将肽从固相上分离下来，生成可以如上述折叠为Fmoc合成肽的线性肽。(参见，Stewart，J.M.andYoung J.D.(1984)Solid Phase Peptide Synthesis.2^nd Edition.PierceChemical Company.Rockford，II.)。

或者，装配ShK或类似物初级结构的其它合成方法，可包括化学连接技术，其中肽用C-端硫酯肽制备成系列设计的片段。硫酯肽能与另一个含有N-端Cys残基的肽反应，形成含有天然肽键的肽。用该技术，可以有效装配ShK的初级结构(参见，(4)Wilken，J.and Kent S.B.H.(1998)Chemical protein synthesis.Current Opin.Biotech.9，412-426.)。

或者，可用于装配ShK初级结构的另一种合成方法可利用受保护的肽片段缩合方法，该方法描述于Albericio，F.，Lloyd-Williams，P.，andGiralt，E.(1997)Convergent peptide synthesis；在Methods in Enzymol.Ed G.Fields，Academic Press，New York，NY.pp 313-335中。在该方法中，线性受保护片段被装配成全部侧链受保护的片段。这些片段然后可以用缩合的方式连接在一起，装配ShK或其类似物之一的初级序列。装配片段也能用固相树脂，以易化连接和清洗步骤。

或者，可以用重组方法，其中能产生在原核或真核表达体系中表达的ShK的cDNA编码序列。含有非天然氨基酸的重组体ShK类似物也可能通过利用采用非标准密码子的预负荷tRNA分子。cDNA构建体可以设计为使用这些不用的密码子之一，加入磷酸酪氨酸残基以及Aeea残基。然后可以在类似于合成肽采用的方法中实现重组产生的ShK类似物的折叠(参见，Pennington，M.W.，Byrnes，M.E.，Zaydenberg，I.，Khaytin，L₁ de Chastonay，J.，Krafts，D.，Hill，R.，Mahnir，V.，Volberg，W.A.，Gorczyca，W.and Kern，W.R.(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46，354-358.)。

将阴离子氨基酸残基结合到ShK并任选修饰ShK

阴离子氨基酸残基可以通过接头(如氨基乙氧基乙氧基-乙酰基接头)的方法，或通过任何其它实用的方式，结合于天然或合成的ShK毒素的N端。在本实施例中，制备九个(9)图1所示的ShK类似物。开始，Fmoc-Aeea-OH连接到按照上述方法装配的合成ShK毒素的N端上。然后，树脂分成9等份。然后，或者是Fmoc-Tyr(PO₄Bzl)-OH、Fmoc-d-Tyr(PO₄Bzl)-OH、Fmoc-Tyr(PO₄Me₂)-OH、Fmoc-Pmp-OH、Fmoc-d-Pmp-OH、Fmoc-Pmp(Et)-OH、Fmoc-Pmp(Et)₂-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH，或者是Fmoc-Amp(Boc)-OH用DIC和HOBT连接到一等份的树脂上。然后，去封闭的肽树脂用含有5％三异丙基硅烷的试剂K(King等，1990)室温下裂解和去保护2h。Met(O)通过在15分钟时将固体NH₄I加入到裂解混合物中还原(Nicolas等，1995)。对于含有Tyr(PO₄Me₂)-OH的肽，在含有苯硫基甲烷的TFA中含有1 M TMSBr的裂解混合物(cocktail)被4℃下18h用作清除剂(Tian等，1993)。当用该方法时，通常不完全除去甲基保护基团，并且其中两种(Tyr(PO₄)和Tyr(PO₄Me))可以轻易通过RP-HPLC提纯。含有Tyr(PO₄Me₂)的类似物通过标准试剂K裂解法裂解，保持两个Me基完整。在每种情况下，过滤裂解的混合物，然后将粗制肽沉淀在冰冷二乙醚中。收集沉淀物，从200mg树脂中产生大约75mg肽。粗制产物溶解在20ml 50％含水AcOH中，并稀释为0.751的H₂O。溶液的pH用NH₄OH调节至8.2，并用加入谷胱甘肽(2mM∶1mM)(还原：氧化)使之过夜折叠。所有的类似物用RP-HPLC按以前的描述提纯(Pennington等，1995；Pennington等，1996a；Pennington等，1996b)。收集纯化的级分并冻干。生物分析之前，各样品通过RP-HPLC、AAA和MALDI-TOF MS正式，并调节计算肽含量。

在一些实施方案中，为了改进ShK结构的PK/PD特性，对分解性质敏感的残基可被替换或取代。因此，可以在21位进行Met残基的取代，赋予对氧化作用的稳定效应。另外，C-端酸官能团用酰胺取代，将赋予对C-端羧基肽酶的稳定性。对于结合有N-段阴离子部分的ShK初级结构的这两种取代已经被合成，产生了最稳定和选择性的Kv1.3阻滞剂。不可水解的磷酸盐取代也可赋予对于磷酸盐的酸和碱水解的稳定化效应，以及对磷酸酶的稳定性。所述取代总结如下。所用的首字母缩写定义如下：Pmp＝对-膦酰基甲基-苯基丙氨酸；Ppa＝对-Phosphatityl-苯基丙氨酸；和Nle＝正亮氨酸。

取代：

对-二氧磷基-Tyr-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-酰胺

对-膦酰基-甲基-苯基丙氨酸-Aeea-ShK-Nle21-Cys35酰胺(Pmp)

对-Phosphatityl-Phe-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-酰胺(Ppa)

对-二氧瞵基-Tyr-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-酸

对-膦酰基-甲基-苯基丙氨酸-Aeea-ShK-Nle21-Cys35酸(Pmp)

对-Phosphatityl-Phe-Aeea-ShK-Nle21-Cys35-酸(Ppa)

除了不可水解的Pmp和Ppa外，对-膦酰基(二氟-甲基)-苯基丙氨酸(Pfp)和对-膦酰基-甲酮-苯基丙氨酸(Pkp)的取代也是阴离子取代，提供如下：

Pfp-Aeea-Shk-Nle21 Cys35酰胺

Pkp-Aeea-ShK-Nle21-Cys35酰胺

Pfp-Aeea-Shk-Nle21 Cys35酸

Pkp-Aeea-ShK-Nle21-Cys35酸。

N-端取代的结构在附录B中列出。其它在本发明范围内的结构发表于Beeton，C.等，Targeting Effector Memory T Cells with a SelectivePeptide inhibitor of Kv1.3 channels for Therapy of Autoimmune Diseases，Molecular Pharmacology，Vol.67，No.4，1369-(2005)。其全文特意合并在此作为参考，其完整复制件驸于此作为附录C。

本发明的ShK类似物的治疗用途

本发明提供了在人类或动物受试者中，通过给药受试者治疗有效量(如对减少或消除症状或疾病进展有预防性或有效性)的、由本发明的ShK类似物(如，包括但不限于上面的表1所列举者)组成或含有它的药物可接受制剂，治疗或预防某些病症或疾病的方法，所述病症或疾病如T细胞介导的病症(如自身免疫性病症，移植物抗宿主病，预防器官移植的排斥等)、其它炎性病症、肥胖症和2型糖尿病。可以用任何适用的给药途径(如口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内、局部、经粘膜、经皮、通过给药植入体等)。当用于预防或治疗T细胞介导的病症时，剂量将不足以抑制T细胞膜上的Kv1.3通道。就此，本发明的ShK类似物具有用于预防或治疗各种各样T细胞介导的自身免疫病症的潜力。下列是可以被本发明的方法预防或治疗的一些T细胞介导的自身免疫病的部分实例，根据各种所述疾病主要影响的靶器官分类：

神经系统：           胃肠道

多发性硬化症         Crohn氏病

重症肌无力          溃疡性结肠炎

自身免疫性神经病如  原发性胆汁性肝硬化

Guillain-Barré病   自身免疫性肝炎

自身免疫性葡萄膜炎  与牙周病有关的骨重吸收

血液                  内分泌

自身免疫性溶血性贫血  1型糖尿病

恶性贫                    Addison氏病

自身免疫性血小板减少症    Grave氏病

                          Hashimoto氏甲状腺炎

                          自身免疫性卵巢炎和睾丸炎

血管                      多器官和/或骨骼肌系统

颞动脉炎                  风湿性关节炎(RA)

抗磷脂综合征              骨关节炎(OA)

血管炎如                  系统性红斑狼疮

Wegener肉芽肿病           硬皮病

Behcet氏病                多肌炎和皮肌炎

脊柱关节病如强直性脊椎炎

皮肤：                    sjogren氏综合征

牛皮癣

疱疹样皮炎

寻常性天疱疮

白癜风

不考虑特定的患病器官，据相信T细胞有助于自身免疫性疾病的发展。这些疾病的现有疗法非常不满意，并常涉及使用糖皮质激素(如甲基强的松，强的松)、非甾体抗炎药、金盐、氨甲喋呤、抗疟药和其它免疫抑制剂如环胞霉素和FK-506。同样，另一个可以被本发明的方法预防或治疗的T细胞介导的病症是移植物抗宿主病和/或移植器官的排异。实际上，器官移植程序的结果随着组织配型、手术技术和更有效的免疫抑制处理的精细发展而日渐改进。但是，移植器官的排斥有一个主要问题。T淋巴细胞在免疫反应中扮演着主要角色，并且它们在很大程度上响应移植器官的排异。它们还负责所谓移植物抗宿主病，其中移植的骨髓细胞识别和破坏MHC-错配的宿主组织。因此，抑制T细胞免疫的药物如环胞霉素和FK-506用于防止移植排异和移植物抗宿主病。不幸的是，这些T细胞抑制药是有毒性的，带有肝肾毒性，限制了它们的使用。因此，本发明的方法对于治疗或预防移植物抗宿主病和移植排异提供了毒性较低的替代选择。还有，电压门控Kv1.3钾通道抑制剂已表现出在抑制效应型记忆T细胞上特别有效，因此，本发明的方法在预防或治疗与效应型记忆T细胞有关的疾病方面可能特别有效，所述疾病如骨重吸收和牙周病、牛皮癣、风湿性关节炎、糖尿病和多发性硬化症。除了T细胞介导的疾病外，已经确定Kv1.3通道调节能量稳态、体重和外周胰岛素敏感性。因此，本发明的方法通过抑制细胞膜上的Kv1.3通道，可用于治疗涉及异常的稳态、体重和外周胰岛素敏感性的其它疾病和病症，所述其它疾病和病症包括但不必然限于牙周病中的骨重吸收、2型糖尿病、代谢综合征和肥胖。

流式细胞术中本发明ShK类似物的应用

进一步依据本发明，提供了单独使用用于流式细胞术中的ShK(L5)的荧光团标记形式，或合用能检测异常反应细胞的II类四聚体，体外诊断T细胞介导的病症或者在不同的细胞类型之间进行分类或区别。流式细胞术是在悬液中鉴定细胞的灵活方法，其中在流式细胞术测定的特征的基础上，荧光激活的细胞分类用于选择活细胞。流式细胞术可以检测的细胞特征和功能的类型包括，细胞内外的蛋白表达、DNA的类型、存活率与凋亡、对抗多种药物的泵活性、酶活性、T-细胞激活、T-细胞受体特异性、细胞因子表达、吞噬作用和氧进发活性。因此，在本发明的方法中，与ShK连接的氨基酸残基可以结合荧光团标记单独用于流式细胞术中，或者合用带有能检测自身反应细胞的特异性自身抗原的II类四聚体。可能用所述流式细胞术进行的方法的具体叙述记载于Beeton，C.，等，A Novel Fluorescent Toxin to Detect and InvestigateKvI.3 Channel Up-Regulation in Chronically Activated T Lymhocytes；J.Biol.Chem.，Vol.278，No.11，9928-9937(March 2003)。通常，流式细胞术使用聚焦的激光，在细胞在液体流中通过激光束时照亮细胞。细胞散射的光和与所关注的细胞附着的荧光染料的发光被数种检测器分析并被计算机处理。在细胞大小和形状以及细胞表面和内部存在的许多不同分子的基础上，可以区分和选择细胞。

钾通道抑制作用和本发明的ShK类似物的治疗用途的实例

ShK大致等效地阻滞神经元Kv1.1通道和Kv1.3通道。因此，在血脑屏障受到伤害并使足量的ShK阻滞Kv1.1通道的情况下，要考虑神经毒性。我们的策略是设计Kv1.3特异性抑制剂，这是被我们的发现所引导的，即含有荧光素-6-羧酸酯(F6CA)的ShK-F6CA，所述F6CA通过20-长的Aeea接头连接到ShK N端，表现出对Kv1.3的敏感性超过Kv1.1 80倍(Beeton等，2003)。由于F6CA可以作为限制性羧酸酯存在或者也可以作为环化内酯存在，因此不清楚ShK-F6CA的Kv1.3特异性是否由于F6CA的负电荷、该大体积的荧光素核产生的疏水性、电势平面-p电子堆叠(potential planar-p electronic stacking)或所有这些可能的作用的组合。为了辨别这些可能性并且为了开发非荧光的Kv1.3-选择性抑制剂，我们产生了一系列12个新型N-端取代的ShK类似物，探查某些所述相互作用。通过Aeea接头，将酪氨酸、苯基丙氨酸或其衍生物(电荷、大小和疏水性不同)连接到ShK的N端，我们可以探查电荷和疏水性的作用，得到对F6CA取代所见的选择性增强的了解。

