红球姜的抗超敏炎症和抗敏活性

摘要

本发明提供制备一种营养制剂的方法，其包括从红球姜根进行溶剂提取的步骤，并且提供这种制剂调控免疫系统，更具体地预防或治疗过敏性疾病的应用。

说明书

发明背景

发明领域

本发明提供一种包括红球姜(Zingiber zerumbet Sm)根提取物的新型的营养(nutraceutical)制剂，以及应用所述制剂调控免疫系统的应用。

相关技术描述

白细胞三烯(LT)，特别是半胱氨酰化LTs、LTC4、LTD4和LTE4，已经牵连在哮喘的临床过程、生理变化和发病机理中(1)。LTC4、LTD4和LTE4是潜在的支气管收缩剂，并且参与对血管、黏液纤毛的清理和嗜酸性细胞炎症(2)。另外，半胱氨酰化LTs从通常与哮喘相关的细胞，包括嗜曙红细胞和肥大细胞而形成(3)。因此，白细胞三烯受体拮抗剂广泛地用于治疗支气管性哮喘。然而，关于与一组新型哮喘药物，典型地为白细胞三烯受体拮抗剂肝损伤的公布数据加深了对肝中毒的注意(4)。因此，草药为哮喘的长期治疗打开了具有治疗潜力的新的窗口。已经发现经过外周血T细胞的Th细胞细胞因子与哮喘的严重性相关。最近的研究表明，与其受体(IL-4R)结合的白细胞介素-4□IL-4□对于哮喘中存在的呼吸道炎症的发展是必要的(5)。12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)/离子霉素刺激后，与正常受试者相比较，在患有遗传过敏性咳嗽和遗传过敏性哮喘的患者中发现显著降低比例的IFN-γ/IL-4-产生CD4+T细胞，并且在患有遗传过敏性哮喘的患者中，IL-4-产生CD4+T细胞的比例显著比在正常对照受试者中更高(6)。当与对照人受试者比较时，尽管差异是血清IFN-γ中的边界显著性(p＝0.069)，但是急性哮喘病具有显著增加水平的循环IL-4(p＜0.001)、IL-5(p＜0.001)和IL-13(p＜0.001)(7)。然而，这些极低血清水平的细胞因子只能在动物研究中检测到。因此，在我们实验室中开发了一种新的便宜的生物技术检验，定量竞争性反转录聚合酶链式反应(qc-RT-PCR)，以量化细胞因子在免疫细胞中的基因表达，从而精确评估传统草药的治疗表现。当寻找潜在的治疗草药时，将竞争性半胱氨酰化的白细胞三烯受体拮抗剂视作一种新种类的哮喘治疗药物(8)。最近发现红球姜(Zingiber zerumbet Smith)具有抗肿瘤启动子活性(9)，并且在小鼠巨噬细胞中显著地减少可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)和环加氧酶2(COX-2)，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放。

                     发明概述

这里我们证明红球姜具有抑制炎症调控因子(mediator)释放并且影响细胞因子网络的基因表达的有利作用。还描述了人类应用红球姜提取物治疗过敏性疾病的实例。

在小鼠中证明了红球姜(ZZ)水性粗提取物(ACE)在抗超敏性和抗炎症中的潜能。从用ZZ-ACE治疗的小鼠肺组织测定白细胞三烯C4(LTC4)的释放。结果表明ZZ-ACE有效地抑制LTC4从肺组织的释放。对于抑制LTC4的作用，鉴定了一种活性化合物为5，7-二羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲氧基-chromen-4-酮。

在小鼠中应用卵清蛋白诱导哮喘过敏性反应。与那些对照组比较，用ZZ-ACE治疗的小鼠具有更高比例的脾细胞IFN-γ/IL-4基因表达水平(p＜0.05)。球姜酮被鉴定为增加IFN-γ/IL-4基因表达比例的活性成分。

当给人志愿者施用液体或胶囊形式的ZZ-ACE时，也观察到抗过敏性作用。

这些结果表明，使用乙醇、水或乙醇和水的混合物作为溶剂的ZZ提取物含有具有预防或治疗过敏性炎症的潜能的成分。

结合附图，本发明的其它目的和特征将从下述详述中变得显而易见。然而，应该理解，附图只用于举例说明的目的，并不能解释为本发明的限制，对于本发明的限制应该参考附上的权利要求。还应该理解，附图不必按比例绘制，并且除非另外说明，它们仅仅意欲概念性地举例说明本文所述的结构和方法。