超过Kv1.1抑制的选择性KV1.3抑制：

在图2A-2D所示的实施例中，L-磷酸酪氨酸(L-pTyr)，一种负电荷(净电荷2)的翻译后修饰的芳香氨基酸，通过AEEA接头连接到ShK-Arg¹，产生新类似物ShK(L5)。ShK毒素和ShK(L5)在L929细胞中稳定表达的Kv1.3和Kv1.1通道上测试。图2B显示，ShK和ShK(L5)对钳制电压从80mV至40mV的200ms去极化脉冲引发的Kv1.3和Kv1.1电流的作用。两种肽以剂量依赖性方式可逆阻滞Kv1.3和Kv1.1，Hill系数为1。K_dS用Microcal Origin软件，从所示的剂量-反应曲线测定。正如预期，ShK大致等效地阻滞Kv1.3(K_d＝10±1pM)和Kv1.1(K_d＝28±6pM)(图1C)。相反，ShK(L5)对Kv1.3(Kd＝69±5pM)的选择性超过Kv1.1(K_d＝7.4±0.8nM)100倍(图1B，1C)。Kv1.3电流被ShK(L5)阻滞的时程及其洗脱示于图1D。ShK(L5)洗入(wash-in)的时间常数(T_ON)为131±21秒(n＝7)，而肽洗脱的时间常数(T_OFF)为150±28秒(n＝4)。从K_ON(15×10⁶±0.5×10⁶M¹sec¹)和K_OFF(0.0059±0.0013sec^-1)值计算的K_d(57±7pM)，和用Microcal Origin软件测定的K_d(69±5pM)一致。

其它ShK类似物也在Kv1.3和Kv1.1通道上测试。含有D-磷酸酪氨酸(D-pTyr)的ShK(DS)对Kv1.3的选择性超过Kv1.1达35倍，但数量级比ShK(L5)低效。含有L-pTyr-一甲基的ShK(L6)显示出中度(11倍)Kv1.3特异性，而含有L-pTyr-二甲基或L-Tyr的ShK类似物对于Kv1.3的选择性不超过Kv1.1。含有苯基丙氨酸或其衍生物(体积、p电子密度和电荷不同)的类似物对Kv1.3的特异性中度超过Kv1.1。ShK(L5)对Kv1.3的特异性超过Kv1.1 100倍，大于ShK-F6CA(80倍)、ShK(D5)(35倍)、ShK-Dap²²(33倍)或任何其它的受试ShK类似物。

申请人还评价了ShK(L5)对一系列20个通道的特异性，这些数据总结于下面的表2中：

    通道    ShK(L5)的K_d[pM]    Kv1.1    Kv1.2    Kv1.3(克隆)    Kv1.3(天然)    Kv1.4    Kv1.5    Kv1.6    Kv1.7    Kv2.1    Kv3.1    Kv3.2    Kir2.1    Kv11.1(HERG)    Kca1.1    7,000±1,000    48,000±7,000    69±5    76±8    137,000±3,000    100,000无作用    18,000±3,000    100,000无作用    100,000无作用    100,000无作用    20,000±2,000    100,000无作用    100,000无作用    100,000无作用

 Kc_a2.1 Kc_a2.3 Kc_a3.1 Nav1.2 Nav1.4 肿胀激活的T细胞Cl^-通道 Cav1.2  100,000无作用  100,000无作用  115,000±5,000  100,000无作用  100,000无作用  100,000无作用  100,000无作用

从上面的表2数据可以体会，ShK(L5)阻滞T细胞的Kv1.3通道的K_d(76pM)与其对克隆通道(69pM)的Ka相等。它对于Kv1.3的选择性超过Kv1.1 100倍，超过Kv1.6 260倍，选择性超过Kv3.2 280倍，选择性超过Kv1.2 680倍，并且选择性超过其它所有受试通道＞1000倍。重要的是，其对Kv1.3选择性超过KCa3.1 1600倍，KCa3.1是调节人原初和T_CM细胞活化的钙激活K⁺通道(Wulff等，2003)。天然ShK的选择性低于ShK(L5)。ShK对Kv1.3(K_d＝10±1pM)的选择性超过Kv1.1(K_d28±6pM)2.8倍，选择性超过Kv1.6(200±20pM)20倍，选择性超过Kv3.2(K_d＝5,000±1,000pM)500倍，并且选择性超过Kv1.2(10±1nM)和KCa3.1(K_d＝28±3nM)＞1000倍。蝎毒素(Margatoxin)，一种来自蝎子毒液的肽，被奉为特异性Kv1.3抑制剂(Koo等，1997；Lin等，1993；Middleton等，2003)，但也不是特异的。它对于Kv1.3(110±12pM)的选择性超过Kv1.2(K_d＝520±1pM)5倍，选择性超过Kv1.1(10±1nM)9倍，并且选择性超过Kv1.6和Kv3.2(K_d＞100nM)＞1000倍。木犀草素(Luteolin)，在其是Kv1.3抑制剂的基础上(Lahey andRajadhyaksha，2004)，作为自身免疫性疾病营养剂(nutriceutical)出售(www.lutimax.com)(改变的域名)，它轻度阻滞Kv1.3(K_d＝65±5mM)并表现出对Kv1.1(K_d＝77±5mM)、Kv1.2(K_d＝63±4mM)或Kv1.5(K_d＝41±3mM)没有选择性。ShK(L5)对Kv1.3的强烈选择性连同其对该通道的皮摩尔级亲和力，使之成为潜在有吸引力的免疫抑制剂。

优先抑制人T_EM细胞增殖

参考图3A-3D，为了评价ShK(L5)的体外免疫抑制活性，申请人对其抑制人T_EM细胞系相对于含有原初和T_CM细胞混合物的人PBMC的抗CD3抗体刺激的增殖能力进行了比较。流式细胞术证实了所研究的两个种群的细胞表面表型。如图3A所见，T_EM细胞系是＞90％CCR7^-CD45RA，而图3B显示，PBMC含有65％CCR7⁺CD45RA⁺(原初)和18％CCR7⁺CD45RA^-(T_CM)细胞。图3C显示，ShK(L5)和ShK抑制T_EM细胞的增殖(IC₅₀＝～80pM)较PBMC(IC₅₀＝5nM，p＜0.05)有效60倍。以前曾报道(Ghanshani等，2000；Wulff等，2003)，PBMC的敏感性较低可以解释为，随着刺激，原初和T_CM细胞的KCa3.1通道快速上调。与这种解释一致，PBMC激活48小时至KCa3.1表达上调，然后静息12小时，用抗CD3抗体重激活，其能完全对抗ShK(L5)阻滞，如图3D上排显示。在第一轮刺激期间被ShK(L5)抑制的PBMC，当细胞被清洗、静息并用抗CD3抗体再次攻击时，表现出对ShK(L5)同样的抗性。这些结果确证了早期的研究表明的原初和T_CM细胞通过上调KCa3.1通道，来躲避Kv1.3抑制剂。因此，ShK(L5)优先并持久抑制T_EM细胞的增殖。

优先抑制大鼠T_EM细胞增殖

作为评价ShK(L5)治疗有效性的开端，我们检查了其抑制记忆T细胞系PAS的能力，PAS在大鼠中导致MS样疾病。作为对照，申请人用大鼠脾脏T细胞。为了证实两种细胞群的分化状态，我们评价了CD45RC(原初T细部标记)的表达(Bunce and BeII₁ 1997)。大鼠脾T细胞是76％CD45RC⁺(主要是原初细胞)，而PAS细胞为CD45RC^-，表明它们是记忆细胞，如图4A所示。为了确定是否PAS细胞在T_EM或T_CM状态，我们在激活前和激活后48小时，检查了Kv1.3表达。据预期，是T_EM而不是T_CM细胞在刺激后明显上调Kv1.3水平。参考图4B，膜片钳试验揭示，PAS细胞的MBP刺激后，Kv1.3电流幅度显著增加，与其是T_EM细胞一致。作为PAS细胞上Kv1.3通道数的独立测定，我们使用了ShK-F6CA，一种荧光标记的ShK类似物，以前曾报道其与Kv1.3特异性结合。流式细胞术测定的ShK-F6CA染色强度反映了细胞表面上表达的Kv1.3四聚体的数量。如图4C所见，随着PBS细胞的MBP激活，ShK-F6CA(10nM)染色强度增加，并且过多的未标记ShK(L5)(100nM)竞争性抑制ShK-F6CA染色。作为最后检验，申请人在已经被Kv1.3特异性抗体固定和染色的静息和MBP-刺激的PAS细胞上，进行共焦显微镜法。与图4B和4C的数据一致，静态PAS T细胞的Kv1.3染色强度为4.4±0.6，并且该值在抗原诱导激活后，上升至10.6±2.3(p＜0.005)(见图4D)，表明Kv1.3蛋白表达在激活之后增加。因此，MBP激活的PAS细胞是CD45RC^-Kv1.3^高T_EM细胞，而我们实验中所用的大鼠脾T细胞主要在原初状态。

ShK(L5)和ShK(IC₅₀＝约80pM)抑制MBP-引发的PAS细胞的增殖比抑制有丝分裂原诱导的大鼠脾T细胞的增殖有效～1000倍(见图4E，IC₅₀～100nM；p＜0.05)。这些结果确证了上述用人T细胞的发现。如图4G所见，ShK(L5)细胞抑制MBP诱导的PAS细胞IL2的产生(图4F)，并且外源性IL2部分逆转ShK(L5)的PAS细胞增殖抑制(图4G)。早期的研究用特异性较低的Kv1.3抑制剂在人、大鼠和微型猪的T细胞上，报道了相似的发现。总之，ShK(L5)是人和大鼠T_EM细胞的强有力且选择性的抑制剂，并因此通过优先靶定作用于自身免疫性病症的致病原，在自身免疫性疾病中具有治疗用途。

循环半衰期和稳定性

采用膜片钳生物分析确定，皮下注射后，ShK(L5)的循环水平是否足以抑制T_EM细胞。这些实验的结果示于图5A-5F。

检验ShK(L5)处理的大鼠和对照大鼠的血清样品对Kv1.3通道的阻滞活性。对照血清没有表现出可检测的阻滞活性，表明没有内源性通道阻滞剂。为了使分析标准化，大鼠血清加入已知量的ShK(L5)，这些样品在Kv1.3通道上检验。峰值(spiked)的血清样品以剂量依赖性模式阻滞Kv1.3电流(K_d77±9pM)，其模式与没有血清的ShK(L5)不能区别(图4A)。在处理动物中，ShK(L5)的水平通过与标准曲线比较测定。单次皮下注射200mg/kg，5分钟后血清中ShK(L5)即可检测到。峰水平(12nM)在30分钟内达到，然后该水平经420分钟降至约300pM的基线。ShK(L5)从血中清除可以用单指数拟合。循环半衰期估计为～50分钟。

由于200mg/kg(12nM)后的峰血清水平明显超过选择性阻滞Kv1.3通道和T_EM细胞功能的需要，我们检验了较低的剂量。单次注射10mg/kg后，ShK(L5)的峰血清浓度在30分钟内达到了~500pM(数据没有列出)，该浓度足以阻滞＞90％Kv1.3但是不影响KV1.1。该剂量(10mg/kg/天)重复每日给药导致稳态水平～300pM(注射后24小时测定，图5D)，其足以导致T_EM细胞抑制60-70％，而极少影响原初/T_CM细胞。“稳态”水平出乎意料地给出了估算的循环半衰期～50min，表明ShK(L5)在重复给药后“蓄积”。为了确定是否“储存”在皮肤或体内其它部位，在大鼠接受单次静脉内或皮下注射10mg/kg ShK(L5)后10小时，我们测定了ShK(L5)的血液水平。两种途径给药后，肽以同样的时间过程消除(图5E)，表明皮肤对于每天单次注射10mg/kg后达到300pM ShK(L5)稳态水平没有责任(图5D)，储存沉积在其它部位。

每天单次注射10mg/kg/天后，能成功达到300pM ShK(L5)的稳态水平，提示该肽可以在体内稳定。为了直接检查其稳定性，我们在37℃下，将ShK(L5)在大鼠血浆或含有2％大鼠血浆的PBS中孵育不同时间，然后测定Kv1.3阻滞活性。在两套峰值样品中(血浆和PBS)，我们观察到在大约5小时中，Kv1.3-阻滞活性减少了50％，推测是由于肽结合到试管的塑料表面，之后两天该水平保持稳定(图5F)。作为附加的稳定性实验，我们比较了ShK(L5)-处理的大鼠的血清中Kv1.3-对Kv1.1-阻滞活性。如果ShK(L5)在体内被修改，或者通过pTyr的去磷酸化或者是Aeea-pTyr侧链的切割，它将分别产生ShK(L4)和ShK，二者对Kv1.3的选择性均不超过Kv1.1。ShK(L5)-处理的动物的血清样品表现出与ShK(L5)相同的对Kv1.3的选择性超过Kv1.1，表明该肽没有经历上述的修改。总而言之，这些结果表明，单次皮下注射10mg/kg后，ShK(L5)在血浆中非常稳定，并达到了药理相应的血清浓度。

无毒性

申请人进行了数个体外和体内实验，确定ShK(L5)是否表现出任何毒性。这些研究的结果总结于附录A中。人类和大鼠淋巴细胞用超过Kv1.3半数阻滞浓度或抑制T_EM的IC₅₀(70-80pM)＞1200倍的ShK(L5)浓度(100nM)孵育48小时，表现出极低的细胞毒性。同样高的ShK(L5)浓度在实验株TA97A上的Ames实验为阴性，提示它不是诱变剂。两种体外实验都未能检测出任何明显的毒性。

药物诱导的Kv11.1(HERG)通道的阻滞对主要的心脏毒性和数种市售药物的停药起作用。ShK(L5)在100nM(＞1430倍Kv1.3的K_d)对Kv11.1通道没有作用，申请人选择的治疗方案(10mg/kg/天，稳态循环水平300pM)因此应当不导致心脏毒性。作为进一步的实验，申请人对清醒大鼠在第1天施用介质(PBS+2％大鼠血清)，随后在第2天给予ShK(L5)10mg/kg/天，进行了大鼠心率变异性分析。ShK(L5)在时域和频域两方面对心率或标准HRV(心率变异性)参数没有影响(Task forceof the European Society of Cardiology and the North American Society ofPacing Electrophysiology，1996)。