附图简述

图1是5，7-二羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲氧基-chromen-4-酮的化学结构。

图2是mIFN-γ基因的DNA序列(GeneBank登记号NM_008337)。对应所用引物的序列用下划线标记。

图3是mIL-4的DNA序列(GeneBank登记号BC027514)。对应用于qc-RT-PCR的引物的序列用下划线标记。

图4是用于确定小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达水平的qc-RT-PCR产物的凝胶电泳。泳道1-8是应用脾细胞cDNA样品和竞争质粒作为DNA模板的PCR产物。泳道M是标记(100bp梯子)。泳道S1-S5是应用标准物和竞争质粒作为DNA模板的PCR产物，其用来确定标准曲线。

图5是用于确定小鼠脾细胞中IL-4 mRNA表达水平的qc-RT-PCR产物的凝胶电泳。通过qc-RT-PCR检测小鼠脾细胞中的IL-4 mRNA。泳道1-9是使用脾细胞cDNA样品和竞争质粒作为DNA模板的PCR产物。泳道M是标记(100 bp梯子)。泳道S1-S7是应用标准物和竞争质粒作为DNA模板的PCR产物，其用来确定标准曲线。

图6是球姜酮的化学结构。

目前优选实施方案详述

材料和方法

设备：用于柱层析的硅胶(Merck Kieselgel 60，230-400目ASTM)，和PLC(0.5mm，Merck Kieselgel 60 F254)来自Merck；质子NMR光谱通过实用LC-MS Varians 500和质谱进行测定。

作为水提取物的ZZ-ACE：将50g干燥的红球姜根与500ml蒸馏水(10倍重量)混合并且在100℃回流4小时。将提取物过滤并且浓缩到100ml，然后冷冻干燥。将冷冻干燥的粉末保存为红球姜的水性粗提取物(ACE)或ZZ-ACE。

乙醇提取：将干燥的ZZ碾碎，并且与10倍的乙醇(每g ZZ 10ml乙醇)混合，并且在60℃回流4小时。将提取物在冷冻干燥前过滤并且浓缩到1/10体积，并且保存为乙醇提取物。使用硅胶柱将所述乙醇提取物进一步部分纯化。

柱层析：将乙醇提取物(65g)浓缩并且上样到层析柱(SiO₂，7.5cm ID×20cm H)上。溶剂梯度步骤使用正己烷/乙酸乙酯(或n-Hex/EA)(1000ml/200ml)开始，接着连续进行n-Hex/EA(600ml/400ml)，n-Hex/EA(400ml/600ml)，EA(1000ml)，和最后进行甲醇(1000ml)。从开始时收集洗脱液500ml/烧瓶，并且流速为大约30ml/min。收集到12份级分，并且按照洗脱顺序命名为NP1-NP12。

分离球姜酮：将级分NP2的内容物用甲醇重结晶以获得纯的结晶。质子NMR和MS光谱实验的结果确定所述化学物质为球姜酮(0.8g)。将级分NP2命名为粗球姜酮。

制备粗类黄酮级分：将NP12(5g)上样到另一柱(SiO₂，2.5cm ID×12cm H)上。从开始起收集洗脱液每级分200ml，并且流速为大约10ml/min。溶剂梯度是连续地n-Hex(100ml)、n-Hex/EA(100ml/100ml)、n-Hex/EA(100ml/150ml)、EA(100ml)和EA/MeOH(100ml/50ml)。收集了7个烧瓶，并且命名为NP12-1到NP12-7。将级分NP12-3命名为粗类黄酮。

分离5，7-二羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲氧基-chromen-4-酮：分离NP12-3(30.2mg)并且上样到用二氯甲烷/甲醇(30/1)展层的PLC上，以获得8条条带(NP12-3-1到NP12-3-8)。将条带NP12-3-3(3.4mg，命名为PLC纯化的类黄酮，90％纯度)的物质分离出来，并且用n-Hex/丙酮重结晶。得到纯的黄酮类似物(1.5mg)，并且用质子NMR(Varians 500)和LC-质谱鉴定为5，7-二羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲氧基-chromen-4-酮。