被急性毒性实验所鼓舞，申请人进行了亚慢性毒性研究，其中大鼠每天皮下注射给药ShK(L5)10mg/kg或介质，为期2周(每组n＝6)。ShK(L5)-处理的动物增重程度与接受介质的大鼠相同(附录A)。血液学和血液化学分析显示，ShK(L5)-和介质-处理的大鼠之间没有差异，流式细胞术分析揭示，胸腺细胞或淋巴细胞亚组的比例没有差异(附录A)。总之，这些研究提示ShK(L5)是安全的。

为了测定治疗安全指数，我们连续5天给药健康大鼠高出60倍剂量的ShK(L5)(600mg/kg/天)，没有观察到毒性临床征象，当健康大鼠接受单次注射ShK(L5)1000mg/kg时，没有发现毒性。当血脑屏障在EAE和MS中发生损害时，情况的乐观性降低了。患EAE的大鼠接受ShK(L5)10mg/kg/天，为期10天，没有显示毒性征象。反之，当大鼠出现EAE临床征象时，给药600mg/kg/天，为期5天，40％(5/12)的大鼠死于第五天(推断的LD₅₀＝750mg/kg/天)。由于单次注射200mg/kg后，血清中ShK(L5)的峰浓度(12nM)足以阻滞＞50％的Kv1.1通道，在给药ShK(L5)600mg/kg/天的EAE大鼠中观察到的毒性，可能是由于足量的ShK(L5)进入大脑，阻滞了Kv1.1。因而，在血脑屏障没有受到损害的情况下(见于不影响中枢神经系统(CNS)的自身免疫病)，ShK(L5)的有效治疗安全指数足以超过100，而当血脑屏障被破坏时，治疗安全指数为75。

预防DTH和急性过继EAE

参考图6A-6C，评价了在两种动物模型中，ShK(L5)的体内免疫抑制活性。申请人测试了其预防和治疗由MBP-激活的PAS T_EM细胞转移到Lewis大鼠中诱发的急性EAE的能力，以及抑制由T_EM细胞介导的DTH反应的能力。PAS细胞用MBP在体外激活48小时，然后过继转移(6-8×10⁶活细胞)到Lewis大鼠内。然后，为了预防试验，大鼠皮下注射盐水(对照)或ShK(L5)(10μg/kg/天)，为期5天。在第一个预防试验中，对照大鼠出现了轻度EAE(平均最大临床分值2.0±1.2)，平均发作于5.6±0.6天(没有显示)。ShK(L5)降低了疾病的严重度(平均最大临床分值0.7±0.6，p＜0.05)。在第二个预防试验中，对照大鼠出现了更严重的EAE(平均最大临床分值3.2±0.4)，平均发作于4.8±0.4天(图6A)。ShK(L5)明显降低了疾病的严重度(平均最大临床分值0.6±0.4，p＜0.007)，但没有显著推迟发病(5.5±0.7天；p＝0.07)。这些研究中没有注意到毒性征象。

在治疗试验中(图6B)，大鼠注射MBP-激活的PAS细胞，当其开始出现EAE临床征象时(尾巴不举，弓背姿势和经24小时失重6％或以上)，给药盐水或ShK(L5)10μg/kg/天，并持续治疗3天。EAE临床征象在对照组于第6天达到顶峰(分值＝3.9±0.7)，在治疗组为第7天(分值1.9±0.9；p＜0.05)。

作为独立评价ShK(L5)的体内免疫抑制活性，申请人也检查了其抑制主要由皮肤归巢(homing)T_EM细胞介导的DTH反应的有效性。用卵清蛋白和佐剂免疫的Lewis大鼠，在7天后，以卵清蛋白在一只耳朵和盐水在另一只耳朵攻击。然后大鼠接受注射盐水(对照)或ShK(L5)(10μg/kg/天)，测定耳朵厚度作为DTH的指标。所有对照大鼠在卵清蛋白攻击后24和48小时出现耳朵肿胀，而DTH反应在ShK(L5)-处理的动物中显著较轻(图6C)。因而，ShK(L5)抑制T_EM介导的DTH反应，并且预防和改善髓鞘激活的T_EM细胞的严重过继EAE。

Kv1.3在抗原提呈期间群集在IS上，但K⁺通过Kv1.3的外流并非IS形成或稳定性所需的

参考图7A-7G，ShK(L5)，一种高选择性的Kv1.3抑制剂(21)，在GAD65-特异性T_EM细胞上阻滞Kv1.3电流，K_d为72±3pM。我们用ShK(L5)作为药理探针，去限定需要Kv1.3功能的T_EM细胞激活的那些步骤。生化研究已经显示，Kv1.3和Kvb2属于一个信号复合体，所述复合体包括SAP97(突触相关蛋白-97)、ZIP(PKC-ζ-相互作用蛋白，p56^lck-相关的p62蛋白，A170)、p56^lck和CD4(图7B)。该复合体在人类T_EM细胞上的存在被申请人的显示Kv1.3、Kvb2、SAP97、ZIP和p56^lck与CD4共帽(co-capping)的结果所支持。另外，FRET(荧光能量转移)研究显示，在Kv1.3-转染的人类T细胞中，Kv1.3紧邻CD3，并且该通道优先位于Kv1.3-转染的人类细胞毒T细胞和其靶标之间的接触点上。由于CD4运输到IS，即T细胞和抗原提呈细胞(APC)之间的接触区上，有可能信号复合体中的Kv1.3和其它蛋白也在抗原提呈期间位于IS上。为了测试这一理念，T1DM患者的GAD65-特异性Kv1.3^高T_EM克隆与HLA匹配的APC孵育，所述APC已负荷GAD65557I肽，并以DAPI染色，以助显像。20分钟后，APC-T_EM共轭体对信号复合体中的蛋白免疫染色。CD4与Kv1.3、Kvb2、SAP97、ZIP和p56^lck共定位于IS上。没有APC-T_EM接触时，CD4和Kv1.3遍布细胞。此外，当GAD65-特异性T_EM细胞暴露于负荷MBP(不相关抗原)的APC时，CD4和Kv1.3不能定位在接触点上，证实了IS-丛集是抗原特异的。因而在GAD65-特异性T_EM细胞中，含有Kv1.3的信号复合体连同CD4在抗原提呈期间运输到IS上，提示Kv1.3是在T_EM细胞中转导信号的工具的完整组分。基于这些研究，ShK(L5)在阻滞大约99％Kv1.3通道的浓度(100nM)不能阻止IS-丛集，并且不会破坏只要是已形成的IS，表明K⁺通过Kv1.3通道的外流不是IS形成或稳定所必需的。

抑制人T_EM细胞

参考图8A-8E，ShK(L5)在T_EM细胞中抑制钙信号，是T细胞激活中一个早期和根本的步骤。T1DM患者的GAD65-特异性T_EM克隆负载钙指示剂染料Fluo3，在培养基中单独或与浓度增加的ShK(L5)预培养，在加入活化的抗CD3抗体和交联第二抗体之前和之后，通过流式细胞术显像。峰钙上升出现在刺激后242+35秒，并被ShK(L5)所阻滞，IC₅₀为～200pM(图8A)。ShK(L5)在抑制T1DM和RA患者的自身反应性T_EM细胞的[³H]-胸苷掺入上，较之对这些患者的原初/Tc_M细胞有效10倍(图8B，左)。在第二组实验中(图8B，右)，RA-SF和RA-PB T细胞用抗CD3抗体激活48小时，以分别产生“T_EM-效应细胞”和“原初/T_CM效应细胞”。细胞在培养基中静息过夜，在有或没有ShK(L5)的条件下，用抗CD3抗体再次刺激另外48小时，并测定[³H]-胸苷掺入。RA-SF-T_EM-效应细胞保持其对ShK(L5)抑制的敏感性，而RA-PB-原初/T_CM效应细胞则对抗Kv1.3阻滞(图8B，右)，最可能是由于它们上调了钙激活的KCa3.1/IKCa1通道，该通道在增强的钙进入中，取代了Kv1.3。ShK(L5)深度抑制T1DM和RA患者的T_EM细胞产生白介素2和干扰素-g(IFN-g)，而较少影响这些患者的原初/Tc_M细胞产生IL2和IFN-g(图8C)。T_EM细胞和原初/Tc_M细胞二者的肿瘤坏死因子-a和白介素4的产生，对ShK(L5)的敏感性较低(图8C)。

验证效应记忆T细胞导致的延迟型过敏(DTH)的大鼠模型

如图9所示，大鼠用佐剂中的卵清蛋白(OVA)免疫。它们在7天后，一侧耳朵用OVA另一只耳朵用盐水攻击。24h后测定耳朵肿胀作为延迟型过敏(DTH)的指征。图9显示的FACS柱状图表明，用OVA攻击的耳朵中的T细胞是CD45RC-阴性记忆细胞，而同样大鼠的血液和脾脏中的T细胞大多是原初T细胞。

Shk(L5)在效应记忆T细胞导致的延迟型过敏(DTH)的大鼠模型中的处理方案

如图10所示，大鼠接受皮下注射ShK(L5)10μg/kg/天，或者在第0天至第7天(致敏期期间)，以防止原初细胞分化为效应记忆T_EM细胞，或者在对耳朵用卵清蛋白攻击以预防T_EM细胞的功能的效应期。

hk(L5)在大鼠体内特异抑制效应记忆反应，而不损害原初和中枢记忆T细胞或B细胞的功能

如图11所示，对照大鼠出现耳朵肿胀，即阳性DTH反应。ShK(L5)当在致敏期给药时，并不有效抑制DTH，表明它不抑制原初和中枢记忆T细胞分化为效应型记忆细胞。ShK(L5)当在效应期给药时，抑制DTH，表明其或者阻止效应记忆T细胞到达耳朵的能力，和/或抑制效应记忆T细胞的激活。第一种可能性被排除，因为在ShK(L5)-处理的大鼠的耳朵中，T细胞数量与给予介质的大鼠的耳朵相同。ShK(L5)在耳朵中抑制效应记忆T细胞的激活，因为这些T细胞是Kv1.3-阴性的，而在介质处理的动物耳朵中的记忆T细胞是Kv1.3阳性的。这些动物中IgM和IgG B细胞的应答也不受影响。

Kv1.3在对T1DM或MS患者和健康对照的GAD65/555-567、胰岛素/9-23-和髓鞘抗原有特异性的T细胞中的表达

图12A显示，新发作的1型糖尿病患者、健康对照和多发性硬化症患者的抗原特异性T细胞上的Kv1.3电流(上)和通道数量/细胞(下)。每个数据典代表第三次抗原刺激后48小时测定的单一供体的2-4个T细胞系的20-50个细胞的均值±标准差(mean±SEM)。由于T1DM患者和对照的血中，对胰岛素和GAD65有特异性的T细胞的频数低，我们用半有限稀释建系法(split-well method)，通过产生短期自身抗原特异性CD4⁺T细胞系，扩增这些种群。作为对照，我们建立了对不相关自身抗原髓鞘碱性蛋白(MBP)特异的T细胞系，MBP涉及MS但不涉及T1DM。随着第三次抗原刺激，Kv1.3电流通过全细胞膜片钳在膜电容超过4pF的活化细胞(细胞直径≥11μm)中测定。代表性的Kv1.3电流和Kv1.3通道数量/T细胞显示在图12A中。电流表现出Kv1.3的生物物理和药理特性的特征。对新发作T1DM的患者的胰岛素(9-23)或GAD65(555-567)有特异性的T细胞，表现出Kv1.3大电流，并表达数量很高的Kv1.3通道，而这些患者疾病不相关的MBP特异性T细胞是Kv1.3^低(p＝0.001)。为了比较，我们绘制了我们已发表的MS患者的Kv1.3数据，在这些患者中观察到了相反的模式。在MS患者中，对MBP或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(肽35-55)或蛋白脂质蛋白(肽139-151)有特异性的T细胞是Kv1.3^高，而胰岛素-和GAD65-特异性T细胞是Kv1.3^低(p＝0.0001)。不考虑特异性，从健康对照中分离的自身反应性T细胞是Kv1.3^低。在一名既有MS又有T1DM的个体中，对所有三种自身抗原特异的T细胞是Kv1.3^高。长期T1DM患者的GAD65-特异性和胰岛素-特异性T细胞是Kv1.3^高，反映了自身反应性T_EM细胞的耐久，而Kv1.3^低模式发现于非自身免疫性2型DM患者的GAD65-和胰岛素-特异性T细胞中。如图12B所示，Kv1.3染色(上)和个体细胞的荧光强度(下)。申请人通过对Kv1.3的免疫染色，证实了膜片钳的数据。T1DM患者的胰岛素-和GAD65-特异性T细胞以及MS患者的MBP-特异性T细胞染色明亮，而对不相关自身抗原有特异性的细胞染色暗淡。图12C显示CCR7表达。流式细胞术揭示，Kv1.3^高T细胞是CCR7^-TEM细胞，而Kv1.3^低细胞是CCR7⁺原初或T_CM细胞。图12D显示，在合并患有T1DM和MS的患者、以及患有T1DM或2型DM的患者分别超过5年和2年的患者中，自身反应T细胞中Kv1.3数量/细胞。图12E显示，在新发作T1DM的患者的CD4⁺GAD65-四聚体⁺T细胞中，Kv1.3的数量。作为进一步对照，我们用含有GAD65 557I肽的荧光MHC II类四聚体，从患有新发作T1DM的DR-0401-阳性患者中，分离GAD65-特异性CD4⁺T细胞。四聚体分类的GAD65-活化T细胞表现出与T1DM患者的GAD65-特异性T细胞系观察到的相同的Kv1.3^高模式。总之，在T1DM和MS中的疾病相关、自身抗原活化T细胞是Kv1.3^高CCR7^-T_EM-效应细胞，而这些患者中的疾病不相关自身反应细胞是Kv1.3^低CCR7⁺原初/T_CM细胞。

Kv1.3在风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)和骨关节炎(Osteoarthritis)中的表达

在RA中，疾病相关的T细胞可以从染病的关节分离。申请人对7名RA患者用抗CD3抗体刺激后48小时的滑液(SF)的T细胞进行了膜片钳。如图13A所示，作为对照，申请人分析了患有变性的、非自身免疫骨关节炎(OA)的7名患者的SF-T细胞(其用同样的方案激活。RA-SF T细胞是Kv1.3^高而OA-SF T细胞为Kv1.3^低(p＜0.0001)。因为自身反应性Kv1.3^高T_EM^-细胞在血中少见，申请人在RA患者外周血(PB)的抗-CD3-活化的T细胞中，发现Kv1.3^低模式(p＜0.0001)。对Kv1.3和其相联的Kvβ2亚单位的免疫染色确证了膜片钳数据。图13B显示了Kv1.3(图中所见的浅灰)和Kvβ2(图中所见的深灰)染色的共焦图像。RA-SF T细胞对Kv1.3和Kvβ2均染色明亮，而OA-SF和RA-PB T细胞表现出弱染色。图13C图示了CCR7的表达。流式细胞术确证了Kv1.3^高RA-SF T细胞是CCR7^-T_EM细胞，而Kv1.3^低OA-SF和RA-PB T细胞是CCR7⁺原初/T_CM细胞。图13D(上)显示了用抗CD3或抗Kv1.3抗体染色和用苏木精/伊红反染色的RA和OA患者滑膜的显微照片(40X)。作为进一步实验，我们为CD3、Kv1.3和CCR7，免疫染色了5名RA和5名OA患者石蜡包埋的滑膜组织(ST)。我们之前已经表明，我们的染色方法没有在原初/Tc_M细胞中检测到Kv1.3，因为它们的Kv1.3通道数量低。在RA-ST中，可以见到占优势的CD3⁺Kv1.3⁺CCR7^-T_EM细胞，而CD3⁺细胞在OA-滑膜中稀少，并且主要是Kv1.3^-CCR7⁺原初/Tc_M细胞。图S2A中，CD3⁺、Kv1.3⁺和CCR7⁺细胞渗透的程度通过等级系统评价。CD3⁺-炎性指数：RA＝3.2±0.1；OA＝1.1±0.2(p＜0.01)；Kv1.3⁺-炎性指数：RA＝2.8±0.3；OA＝0.6±0.3(p＜0.01)。因此，在三种不同的自身免疫病症中，我们的结果与疾病相关的自身免疫T细胞是Kv1.3^高CCR7^-T_EM效应细胞相一致。

应当体会，本发明在此参考发明的某些实施例或实施方案进行描述，但是对这些实施例或实施方案可以进行各种各样的添加、删除、改变或修改而不背离希求的本发明的精神和范围。例如，一个实施方案或实施例的任何元素或特征可以与另一个实施方案或实施例合并或合用，除非这样做使得该实施方案或实施例不再适用于其目标应用。还有，当方法或程序的步骤以特定顺序列举或证实，这些步骤的顺序可以改变，除非另有指明或者除非在步骤的顺序中的这种改变使得发明不可取得专利或不适用于其目标应用。所有合理的添加、删除、修改和改变被认为与所述的实施例或实施方案相当，并且要包括在下列权利要求的范围内。

附录A：ShK(L5)的毒性研究

体外实验    100nM ShK(L5)细胞毒性(％死细胞)人PRMCPAST细胞Jurkat细胞Burkitt淋巴瘤RPMI8226骨髓瘤    7.5±4.3    8.1±0.8    5.5±3.3    3.1±0.9    6.5±2.1Ames实验    阴性

急性体内实验    盐水    ShK(L5)1.0μg/kg心电图*心率SDNNCV％SDANN_5minrMSSDHF(n.u.)HF(％)LF(n.u.)LF(％)LF/HF    302±13    13.3±3.0    6.7±1.4    5.0±2.0    6.8±2.2    71±21    50±8    68±4    50±8    1.1±0.4    311±20    17.8±4.4    9.2±2.2    6.9±2.3    9.8±3.5    79±37    53±10    64±10    47±10    1.3±0.7亚慢性体内实验    盐水   ShK(L5)10μg/kg/天为期2周增重(％)    7.2±1.8   6.2±1.7全血计数血细胞比容(％)血红蛋白(g/dl)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/dl)白细胞总数(×10³mm^-3)红细胞总数(×10⁶mm^-3)血小板总数(×10³mm^-3)    40.3±1.4    15.3±0.5    48.5±0.2    18.5±0.8    38.0±1.8    7.1±2.1    8.3±0.3    6.56±214   39.0±4.9   15.0±1.5   48.3±0.3   18.5±0.6   38.4±1.3   7.1±2.5   8.1±1.0   606±106血生化碱性磷酸酶(U/T)葡萄糖(mg/dl)血尿氮(mg/dl)肌苷(mg/dl)白蛋白(g/dl)    170±26    139±21    17.1±2.6    0.6±0    5.0±0.3    150±18    150±18    15.0±1.7    0.6±0.1    4.5±0.4胸腺细胞种群(％)CD4⁺CD8^-CD4⁺CD8⁺CD4⁺CD8^-CD4^-CD8⁺CD3⁺    3.6±1.1    77.8±6.1    8.5±1.7    10.0±3.3    89.5±1.6    4.3±0.7    76.8±4.1    11.2±2.0    7.6±1.3    93.2±3.5脾细胞种群(％)CD3⁺CD3⁺CD45RC⁺CD3⁺CD45RC^-CD3⁺CD4⁺CD3⁺CD8⁺lgM⁺    72.4±4.4    35.6±2.6    23.6±2.3    62.7±0.1    26.9±0.1    38.8±1.5    65.4±0.1    39.8±1.1    26.5±1.3    66.6±1.2    25.0±0.2    33.3±0.3

数据表达为均值±SD。*用t-检验进行检验，所有参数p＜0.05；SDNN：所有正常至正常RR间期的标准偏差；CV％：100×SDNN/平均RR间期；SDAMM_5min：每个5分钟期间，正常RR间期均值的标准偏差；rMSSD：递差的平均根方；HF(n.u.)：标准化单位中的高频(0.75-2.5Hz)能量；LF(n.u.)：标准化单位中的低频(0.2-0.75Hz)能量。

附录B

L-对-膦酰基苯基丙氨酸(PPA)

L-对-膦酰基甲酮苯基丙氨酸(PM(＝O)PA)

(L-对-酮-膦酰基苯基丙氨酸(KPP)

L-对-膦酰基二氟甲基苯基丙氨酸(PM(f2)PA)

(L-对-二氟甲基膦酰基苯基丙氨酸)

0026-896X/05/6704-1369-1381$20.00

MOLECULAR PHARMACOLOGY                                                                Vol.67，No.4

Copyright2005 The American Society for Pharmacology and Exparimental Therapeutics    8193/1198130

Mol Pharmacol 67：1369-1381，2005                                               Printed in U.S.A.

                                                                                    

Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide

Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune

Diseases

Christine Beeton，Michael W.Pennington，Heike Wulff，Satendra Singh，Daniel Nugent，George Crossley，llya Khaytin，Peter A.Calabresi，Chao-Yin Chen，George A.Gutman，and K.George Chandy

Department of Physiology and Biophysics，University of California lrvine，lrvine，California(C.B.，G.A.G.，K.G.C.)；BachemBioscience Inc.，King of Prussia，Pennsyivania(M.W.P.，S.S.，D.N.，G.C.，I.K.)；Department of Medical Pharmacology andToxicology，University of California，Davis，California(H.W.，C.Y.C.)；and Department of Pathology，Johns Hopkins Hospital，Baltimore，Maryland(P.A.C.)

Received October 13，2004；accepted January 21，2005

                                                                               

用Kv1.3通道的选择性肽抑制剂靶定效应记忆T细胞治疗自身免疫疾病

摘要

电压门控Ky1.3 K⁺通道是对在自身免疫性疾病中发挥主要作用的自身反应效应记忆T(T_EM)细胞进行免疫调节的新靶标。我们叙述了来自海葵Stichodactyla helianthus的新肽ShK(L5)的特征，其含有通过9个原子的亲水性接头与ShK肽的N端相连的L-磷酸酪氨酸。ShK(L5)是高度特异性的Kv1.3阻滞剂，表现出对Kv1.3(K_d＝69pM)的选择性超过Kv1.1 100倍，并且选择性超过所有其它测试过的通道250倍。ShK(L5)抑制人和大鼠T_EM细胞的增殖，并在皮摩尔(picomolar)的浓度就抑制白介素-2产生。原初和中枢记忆人T细胞开始对ShK(L5)的敏感性低于T_EM细胞60倍，然后在激活期间，通过上调钙激活的K_Ca3.1通道，变得对该肽有抗性。ShK(L5)在体外的哺乳动物细胞系上没有表现出细胞毒性，并且在Ames实验中为阴性。其在血浆中稳定，通过每日一次皮下注射(10μg/kg)给药达到“稳态”血水平～300pM。通过持续EKG监测，这种给药方案不会导致心脏毒性，并且在治疗2周后，不改变临床化学和血液学参数。ShK(L5)预防和治疗实验性自身免疫脑心肌炎，并在大鼠中抑制延迟型过敏。ShK(L5)可能证实其对治疗自身免疫病症有用。

缩写：MS，多发性硬化症；T_EM，效应型记忆T细胞亚群；T_CM，中枢记忆T细胞亚群；EAE，实验性自身免疫脑脊髓炎；DTH，延迟型超敏；K_Ca3.1，中电导Ca²⁺激活的K⁺通道；K_v，电压门控K⁺通道；ShK，Stichodactyla helianthus毒素；Fmoc，9-芴基甲氧羰基；Pmp，对膦酰基甲基-苯基丙氨酸；Aeea，氨基-乙基-氧-乙氧基-乙酸；HEK，人胚胎肾脏；HERG，人醚-a-go-go-相关基因；PBMC，外周血单核细胞；IL2，白介素2；PBS，磷酸盐缓冲的盐水；MBP，髓鞘碱性蛋白；F6CA，荧光素-6-羧基；L-pTyr，L-磷酸酪氨酸；CP-339818，1-苄基-4-戊基亚氨基-1，4-二氢喹啉；UK-78282，4-[二苯基甲氧基]甲基]-1-[3-(4-甲氧基苯基)丙基]-哌啶；WIN-17317，1-苄基-7-氯-4-正-丙基亚氨基-1，4-盐酸二氢喹啉。

自身免疫性疾病折磨着世界上数以百万计的人，并且可具有共同的发病机制。发病机理可涉及睡眠的疾病特异性自身反应性T细胞-例如患有多发性硬化症(MS)的患者中的髓鞘特异T细胞-通过分子模拟或其它不确定的机制的“苏醒”。一旦苏醒，作为自身抗原反复刺激的结果，自身反应性T细胞可以从原初态分化为持续活化的记忆T细胞，并通过迅速迁移进入组织、分泌炎性细胞因子和展示即刻效应功能，促成炎性伤害(Sallusto等，1999)。数条证据线索支持这种设计。首先，MS患者的大部分髓鞘特异性T细胞是共刺激-独立激活的效应型记忆T(T_EM)细胞(Lovett-Racke等，1998；Scholz等，1998；Markovic-Plese等，2001；Wulff等，2003)。第二，将髓鞘特异性T_EM细胞移入未实验过的大鼠接受体，诱导实验性自身免疫自身免疫脑脊髓炎(EAE)，这是MS的模型(Beeton等，2001b)。第三，对疾病相关的自身抗原谷氨酸脱羧酶65具有特异性的1型糖尿病患者的T细胞，是持续活化的记忆细胞(Viglietta等，2002)。最后，在风湿性关节炎患者滑膜中和牛皮癣患者皮肤病灶中的T细胞，大部分为T_EM细胞，是导致延迟型超敏(DTH)的T细胞(Ezawa等，997；Friedrich等，2000；Soler等，2003)。记忆B细胞，特别是那些属于类别转换的CD27⁺IgD^-亚群，也可能促成很多自身免疫疾病的发病(Iglesias等，2001；O′Connor等，2001；Corcione等，2004)。靶定T_EM和类别转换的记忆B细胞而不损害其它淋巴细胞亚群活性的治疗，将因此靶定自身免疫疾病患者的致病细胞而不损害急性免疫反应。

对T_EM和类别转换的记忆B细胞进行免疫调节的一个令人兴奋的新治疗靶标是电压门控Kv1.3 K⁺通道。T_EM细胞依靠活化上调Kv1.3，其抗原驱动的增殖对于Kv1.3阻滞剂极为敏感(Wulff等，2003)。原初和T_CM细胞则相反，开始对于Kv1.3阻滞剂的敏感度低得多，并通过上调钙激活的K⁺通道K_Ca3.1，变得对抗Kv1.3阻滞(Wulff等，2003；Chandy等，2004)。B细胞，像T细胞，将它们的钾通道依赖性从K_Ca3.1改变成Kv1.3，因为它们从原初细胞分化为类别转换的CD27⁺IgD^-记忆B细胞(Wulff等，2004)。Kv1.3阻滞剂抑制这些细胞的增殖而不影响原初细胞和CD27⁺IgD⁺记忆B细胞。通过用Kv1.3阻滞剂靶定T_EM细胞和类别转换的记忆B细胞，可能改善自身免疫疾病而不损害大多数免疫反应。Kv1.3的功能限制性组织分布，以及在体内，Kv1.3阻滞改善EAE、牙周病中的骨重吸收和动物模型中的DTH，而不导致明显的副作用的事实，提高了Kv1.3作为治疗靶标的吸引力(Koo等，1997；Beeton等，2001b；Valverde等，2004)。尽管Kv1.3阻滞剂会抑制所有激活的T_EM(例如，对疫苗抗原特异的T_EM细胞)和类别转换的记忆B细胞，但是以Kv1.3为基础的治疗将是对广泛而无区别地抑制整个免疫系统的现有治疗的明显改进。Kv1.3阻滞剂的另一个优势在于它们是可逆的。因此，当需要时，可以递增Kv1.3阻滞剂的治疗作用，在面临感染时可以停止，不像化疗药或靶向单克隆抗体治疗，需要数月才能消退。

尽管有广泛的努力，但Kv1.3通道选择性的和有效的抑制剂尚未被开发(Candy等，2004)。最有效的Kv1.3抑制剂是来自加勒比海的海葵Stichodactyla helianthus的肽ShK(Pennington等，1995)。ShK在皮摩尔浓度就阻滞Kv1.3(K_d，～10pM)，抑制T_EM细胞增殖(Wulff等，2003)，和改善EAE(Beeton等，2001b)。ShK的潜在缺陷是其对神经元Kv1.1通道的亲和性(K_d，28pM)(Kalman等，1998)。虽然在使用ShK的EAE试验中没有发现副作用(Beeton等，2001b)，但是高浓度的ShK进入大脑能导致不想要的神经毒性。其它抑制剂包括correolide，trans-PAC，CP-339818，UK-78282，Psora-4，蝎毒素和木犀草素(Chandy等，2004)。

我们开发了ShK(L5)，一种合成的ShK类似物，其以皮摩尔亲和力阻滞Kv1.3，并表现出对Kv1.3的选择性超出Kv1.1和其它通道100倍。选择性是通过将负电荷的L-磷酸酪氨酸(L-pTyr)通过亲水性接头连接到ShK-Arg¹上实现。ShK(L5)在体外以皮摩尔浓度抑制T_EM细胞增殖，而不损害原初和T_CM细胞的功能。在体内的概念证明(proof-of-concept)研究中，ShK(L5)能改善将髓鞘特异性T_EM细胞移入未实验过的大鼠接受体内导致的EAE，并抑制同样由T_EM细胞导致的DTH反应。ShK(L5)可以用于治疗多发性硬化症以及其它T和B细胞介导的自身免疫性疾病。

材料和方法

ShK类似物的合成  对于moc-Pmp类似物，乙基保护基团通过用含水6 N HCl在回流中处理Fmoc-Pmp-(乙集)₂-OH被去除。16小时后，沉淀出白色固体，然后用过滤分离，并用水洗，直至洗液成为中性(Hammerschmidt和Han-bauer，2000)。从Pmp-瞵酸酯部分除去乙基保护基团导致Pmp、Pmp-Et或Pmp(乙基)₂。所有的Fmoc-氨基酸衍生物均来自Bachem AG(Bubendorf，瑞士)，除了Fmoc-D-TyrPO₃(苄基)-OH来自Nova Biochem(San Diego，CA)，以及Fmoc-Pmp(乙基)-OH和Fmoc-D-Pmp(乙基)₂-OH来自Chem Impex(Wood Dale，IL)。固相装配开始用Fmoc-Cys(Trt)-2-氯三苯甲游基树脂，以最小化C-端Cys残基的可能的外消旋作用(Fujiwara等，1994)。自动装配在ABI-431A肽合成器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行。在ShK装配后，Fmoc-Aeea-OH连接到N-端。树脂分成9个等份。任一Fmoc-Tyr(PO₃Bzl)-OH、Fmoc-D-Tyr(PO₃Bzl)-OH、Fmoc-Tyr(PO₃Me₂)-OH，Fmoc-Pmp-OH、Fmoc-D-Pmp-OH、Fmoc-Pmp(乙基)-OH、Fmoc-Pmp(Et)₂-OH、Fmoc-Tyr(正丁基)-OH或Fmoc-对-氨基-L-苯基丙氨酸(正丁氧基-羰基)-OH，用二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，连接到一份树脂等份上。用含5％三异丙基硅烷的试剂K(King等，1990)，在室温下切割和脱保护去封闭的肽树脂2小时。通过在15分钟时，将固体NH₄I加入到切割混合物(cocktail)中还原Met(O)(Nicolas等，1995)。对于含Tyr(PO₃Me₂)-OH的肽，在4℃下采用含茴香硫醚作为俘获剂的TFA(三氟乙酸)中含有1M三甲代甲硅烷基溴化物的切割混合物18小时(Tian等，1993)。用这种方法，通常是不完全除去甲基保护基，并且两个种类[(对-磷酸酪氨酸)和Tyr(PO₃HMe)]可以被RP-HPLC轻易提纯。含有Tyr(PO₄Me₂)的类似物借助于K试剂切割而被割裂，保持二个甲基完整。在每种情况下，过滤切割混合物，并将粗制肽沉淀到冰冷的二乙基醚中。收集沉淀，从200mg树脂中产生大约75mg肽。粗制品溶解在20ml 50％含水AcOH中，并稀释到0.751 H₂O中。溶液的pH用NH₄OH调节到8.2，加入谷胱甘肽(2mM∶1mM)(还原：氧化)使其折叠过夜。按照以前的记载(Pennington等，1995，1996a，b)，所有的类似物采用RP-HPLC，用三氟乙酸缓冲的水对乙腈的线性梯度提纯。汇集提纯的级分并冻干，产生各种肽的三氟乙酸盐。肽的纯度超过95％。在生物分析前，每个样品通过反相高压液相色谱法、氨基酸分析、和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱进行证实，并调整计算肽含量。ShK和蝎毒素来自BachemBiosciences(King of Prusia，PA)。木犀草素购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。

离子通道  对本文描述的离子通道，我们采用了IUPHAR命名法(Gutman等，2003)。稳定表达mKv1.1、rKv1.2、mKv1.3、hKv1.5和mKv3.1的细胞之前已有记载(Grissmer等，1994)。稳定表达其它哺乳动物离子通道的细胞系获赠自几个来源：mKv1.7的CHL细胞和hKCa.2.3的COS-7细胞，来自Aurora Biosciences Corp.(San Diego，CA)；hKv 1.4的LTK细胞来自Michael Tamkun(University of Colorado，Boulder，CO)；hKv2.1的HEK293细胞来自Jim Trimmer(University of California，Davis，CA)；Kv1 1.1(HERG)的HEK293细胞来自Craig January(University of Wisconsin，Madison，WI)；表达hKCa1.1、rKCa.2.1或hKCa.3.1的HEK293细胞来自Khaled Houamed(University of Chicago，Chicago，IL)；hNav 1.4的HEK-293细胞来自Frank Lehmann-Horn(University of Ulm，德国)，以及Cav1.2的HEK-293细胞来自FranzHofmann(Munich，德国)。RBL-2H3(表达Kir2.1)和N1E-115神经母细胞瘤细胞(表达Nav1.2)得自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(Manassas，VA)。hKv1.6和rKv3.2(均在pcDNA3中)得自Protinac GmbH(Hamburg，Germany)，并根据制造商的说明书，用Fugene-6(Roche，Mannheim，德国)瞬时转染到COS-7细胞中。

淋巴细胞和细胞系  用Histopaque-1077梯度(Sigma-Aldrich)，从Lewis大鼠分离脾细胞以及从健康志愿者的血液分离人外周血单核细胞(PBMCs)。根据以前的记载产生人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或破伤风类毒素特异性T_EM细胞(Wulff等，2003)。致脑炎CD4⁺Lewis大鼠T细胞系PAS(Beraud等，1993)获赠自Evelyne Beraud(University ofMarseille，Marseille，法国)，RPMI 8226浆细胞瘤获赠自ShastriGollapudi(University of California，Irvine，CA)。Jurkat和Burkitt细胞购自美国典型培养物保藏中心。

电生理分析  在膜片钳技术的全细胞配置上进行实验。Kv电流按照以前的记述(Zhou等，1998；Wulff等，2000；Bardien-Kruger等，2002；Kolski-Andreaco等，2004；Vennekamp等，2004)，以200ms的去极化脉冲，钳制电压从-80至40mV进行激发。测试每个通道阻滞剂的多个浓度。各浓度在40mV时测量的峰电流的降低，用于产生量效曲线，K_d和Hill系数用Origin软件(OriginLab Corp.，Northampton，MA)，按照以前的记载(Zhou等，1998；Wulff等，2000；Bardien-Kruger等，2002；Kolski-Andreaco等，2004；Vennekamp等，2004)进行测定。K_d还从对通道阻滞的开(T_on)和关(T_off)比率来测定。在Kv1.3的峰电流幅度稳定后，ShK(L5)70pM灌注到细胞上，峰电流值绘制为时间的函数，拟合为单指数函数，测定T_on。达到阻滞平衡后，灌注转换回没有阻滞剂的浴溶液。按照上述方法绘制峰电流，测定T_off。K_on、K_off和K_d的计算是推定在ShK(L5)和Kv1.3之间只有简单的双分子反应：K_on＝1-T_on×K_off/[T_on×ShK(L5)浓度]；K_off＝1/T_off；K_d＝K_off/K_on(Peter等，2001)。对于Kv1 1.1通道，在20和-50mV(尾电流)两处测定电流阻滞。对于K_Ca通道、K_ir2.1和肿胀激活的氯电流，我们通过ShK类似物测量斜率电导(slope conductance)，并测量Na⁺和Ca²⁺，电流的最小电流降低。

为流式细胞术和荧光显微术染色  人PBMC细胞、大鼠脾细胞和PAS T细胞的T细胞表型通过流式细胞术测定。PBMC用与Cy-chrome结合的抗CD3抗体(BD and Pharmingen，San Diego，CA)、与藻红蛋白结合的抗CD45RA抗体(BD Pharmingen)、以及与荧光素异硫氰酸盐结合的抗CCR7抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)三重染色。大鼠脾细胞和PAS-染色的T细胞，用与Cy-chrome结合的抗CD3抗体和与荧光素异硫氰酸盐结合的抗CD45RC抗体(BD Pharmingen)双重染色。染色的细胞用FACScan(BD Biosciences，San Jose，CA)分析。

采用两种方式评价PAS T细胞中的Kv1.3蛋白表达。首先，PAS细胞用ShK-F6CA(10nM；Bachem Bioscience Inc.)，一种荧光素标签的ShK类似物染色，并以流式细胞术按照以前的记载(Beeton等，2003)进行分析。对于竞争性实验，PAS细胞在加入ShK-F6CA 10nM之前，用过量的未标记ShK(L5)(100nM)预培养。第二，PAS细胞用抗Kv1.3抗体(获赠于Hans-Gunther Knaus，Innsbruck，澳大利亚)进行渗透和染色(Koch等，1997)，之后再用与Alexa-488结合的二级抗体(MolecularProbes，Eugene，OR)。染色的细胞用Zeiss LSM-510 META共焦显微镜(Carl Zeiss GmbH，Jena，德国)可以目测，测量单个细胞的荧光强度(n＝10-15)，用Mann-Whitney U检验进行统计分析。

功能研究  人和大鼠T细胞的增殖用[³H]胸苷掺入分析，按照以前的记述(Beeton等，2001a，b；Wulff等，2003)进行测定。为了测量IL2的产生，PAS T细胞在有或没有ShK或ShK(L5)的情况下，用MBP激活8小时，并按以前的记载(Beeton等，2001a)收集培养物上清。用大鼠IL2 Quantikine kit(R&D Systems)，根据制造商的说明，检测上清液中的IL2。外源性IL2(20单位/ml；Sigma-Aldrich，St Louis，MO)对PAS T细胞的作用，按照以前的记载(Beeton等，2001a)测定。

循环半衰期测定和血浆稳定性  将已知量的ShK(L5)加入Lewis大鼠血清中，并且对Kv1.3通道的阻滞活性通过膜片钳检验，建立标准量效曲线。Lewis大鼠单次皮下或静脉注射ShK(L5)后不同时间得到的血清样品，通过膜片钳检验对Kv1.3的阻滞活性，并从标准曲线按照以前所述(Beeton等，2001b)测定ShK(L5)的水平。在其它实验中，Lewis大鼠接受每天单次注射10μg/kg ShK(L5)，并在第1-5天的各次注射后24h，测定ShK(L5)的血清水平。为了测定ShK(L5)的血浆稳定性，掺有已知量ShK(L5)的大鼠血浆在37℃下孵育不同时间，然后检测对Kv1.3的阻滞活性；这些样品中残余量的ShK(L5)从标准曲线测定。

细胞毒性分析和Ames实验人PBMC、PAS、Jurkat、RPMI 8226和Burkitt细胞在有或没有ShK(L5)100nM的情况下，生长48h。然后细胞用LIVE/DEAD存活率/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes)根据制造商的说明书进行染色，活细胞和死细胞的百分率用荧光酶标仪(CytoFluor；Applied Biosystems，Foster City，CA)测定。Triton X-100(0.1％)用作细胞死亡的阳性对照。对于Ames实验，ShK(L5)的致突变活性由Nelson Laboratories(Salt Lake City，UT)在鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)试验菌株TA97a上测定。

评价心脏毒性的EKG研究  在接受ShK(L5)或介质的动物中，用植入的EKG发送器(Data Sciences，International，Arden Hills，MN)进行心电图研究，用作心率变异性分析。实验方案经UC Davis的实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的审核和批准。6只Lewis大鼠(9-11周龄；体重＝219±9g)，用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(7.5mg/kg)的混合物通过肌肉内注射给药进行麻醉。EKG发送器放在各个大鼠的腹膜腔内，两个EKG导联皮下埋管道右肩，和到至胸腔的剑突腔尾。手术结束时，给药止痛剂卡洛芬(5mg/kg，皮下)。术后两周，我们在大鼠上进行基线EKG记录2小时(第1天)。然后我们皮下注射介质(PBS+2％大鼠血清)，并再继续记录8h。然后动物返回它们的房间。第2天，我们记录基线EKG 2小时，之后皮下注射ShK(L5)(10μg/kg，溶于介质中)，并再继续记录EKG 8h。注射后1.5-3.5h记录的数据，用Nevokard软件(Bio-Impedance Technology，Inc.，Chapel Hill，NC)，在时域和频域两方面用于标准心率变异性参数分析。

亚慢性毒性研究Lewis大鼠(9-11周龄；体重199±7g)接受皮下注射ShK(L5)10μg/kg/天(n＝6)或盐水(n＝6)，为期2周。大鼠每天称重。加利福尼亚大学Davis分校的比较生物实验室(ComparativeBiology Laboratory)在2周结束时采集的血样上进行化学(COBASMIRA Plus；Roche Diagnostic Systems，Branchburg，NJ)和血液学(HEMAVEl^850 Multispecies Hematology Analyzer；CDC Technologies，Oxford，CT)分析。从6只给予ShK(L5)和6只给予盐水的动物中切下的胸腺和脾脏制备的单细胞悬液，以对各种T和B细胞标记有特异性的抗体(BD Pharmingen)染色，通过流式细胞术进行分析。

在Lewis大鼠中预防和治疗急性过继EAE以及预防DTH 9-11周龄的近交雌性Lewis大鼠购自Harlan-Sprague-Dawley(Indianapolis，IN)，隔离笼养，并不限量给予辐射过的啮齿动物饲料和酸化的水。所有的实验都依照国立卫生研究院(National Institutes of Health)的指导方针，并得到加利福尼亚大学Irvine分校实验动物管理与使用委员会的批准。ShK(L5)溶于PBS+2％Lewis大鼠血清(盐水)中皮下注射。急性过继EAE按照以前的记载(Beeton等，2001a，b)，用6-8×10⁶个髓鞘碱性蛋白(MBP)-激活的PAS细胞诱发。MBP从冷冻的豚鼠脊髓(HarlanBioproducts，Indianapolis，IN)中按照以前的记载提取(Deibler等，1972)。大鼠每天称重，每天观察两次EAE的临床征象。为预防实验，大鼠从第0-5天接受ShK(L5)10μg/kg/天，而对照大鼠接受盐水。为治疗实验，在发病后(大鼠有尾巴不举、竖毛和24小时内失重≥6％)，开始给药ShK(L5)(10μg/kg/天)或盐水，连续3天。

为了DTH实验，Lewis大鼠用在完全弗氏佐剂(Difco，Detroit，MI)中的卵清蛋白乳液免疫。7天后，它们在一侧耳翼接受溶于盐水的卵清蛋白的注射，另一侧耳朵为盐水。然后大鼠接受皮下注射ShK(L5)(10μg/kg/天)或介质(PBS+2％Lewis大鼠血清)。24和48小时后，用弹簧千分尺(Mitutoyo，Spokane，WA)测量耳朵肿胀度。

结果

ShK(L5)，一种新型ShK类似物，表现出对Kv1.3的选择性超过Kv1.1 100倍。ShK以大致相等的效力阻滞神经元Kv1.1通道和Kv1.3通道。因此，在血脑屏障被破坏，使足量ShK进入阻滞Kv1.1的情况下，要顾虑神经毒性。我们设计Kv1.3特异性抑制剂的策略是被我们的发现所指导，即含有荧光素-6-羧酸酯(F6CA)的ShK-F6CA，通过20-Aeea接头连接到ShK的N端，表现出对Kv1.3的选择性超过Kv1.1 80倍(Beeton等，2003)。由于F6CA可以作为限制性羧酸酯或者还作为环化内酯存在，尚不清楚ShK-F6CA的Kv1.3特异性是F6CA负电荷、大体积荧光素核产生的疏水性、潜在的平面-π-π电子堆积、或者所有这些可能因素的组合的结果。为了在这些可能性之间进行甄别，并为了开发非荧光素Kv1.3-选择性抑制剂，我们生成了一系列12个新型N-端取代的ShK类似物，探查部分这些相互反应。通过Aeea接头将酪氨酸、苯基丙氨酸或其衍生物(在电荷、大小和疏水性尚不同)连接到ShK的N端，我们能探查电荷和疏水性的作用，深入了解我们用F6CAC取代见到的选择性改进。

在图1A所示的实施例中，L-磷酸酪氨酸(L-pTyr)，一种负电荷(净电荷为-2)的翻译后修饰的芳香族氨基酸，通过AEEA接头连接到ShK-Arg¹上，产生新类似物称为ShK(L5)。ShK和ShK(L5)在L929细胞上稳定表达的Kv1.3和Kv1.1通道上检验。图1B显示ShK和ShK(L5)对从钳制电压-80至40mV的200ms去极化脉冲激发的Kv1.3和Kv1.1电流的作用。两种肽以剂量依赖模式可逆地阻滞Kv1.3和Kv1.1，Hill系数为1(图1，B-D)。K_d值从图1C所示的量效曲线上，用Origin软件测定。正如预期，ShK阻滞Kv1.3(K_d＝10±1pM)和Kv1.1(K_d＝28±6pM)的效力大致相等(图1C)。相反，ShK(L5)对Kv1.3(K_d＝69±5pM)的选择性超过Kv1.1(K_d＝7.4±0.8nM)100倍(图1，B和C)。Kv1.3电流被ShK(L5)阻滞的时间过程和它的洗脱示于图1D。ShK(L5)的洗入时间常数(T_ON)为131±21s(n＝7)，而肽洗脱的时间常数(T_OFF)为150±28s(n＝4)。从K_ON(15×10⁶±0.5×10⁶M^-1S^-1)和K_OFF(0.0059±0.0013s^-1)值计算的K_d(57±7pM)，与用Origin软件测定的K_d(69±5pM)一致。

其它ShK类似物在Kv1.3和Kv1.1通道上检验(图1E)。含有D-磷酸酪氨酸的ShK(D5)对Kv1.3的选择性超过Kv1.1的35倍，但是程度的级别比ShK(L5)要低效。含有L-pTyr-一甲基的ShK(L6)表现出中等的Kv1.3特异性(11倍)，而含有L-pTyr-二甲基或L-Tyr的ShK类似物对Kv1.3的选择性不超过Kv1.1(图1E)。含有苯基丙氨酸或其衍生物(体积、π电子密度和电荷不同)的类似物有中等或没有超过Kv1.1的Kv1.3特异性(图1E)。ShK(L5)对Kv1.3的选择性超过Kv1.1100倍，超出了ShK-F6CA(80-倍)、ShK(D5)(35-倍)、ShK-Dap²²(33-倍)、或任何其它检测的ShK类似物(图1C)。

图1.选择性Kv1.3阻滞剂的产生。A，根据发表的NMR结构的ShK分子模型。对通道阻滞至关重要的Lys²²，用橙色突出。L-pTyr通过Aeea接头(右)与ShK中Arg¹的α-氨基(用青色突出)连接。接头和L-pTyr的结构用AMI在Hyperchem中制备模型。B，ShK(上)和ShK(L5)(下)在稳定转染的细胞上对Kv1.3和Kv1.1电流的作用。C，Kv1.3(空心符号)和Kv1.1(实心符号)被ShK(蓝色)和ShK(L5)(红色)剂量依赖性抑制。对Kv1.3的K_d值＝10±1pM(ShK)和69±5pM(ShK(L5))；对Kv1.1的K_d值＝28±6pM(ShK)和7.4±08nM(ShK(L5))。D，ShK(L5)对Kv1.3洗入和洗出的时间过程。细胞保持在钳制电压-80mV，每30秒去极化200ms至40mV。E，显示ShK类似物抑制Kv1.3和Kv1.1的K_d值。对SMC-F6CA和ShK-Dap²²的K_d值来自发表的资料(Kalman等，1998；Beeton等，2003；Chandy等，2004)。

ShK(LS)是高特异性的Kv1.3抑制剂。我们评价了ShK(L5)对20种离子通道系列的特异性(表1)。ShK(L5)以K_d(76pM)阻滞T细胞上的Kv1.3通道，等于其在克隆通道上的K_d(69pM)。其对Kv1.3的选择性超过对Kv1.1 100倍，超过对Kv1.6的选择性260倍，超过对Kv3.2的选择性280倍，超过对Kv1.2的选择性680倍，并超过对所有其它检测的通道＞1000倍。值得注意的是它对Kv1.3的选择性超过对KCa3.1 1600倍，KCa3.1是钙激活的K⁺通道，调节人原初细胞和T_CM细胞的激活(Wulff等，2003)。天然ShK的选择性低于ShK(L5)。ShK对Kv1.3(K_d＝10±1pM)的选择性超过Kv1.1(K_d28±6pM)2.8倍，超过对Kv1.6(200±20pM)的选择性20倍，超过对Kv3.2(K_d＝5000±1000pM)的选择性500倍，超过对Kv1.2(10±1nM)和KCa3.1(K_d＝28±3nM)的选择性＞1000倍。蝎毒素，一种来自蝎子毒液的肽，被归类为特异性Kv1.3抑制剂(Lin等，1993；Koo等，1997；Middleton等，2003)，也并不特异。它对Kv1.3(110±12pM)的选择性超过对Kv1.2(K_d＝520+1pM)5倍，超过对Kv1.1(10±1nM)的选择性9倍，超过对Kv1.6和Kv3.2(K_d＞100nM)的选择性＞1000倍。木犀草素，一种以其是Kv1.3抑制剂为基础(Lahey and Rajadhyaksha，2004)，用于自身免疫性疾病的营养品(neutriceutical)商品(_{http://www.lutimax.com})，阻滞Kv1.3弱(K_d＝65±5μM)，表现出选择性不超过Kv1.1(K_d＝77±5μM)、Kv1.2(K_d＝63±4μM)或Kv1.5(K_d＝41±3μM)。ShK(L5)对Kv1.3的极度特异性，连同其在皮摩尔级通道亲和力，使其在免疫抑制方面有潜在的吸引力。

表1 ShK(L5)的选择性

    通道    K_d of ShK(L5)    Kv1.1    Kv1.2    Kv1.3(克隆)    Kv1.3(天然)    Kv1.4    Kv1.5    Kv1.6    Kv1.7    Kv2.1    Kv3.1    Kv3.2    Kir2.1    Kv11.1(HERG)    K_Ca1.1    K_Ca2.1    K_Ca2.3    K_Ca3.1    Nav1.2    Nav1.4    肿胀激活的T细胞氯通道    Cav1.2    pM    7000±1000    48,000±7000    69±5    76±8    137,000±3000    100,000(N.E.)    18,000±3000    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    20,000±2000    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    115,000±5000    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)    100,000(N.E.)

N.E.，无作用

ShK(L5)优先和持久地抑制人T_EM细胞增殖。为了评价ShK(L5)的体外免疫抑制活性。我们比较了其抑制抗CD3抗体刺激的人T_EM细胞系的增殖相对于含有原初和T_CM细胞混合物的人PBMC的增殖的能力。流式细胞术证实了研究的两个种群的细胞表面表型。T_EM系＞90％CCR7-CD45RA^-(图2A)，而PBMC含有65％CCR7⁺CD45RA⁺(原初)和18％CCR7⁺CD45RA^-(T_CM)细胞(图2B)。图2C显示ShK(L5)和ShK在抑制T_EM细胞增殖上(IC₅₀＝～80pM)，较之PBMC(IC₅₀＝5nM，p＜0.05)更有效60倍。PBMC敏感性较低，正如以前的记载(Ghanshani等，2000；Wulff等，2003)，可以通过原初和T_CM细胞的KCa3.1通道在刺激下迅速上调来解释。为了证实这种解释，PBMC被激活48h用于上调KCa3.1表达，然后静止12h，再用抗CD3抗体刺激，则完全对抗ShK(L5)阻滞(图2D，上方箭头)。在第一轮刺激期间已被ShK(L5)抑制的PBMC，当细胞清洗、静息、和用抗CD3抗体再攻击时，表现出同样的对ShK(L5)的抗性。这些结果确证了较早的报告，其表明原初和T_CM细胞通过上调KCa3.1通道来逃避Kv1.3抑制剂(Wulff等，2003)。因此，ShK(L5)优先和持久地抑制T_EM细胞的增殖。

图2.ShK(L5)优先抑制人T_EM细胞增殖。人PBMC(A)和人T_EM系(B)用抗CD3抗体、CD45RA和CCR7染色。CD45RA和CCR7的染色强度用流式细胞术在CD3⁺-门控种群上测定。C，ShK(蓝色)和ShK(L5)(红色)剂量依赖性抑制被抗CD3抗体刺激了48h的PBMC(空心符号，原初/T_CM细胞的混合物)和T_EM细胞(实心符号)的[³H]胸苷掺入作用。D，上调KCa3.1表达的预激活人PBMC(原初/T_CM细胞)(Ghanshani等，2000)，当用抗CD3抗体再次激活时，变得对抗ShK(L5)的抑制。这些细胞之前已经表现出对K_Ca3.1特异性抑制剂TRAM-34变得敏感(Ghanshani等，2000)。

ShK(L5)抑制大鼠T_EM细胞的增殖及其产生IL2；外源性IL2部分克服抑制。作为评价ShK(L5)治疗有效性的开端，我们检查了其抑制记忆T细胞系PAS增殖的能力，PAS在大鼠中导致MS样疾病(Beraud等，1993)。作为对照，我们用大鼠脾脏T细胞。为了证实两种细胞群的分化状态，我们评价了原初T细胞标记CD45RC(Bunce和Bell，1997)的表达。大鼠脾脏T细胞为76％CD45RC⁺(即主要为原初细胞)，而PAS细胞为CD45RC^-，提示它们是记忆细胞(图3A)。为了确定PAS细胞是否处于T_EM或T_CM状态，我们在激活之前以及之后48h，检查了Kv1.3的表达。预计是T_EM而不是T_CM在刺激下显著上调Kv1.3水平(Beeton等，2001b，2003)。膜片钳实验揭示，在PAS细胞MBP刺激后，Kv1.3电流幅度惊人地增加，与其是T_EM细胞相符(图3B)。作为PAS细胞上Kv1.3通道数量的独立测量，我们用ShK-F6CA，一种荧光标记的ShK类似物，其与Kv1.3特异性结合(Beeton等，2003)。由流式细胞术测定的ShK-F6CA(10nM)的染色强度反映了在细胞表面上表达的Kv1.3四聚体的数目(Beeton等，2003)。ShK-F6CA(10nM)的染色强度随着PAS细胞的MBP激活而增加，并且过量的未标记ShK(L5)(100nM)竞争性抑制ShK-F6CA染色(图3C)。作为最后的检测，我们对被Kv1.3特异性抗体固定和染色的静态和MBP-刺激的PAS细胞进行进行了共焦显微术。与图3B和C中的数据一致，静息PAS T细胞的Kv1.3染色强度为4.4±0.6，并且该值在抗原诱导的激活后增加到10.6±2.3(p＜0.005)(图3D)，显示激活后Kv1.3蛋白表达的提高。因此，MBP激活的PAS细胞是CD45RC^-Kv1.3^高T_EM细胞，而我们实验所用的大鼠脾脏T细胞主要处于原初状态。

ShK(L5)和ShK抑制MBP-触发的PAS细胞增殖(IC₅₀＝～80pM)比抑制大鼠脾脏T细胞的有丝分裂原诱发的增殖(IC₅₀≈100nM；p＜0.05)更有效～1000倍(图3E)。这些结果确证了用人T细胞得到的发现(图2)。ShK(L5)抑制MBP诱导的PAS细胞的IL2产生(图3F)，并且外源性IL2能部分克服ShK(L5)对PAS细胞增殖的抑制(图3G)。较早的研究用特异性较低的Kv1.3抑制剂，在人、大鼠和微型猪T细胞上报导了类似的发现(Chandy等，1984；Koo等，1997；pM Beeton等，2001a)。总之，ShK(L5)是人和大鼠T_EM细胞的强效和选择性的抑制，并因此对自身免疫疾病通过优先靶定促成的这些病症发病的T_EM细胞而具有治疗用途(Chandy等，2004)。

图3.ShK(L5)优先抑制大鼠T_EM细胞的增殖。A，流式细胞术检测的大鼠脾脏T细胞(左)和PAS T细胞(右)的CD45RC染色。B，静态(上)和髓鞘抗原激活(下)的PAS T细胞展示的Kv1.3电流。C，静态(上)ShK-F6CA-染色的和髓鞘抗原激活(下)的PAS T细胞的流式细胞图。未染色的细胞(黑线)和用ShK-F6CA染色的细胞(涂为绿色)。未标记ShK(L5)对ShK-F6CA染色的竞争性涂为红色。D，静态(上)和髓鞘抗原激活(下)的PAS T细胞中Kv1.3免疫染色的共焦图像。用Mann-Whitney U检验进行统计分析。E，ShK(蓝)和ShK(L5)(红)剂量依赖性抑制被Con A(1μg/ml)激活的原初/T_CM(空心符号)和T_EM(实心符号)细胞的[³H]胸苷掺入作用。F，ShK(蓝)和ShK(L5)(红)剂量依赖性抑制PAS T细胞被MBP刺激后7h的IL2分泌。G，ShK(L5)诱发的抑制髓鞘抗原触发的PAS T细胞的[³H]胸苷掺入(空心符号)被加入20单位/ml IL2(实心符号)所逆转。

皮下给药后ShK(L5)的血浆数值。在大鼠EAE模型上着手体内研究之前，我们用膜片钳分析确定了皮下注射后，ShK(L5)的循环水平是否足以抑制T_EM细胞。检验了来自ShK(L5)处理和对照大鼠的血样对Kv1.3通道的阻滞活性。对照血清没有表现出检测得到的阻滞活性，表明没有内源性通道阻滞剂。为了使分析标准化，将已知量的ShK(L5)加入大鼠血清，在Kv1.3通道上对这些样品进行检验。掺样的血清样品以剂量依赖性模式阻滞Kv1.3电流(K_d，77±9pM)，与没有血清时ShK(L5)的作用没有区别(图4A)。在处理的动物中ShK(L5)的水平通过与标准曲线比较确定。单次皮下注射200μg/kg后5分钟，可以在血清中检测到ShK(L5)(图4B)。峰水平(12nM)在30分钟内达到，然后该水平经420分钟下降至大约300pM的基线水平(图4B)。ShK(L5)从血中的消除可以用单指数拟合(图4C)。估算循环半衰期为～50分钟。

由于200μg/kg(12nM)后，血清峰浓度明显超过选择性阻滞KvI.3通道和T_EM细胞功能的需要，我们实验了较低的剂量。单次注射10μg/kg后，ShK(L5)的峰血清浓度在30分钟内达到≈500pM(数据未显示)，该浓度足以阻滞＞90％的Kv1.3但不影响Kv1.1。该剂量(10μg/kg/天)每天重复给药，导致～300pM的稳态水平(注射后24h测量；图4D)，足以导致60-70％抑制T_EM细胞，但极少影响原初/T_CM细胞。“稳态”水平出乎意料地给出了估算的循环半衰期～50分钟，表明ShK(L5)在反复给药下“蓄积”。为了确定是否“沉积”在皮肤或体内其它部位，我们在大鼠接受单次静脉内或皮下注射ShK(L5)10μg/kg后10h，测定ShK(L5)的水平。两种途径给药后，肽以同样的时程消除(图4E)，表明皮肤并不负责每天单次注射10μg/kg后达到的ShK(L5)300pM的稳态水平(图4D)，沉积存在于别处。

在每天单次注射10μg/kg/天后，我们成功达到ShK(L5)300pM的稳态水平，提示该肽可能体内稳定。为了检查其稳定性，我们在大鼠血浆或在含有2％大鼠血浆的PBS中，37℃下孵育ShK(L5)不同时间，然后测定Kv1.3阻滞活性。在两组掺样的样品中(血浆和PBS)，我们在大约5h观察到Kv1.3阻滞活性减少了50％，推测是由于肽与试管的塑料表面结合，然后在接下来的两天，该水平保持稳定(图4F)。作为额外的稳定性实验，我们比较了来自ShK(L5)处理的大鼠血浆的Kv1.3-对Kv1.1-的阻滞活性。如果ShK(L5)或者通过pTyr的脱磷酸或者通过Aeea-pTyr侧链的切割，在体内被修饰，其将分别产生ShK(L4)和ShK，二者对Kv1.3的选择性均不超过对Kv1.1(图1E)。来自ShK(L5)处理的大鼠的血清样品表现出与ShK(L5)相同的对Kv1.3的选择性超过对Kv1.1，表明该肽并没有经历上述的修饰。总之，这些结果表明，每天单次注射10μg/kg/天后，ShK(L5)在血浆中非常稳定，并达到药理相关的血清浓度。

图4.ShK(L5)的循环半衰期和稳定性。A，已知量的ShK(L5)加入到大鼠血清(△)或PBS(■)中，在L929细胞中稳定表达的Kv1.3通道上测定阻滞活性。B，单剂200μg/kg的ShK(L5)皮下注射到4只大鼠中。在指定的时间采血，用膜片钳检验血清，确定ShK(L5)的量。C，数据拟合为单指数衰减。半衰期≈50分钟。D，5只Lewis大鼠接受每天单次皮下注射10μg/kg/天的ShK(L5)，为期5天。每天早晨(上次注射后24小时)采血，并通过膜片钳检验对Kv1.3通道的阻滞活性。E，大鼠或者皮下(空心柱；n＝4)或者静脉内(实心柱；n＝4)，接受单剂10μg/kg ShK(L5)。在指定的时间采血。血清用膜片钳检验，确定血中ShK(L5)的量。F，在大鼠血浆(□)或含2％大鼠血浆的PBS(■)中，加入半数阻滞剂量的ShK(L5)，在37℃下孵育不同时间。在指定时间采集等份试样，测定对Kv1.3通道的阻滞活性。

毒性研究。我们进行了数个体外和体内实验，以判定ShK(L5)是否表现出任何毒性(表2)。人和大鼠淋巴细胞用超过Kv1.3半数阻滞剂量或T_EM抑制的IC₅₀(70-80 pM)＞1200倍的ShK(L5)浓度(100nM)孵育48h，表现出极小的细胞毒性。同样高的浓度在试验菌株TA97A上进行的Ames实验是阴性的，提示它不是一个致突变原。两个体外实验都未能检测到任何显著的毒性。

药物诱导的Kv11.1(HERG)通道的阻滞，在主要的心脏毒性和数个市售药物的停药中发挥作用。ShK(L5)在100nM(＞1430倍对Kv1.3的K_d)下，对Kv11.1通道没有作用，因此，我们选择的治疗方案(10μg/kg/天，稳态循环水平300pM)应该不引起心脏毒性。作为进一步的实验，我们在清醒大鼠中第1天给药介质(PBS+2％大鼠血清)，随后在第2天给药ShK(L5)10μg/kg/天，进行心率变异性分析。ShK(L5)在时域或频域上，对心率或标准HRV(心率变异性)参数没有作用(欧洲心脏协会[the European Society of Cardiology]和北美起搏电生理协会[theNorth American Society of Pacing Electrophysiology]特别工作组，1996)。

被急性毒性试验所鼓舞，我们进行了亚慢性毒性研究，其中大鼠每天皮下注射给药10μg/kg ShK(L5)或介质，为期2周(每组n＝6)。ShK(L5)处理的动物与接受介质的大鼠有同样程度的增重(表2)。血液学和血液化学分析显示，ShK(L5)-和介质-处理的大鼠之间没有差异，流式细胞术分析揭示胸腺细胞或淋巴细胞亚类的比例没有差异(表2)。总之，这些研究提示ShK(L5)是安全的。

为了测定治疗安全指数，我们对健康大鼠给药高出60倍的ShK(L5)剂量(600μg/kg/天)，为期5天，没有观察到毒性的临床征象，并且当健康大鼠接受单次注射1000μg/kg ShK(L5)时，没有见到毒性。当血脑屏障发生损害时，如在EAE和MS中发生的，情况的乐观性就降低了。患EAE的大鼠接受ShK(L5)10μg/kg/天，为期10天，没有显示毒性征象。反之，当大鼠出现EAE临床征象时，给药600μg/kg/天，为期5天的大鼠，40％(5/12)死于第五天(推断的LD₅₀＝750μg/kg/天)。由于单次注射给药200μg/kg后，血清中ShK(L5)的峰浓度(12nM)足以阻滞＞50％的Kv1.1通道，在给药ShK(L5)600μg/kg/天的EAE大鼠中观察到的毒性，可能是由于足量的ShK(L5)进入大脑，阻滞了Kv1.1而导致的。因而，在血脑屏障没有受到损害的情况下(见于不影响中枢神经系统(CNS)的自身免疫病)，ShK(L5)的有效治疗安全指数足以超过100，而当血脑屏障被破坏时，治疗安全指数为75。

表2 ShK(L5)的研究毒性，数据表示为均值±S.D.

体外实验    100nM ShK(L5)细胞毒性(％死细胞)人PBMCPAS T细胞Jurkat细胞Burkitt淋巴瘤RPMI 8226骨髓瘤Ames实验    7.5±4.3    8.1±0.8    5.5±3.3    3.1±0.9    6.5±2.1    阴性急性体内实验    盐水    ShK(L5)10μg/kg心电图^a心率SDNNCV％SDANN_5minrMSSDHF(n.u.)HF(％)LF(n.u.)LF(％)LF/HF    302±13    13.3±3.0    6.7±1.4    5.0±2.0    6.8±2.2    71±21    50±8    68±4    50±8    1.1±0.4    311±20    17.8±4.4    9.2±2.2    6.9±2.3    9.8±3.5    79±37    53±10    64±10    47±10    1.3±0.7亚慢性体内实验    盐水    ShK(L5)10μg/kg/天    为期2周增重  (％)全血计数血细胞比容(％)血红蛋白  (g/dl)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/dl)白细胞总数(×10³mm^-3)红细胞总数(×10⁶mm^-3)血小板总数(×10³mm^-3)血生化碱性磷酸酶(U/I)葡萄糖(mg/dl)血尿氮(mg/dl)肌苷 (mg/dl)白蛋白(g/dl)_胸腺细胞种群  (％)CD4^-CD8^-CD4⁺CD8⁺CD4⁺CD8^-CD4^-CD8⁺CD3⁺脾细胞种群(％)CD3⁺CD3⁺CD45RC⁺CD3⁺CD45RC^-CD3⁺CD4⁺CD3⁺CD8⁺IgM⁺    7.2±1.8    40.3±1.4    15.3±0.5    4 8.5±0.2    18.5±0.8    38.0±1.8    7.1±2.1    8.3±0.3    656±214    170±26    139±21    17.1±2.6    0.6±0    5.0±0.3    3.6±1.1    77.8±6.1    8.5±1.7    10.0±3.3    89.5±1.6    72.4±4.4    35.6±2.6    23.6±2.3    62.7±0.1    26.9±0.1    38.8±1.5    6.2±1.7    39.0±4.9    15.0±1.5    48.3±0.3    18.5±0.6    38.4±1.3    7.1±2.5    8.1±1.0    606±106    150±18    150±18    15.0±1.7    0.6±0.1    4.5±0.4    4.3±0.7    76.8±4.1    11.2±2.0    7.6±1.3    93.2±3.5    65.4±0.1    39.8±1.1    26.5±1.3    66.6±1.2    25.0±0.2    33.3±0.3

^a用t检验进行检验，所有参数p＜0.05。

SDNN：所有正常至正常RR间期的标准偏差；CV％：100×SDNN/平均RR间期；SDAMM_5min：每个5分钟期间，正常RR间期均值的标准偏差；rMSSD：递差的平均根方；HF(n.u.)：标准化单位中的高频(0.75-2.5Hz)能量；LF(n.u.)：标准化单位中的低频(0.2-0.75Hz)能量；MCV，红细胞平均体积；MCH，红细胞平均血红蛋白；MCHC，红细胞平均血红蛋白浓度。

ShK(L5)在Lewis大鼠中预防和治疗急性过继EAE和预防DTH。ShK(L5)在两种动物模型中，体内评价免疫抑制活性。我们检验了其预防和治疗由MBP-激活的PAS T_EM细胞转移到Lewis大鼠中诱发的急性EAE(Beeton等，2001a，b；Beraud等，1993)的能力，以及抑制由T_EM细胞介导的DTH反应(Soler等，2003)的能力。PAS细胞用MBP体外激活48h，然后过继转移(6-8×10⁶活细胞)到Lewis大鼠内。然后，为了预防试验，大鼠皮下注射盐水(对照大鼠)或ShK(L5)(10μg/kg/天)，为期5天。在第一个预防试验中，对照大鼠出现了轻度EAE(平均最大临床分值2.0±1.2)，平均发作于5.6±0.6天(没有显示)。ShK(L5)降低了疾病的严重度(平均最大临床分值0.7±0.6，p＜0.05)。在第二个预防试验中，对照大鼠出现了更严重的EAE(平均最大临床分值3.2±0.4)，平均发作于4.8±0.4天(图5A)。ShK(L5)明显降低了疾病的严重度(平均最大临床分值0.6±0.4，p＜0.007)，但没有显著推迟发病(5.5±0.7天；p＝0.07)。这些研究中没有注意到毒性征象。

在治疗试验中(图5B)，大鼠注射MBP-激活的PAS细胞，当其开始出现EAE临床征象时(尾巴不举，弓背姿势和经24小时失重6％或以上)，给药盐水或ShK(L5)10μg/kg/天，并持续治疗3天。EAE临床征象在对照组于第6天达到顶峰(分值＝3.9±0.7)，在治疗组为第7天(分值1.9±0.9；p＜0.05)。

作为独立评价ShK(L5)的体内免疫抑制活性，我们也检查了其抑制主要由皮肤归巢(homing)T_EM细胞介导的DTH反应(Soler等，2003)的有效性。用卵清蛋白和佐剂免疫的Lewis大鼠，在7天后，以卵清蛋白在一只耳朵和盐水在另一只耳朵攻击。然后大鼠接受盐水(对照大鼠)或ShK(LS)(10μg/kg/天)注射，测定耳朵厚度作为DTH的指标。所有对照大鼠在卵清蛋白攻击后24和48小时出现耳朵肿胀，而DTH反应在ShK(L5)-处理的动物中显著较轻(图5C)。因而，ShK(L5)抑制T_EM介导的DTH反应，并且预防和改善髓鞘激活的T_EM细胞的严重过继EAE。

图5.ShK(L5)在Lewis大鼠中预防DTH和急性过继EAE。A，预防EAE。PAS T细胞体外激活、清洗、并在第0天腹膜腔内注射。EAE的临床分数：0＝没有临床征象，0.5＝尾稍不举，1＝尾巴不举，2＝轻度下肢轻瘫或共济失调，3＝中度下肢轻瘫，4＝完全后肢瘫痪，5＝4+失禁，6＝死亡。大鼠(n＝6/组)从第0天至第5天，皮下仅注射介质(□；n＝6)或注射ShK(L5)(■；n＝6；10μg/kg/天)。B，治疗EAE。PAS T细胞体外激活、清洗、并在第0天腹膜腔内注射。当大鼠显现EAE临床症状时，开始用ShK(L5)10μg/kg/天治疗，持续3天。C，引发对抗卵清蛋白的DTH反应，大鼠(n＝6/组)用ShK(L5)10μg/kg/天处理2天，之后测定耳朵肿胀度。用Mann-Whitney U-检验进行统计分析。

讨论

通过把负电荷氨基酸L-pTyr借助于20-的疏水性接头与ShK的N端连接，我们开发出高度特异的Kv1.3抑制剂。ShK(L5)以K_d69pM阻滞Kv1.3，并且对Kv1.3的选择性超过Kv1.1 100倍，超过Kv1.6 260倍，超过Kv3.2 280倍，超过Kv1.2 680倍，并超过所有其它的受试通道＞1000倍。其它已知的Kv1.3阻滞剂选择性明显低于ShK(L5)。蝎毒素(Margatoxin)，来自墨西哥木蝎(Centruroides margaritatus)毒液的一种肽，在微型猪中抑制DTH(Koo等，1997)，但对Kv1.3(K_d，110pM)的选择性只超过Kv1.2(K_d，520pM)5倍，选择性超过Kv1.1(K_d，10nM)9倍。蝎毒(Kaliotoxin)，来自北非肥尾蝎(Androctonusmauritanicus)，抑制大鼠的DTH、改善EAE(Beeton等，2001a)和试验性牙周病中的炎性骨重吸收(Valverde等，2004)，但比ShK(L5)效力低(Kv1.3 K_d，650pM)和选择性低(Grissmer等，1994)。第一个发现的纳摩尔级亲和力的小分子Kv1.3抑制剂-亚氨基二氢喹啉WIN-17317和CP-339818以及二苯甲基哌啶UK-78282还阻滞钠通道(Wanner等，1999)和神经元Kv1.4通道(Hanson等，1999)。Merck开发的小分子Kv1.3抑制剂-correolide(Felix等，1999；Hanner等，1999；Koo等，1999；Bao等，2005)，环己基取代的苯甲酰胺(Schmalhofer等，2002)和candelalides A-C(Singh等，2001)-对Kv1.3的选择性差。Psora-4，最强效的小分子Kv1.3阻滞剂(K_d，3nM)对Kv1.3的选择性只超过Kv1.1和Kv1.2 16-至20-倍，超过对心脏Kv1.5通道选择性的2.5倍(Vennekamp等，2004)。木犀草素，一种改善大鼠EAE的类黄酮(Hendriks等，2004)，作为营养剂出售(http；//www.lutimax.com；http://www.synorx.com)，表面上是由于其阻滞Kv1.3通道的能力(Lahey和Rajadhyaksha，2004)。但是，木犀草素是Kv1.3的弱阻滞剂(K_d，65μM)并且对Kv1.3的选择性不超过Kv1.1、Kv1.2，或Kv1.5。其它已知的Kv1.3小分子阻滞剂-磺酰胺苯甲酰胺茚满(Castle等，2000)，二氯苯基吡唑并嘧啶(Atwal等，2001)，呋喃喹啉Ibu-8(Buten-schon等，2001)，四苯基卟啉(Gradl等，2003)，3-烷基-和3-芳基-7H-呋喃[3，2-g]chromen-7-酮(Wernekenschnieder等，2004)，凯林酮和查耳酮衍生物(Baell等，2004)，卡律蝎毒，诺克休斯毒素(Grissmer等，1994)，agitoxin-2(Garcia等，1994)，BgK(Cotton等，1997)，Pandinius imperator毒素1(Peter等，2001)，HsTx1-既不如ShK(L5)有效也不如其有选择性。由于它们缺乏Kv1.3选择性，这些阻滞剂如果以足以阻滞神经元通道的浓度进入中枢神经系统，可能有潜在的神经毒性。唯一可以与ShK(L5)比较效力和Kv1.3特异性的Kv1.3抑制剂是最近记载的凹直钳蝎(Orthochirus scrobiculosus)OSK1毒素的合成类似物(OSK1-Lys¹⁶Asp²⁰)(Mouhat等，2005)，但其作为免疫调节剂的活性仍不确定。

ShK(L5)精敏的Kv1.3-特异性使之具有了诱人的药物前景。ShK(L5)在血浆中非常稳定，重复每日皮下单次注射10μg/kg后，能达到稳态血液水平～300pM。ShK(L5)的血浓度足以阻滞＞90％的Kv1.3通道，而不影响其它离子通道，并足以导致60-70％的T_EM细胞抑制，而很少抑制原初/T_CM细胞。ShK(L5)超过其药理剂量1200倍的浓度在体外没有细胞毒性或致突变性。ShK(L5)并不阻滞负责药物诱导的长QT综合征的心脏Kv11.1(HERG)K⁺通道(Recanatini等，2005)，并且健康大鼠体内给药ShK(L5)药理浓度(10μg/kg/天)，根据持续EKG监测，不改变心脏功能。体内重复给药ShK(L5)10μg/kg/天，为期2周，不改变临床化学或血液学图谱。健康动物单次注射给药ShK(LS)1000μg/kg/天(药理剂量的100倍)或以600μg/kg/天重复注射5天(药理剂量的60倍)，没有表现出任何明显的毒性征象。这些结果表明，每天单次皮下注射ShK(L5)后，可以达到药理相关的血液水平，并且有效治疗的安全指数在大鼠中超过100。

ShK(L5)通过优先靶定牵涉MS、1型糖尿病、风湿性关节炎和牛皮癣中的持续激活的自身反应性T_EM细胞可以用于治疗自身免疫病(Ezawa等，1997；Lovett-Racke等，1998；Scholz等，1998；Friedrich等，2000；Markovic-Plese等，2001；Viglietta等，2002；Soler等，2003；Wulff等，2003)。ShK(L5)在皮摩尔级浓度就抑制人和大鼠T_EM细胞的增殖(两种情况下IC₅₀＝～80pM)和抑制IL-2产生(图2和3)。外源性IL2部分克服了这种阻滞。人原初/T_CM细胞开始对ShK(L5)的敏感性比人T_EM细胞低60倍，并在激活期间变得完全对抗阻滞(图2)，推测是通过上调K_Ca3.1(Ghanshani等，2000；Wulff等，2003)。大鼠原初/T_CM细胞对ShK(L5)的敏感性比T_EM细胞低1000倍。这种原初/T_CM细胞与T_EM细胞相比较对ShK(L5)灵敏度的种属变异性——人低60倍而大鼠低1000倍——可以用人和大鼠的原初/T_CM细胞之间K⁺通道表达的差异来解释。静态的人原初/T_CM细胞，每个细胞上表达的Kv1.3通道(250-400)比Kc_a3.1(10-20)多，因此Kv1.3阻滞剂可以比Kc_a3.1阻滞剂更有效地抑制(Ghanshani等，2000；Wulff等，2003)。相反，静态的大鼠原初/T_CM细胞，每个细胞上表达的Kc_a3.1通道(10-20)比Kv1.3通道(1-10)多，对Kc_a3.1阻滞剂比Kv1.3阻滞剂更敏感(Beeton等，2001b)。大鼠/人通道表达中的差异，可能是大鼠原初/T_CM细胞(IC₅₀＝100nM)和人原初/T_CM细胞(IC₅₀＝5nM)对ShK(L5)敏感性差异的基础。总之，ShK(L5)优选抑制T_EM细胞，而原初/T_CM细胞开始对阻滞剂敏感性较低，然后通过上调KCa3.1通道迅速逃脱抑制(Ghanshani等，2000；Beeton等，2001b；Wulff等，2003)。

人的类别转换记忆B细胞(如CD27⁺IgG⁺IgD^-)牵涉在自身免疫疾病的致病性中(Iglesias等，2001；O′Connor等，2001；Corcione等，2004)。Kv1.3阻滞剂优选抑制晚期记忆B细胞的增殖，而原初和早期记忆B细胞(CD27⁺IgD⁺)的敏感性明显较低(Wulff等，2004)。因此，ShK(L5)可以关闭促成自身免疫病症发展的T_EM和类别转换记忆B细胞的功能。顾虑的是类别转换记忆B细胞在体液免疫中的重要作用(产生IgG抗体)，以及作为这些细胞通道抑制的结果可能发生的是，对细菌攻击发起切实的免疫反应的能力减少了。幸运的是，人的类别转换记忆B细胞对ShK阻滞的敏感性(IC₅₀＝1-4nM)低于人T_EM细胞(IC₅₀＝80-400pM)，因为它们在静息时比T_EM细胞(250-400/细胞)表达更高数量的Kv1.3通道(～2000/细胞)(Wulff等，2004)。因此，在自身免疫疾病的治疗期间，可能递增Kv1.3阻滞剂的剂量，以优先抑制一组或两个组的记忆细胞。

我们在T_EM细胞-诱发疾病的两个大鼠模型上评价了ShK(L5)，通过过继转移髓鞘特异性T_EM细胞诱发的EAE(Beeton等，2001b)，和通告皮肤归巢T细胞导致的DTH(Soler等，2003)。如果从过继细胞转移时单次日注射给药(10μg/kg/天)，ShK(L5)可以预防EAE，并且当症状出现后开始治疗时，它明显降低疾病的严重度。在治疗的EAE大鼠中没有观察到毒性，提示以这种治疗给药方案达到的血液和组织浓度尚不足以阻滞神经元通道，包括含有Kv1.3亚单位的异源多聚体Kv通道(Koch等，1997)。ShK(L5)在抑制DTH上也有效。这些概念证明研究证明了ShK(L5)在大鼠模型中改善T_EM-介导疾病的治疗有效性。通过每天注射给药高于治疗有效剂量60倍的剂量(600μg/kg/天)，我们测定了ShK(L5)在EAE大鼠(血脑屏障可能被损坏)中的治疗安全指数。接受该剂量的EAE大鼠40％死于第五天(推断LD₅₀＝750μg/kg/天，5天)，相应的治疗安全指数大约75。

总之，ShK(L5)是比任何其它已知抑制剂更具选择性的Kv1.3阻滞剂，其通过靶定T_EM细胞和类别转换记忆B细胞，可能证明在自身免疫疾病中有用。其对Kv1.3皮摩尔级的亲和力，和显著的血浆稳定性，结合其在健康大鼠(＞100)以及EAE大鼠(～75)中的高治疗安全指数，很好地预示了其作为治疗性免疫调节剂的潜力。每天单次皮下注射ShK(L5)对改善EAE和预防DTH有效，表明肽的这种给药途径是可行的。

Acknowledgments

We thank Paul Munch，Suresh Raman，and Daniel Homerick forexcellent technical assistance.

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Address correspondence to：Reprint requests to：K：George Chandy，M.D.，Ph.D.，Department of Physiology and Biophysics，Medical School，291 IrvineHall，Univeraity of California.Irvine，Irvine，CA 92697-4561.Tel：949-824-7435，Fax：949-824-3143，email：gchandy@uci.edu