实验1：红球姜水性粗提物(ACE)在小鼠中的抗肺炎作用

实验1的方法：

动物处理，药物治疗和肺部组织收集：从国家实验室动物中心(National Laboratory Animal Center，台北，台湾)获得总共20只雌性ICR小鼠，4周龄。将小鼠随机分成2组，对照组和ZZ-ACE组。对照组小鼠饮用水，并且ZZ-ACE组小鼠饮用用0.22μm滤器过滤的红球姜水性粗提物(ACE)(ZZ-ACE，28.8mg/ml)。将所有小鼠没有限制的喂养。喂养28天后，将所有小鼠用戊巴比妥钠麻醉。使用20ml蒂罗德缓冲液灌注肺。灌注后，从每个肺的相同部分摘取0.5g肺组织。将肺组织用11号外科手术刀剁碎，然后在10ml蒂罗德缓冲液与95％O₂中在37℃温育45分钟。温育后，用C18柱体纯化介质中的白细胞三烯C4，然后通过白细胞三烯C4EIA试剂盒(Cayman Chemical Company，MI，USA)进行定量。

实验1的结果：ZZ-ACE的抗肺炎活性

ZZ-ACE在小鼠中的抗肺炎活性：ZZ-ACE组小鼠的肺部组织释放出显著更低量的白细胞三烯C4(表1)。由于LTC4被命名为“过敏性反应的缓慢反应物”，白细胞三烯C4减少的产量表明ZZ-ACE的治疗作用。

表1.用或不用ZZ-ACE喂养的小鼠的肺部组织的LTC4-释放水平。

对照ZZ-ACE P-值 LTC4(pg/肺)429(100％)261(61％) 0.027^*

^*与对照相比，显著不同(P＜0.05)。

实验2：鉴定抗炎性化合物为5，7-二羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲氧基-chromen-4-酮

实验2的方法：鉴定一种抗炎性化合物

细胞培养和药物治疗：大鼠嗜碱性白血病-1细胞(RBL-I)购自FoodIndustry Research和Development Institute(CCRC 60198，ATCCCRL-1378)，并且在MEM-α培养基(Gibco，12000)中培养。将全反式视黄酸(1μg/ml)添加到3.5cm直径的孔(6孔平板)中，每孔含有2×10⁶个细胞/2ml/孔。然后将平板在37℃和5％CO₂的空气中温育16hr。将不同体积的ZZ样品添加到孔中，以制成适当的终浓度(0，0.5，5，50μg/ml)，并且再温育2小时。将A23187(钙离子载体)添加到每个孔中，达到终浓度10μM，以刺激RBL-1细胞释放LTC4/cLTs持续15分钟。将孔中的培养基在5000rpm离心10min，以获得上层清液用于ELISA检测。

LTC4/cLTs ELISA检测：在对于LTC4/cLTs的EIA检测之前，将细胞培养物的上层清液稀释到适当浓度。按照制造者提供的方法进行分析。

MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-联苯四唑溴化物]检测：为了确定细胞存活能力，将培养基移除，并将细胞用1×PBS洗涤。然后，将MTT(Sigma，M2128)加入到96孔平板中达到浓度0.5mg/ml。在37C温育4h后，将平板每孔添加150μl酸性异丙醇(0.1N HCl)以溶解紫色结晶。过夜培养后，使用微量平板读数仪在560nm确定OD。

实验2的结果：鉴定消炎化合物

粗Flanvoid级分和鉴定的Flanvoid减少A23187刺激的大鼠噬碱性白血病-1(RBL-1)细胞的CLTs/LTC4分泌：表2A和2B显示，与对照相比较，ZZ乙醇提取物和粗Flavnoid级分有效地减少所检测的白血病细胞分泌CLTs和CLT4。鉴定显示具有最高的活性的级分含有主要的flavnoid，约90％纯度。Flavnoid的结果确定为：5，7-二羟基-2-(4-碱基-苯基)-3-甲氧基-chromen-酮。(见图1)。

表2A.ZZ样品对细胞存活的作用和A23187刺激的白血病细胞释放的CLTs水平

对照，无ZZ 乙醇提取物(0.5 μg/ml) 粗flavnoid(5 μg/ml)％CTLs vs.对照100 46 17存活力(MTT％)100 90 74

表2B.ZZ样品对细胞存活的作用和A23187刺激的白血病细胞释放的LTC4水平

对照，无ZZ 粗flavnoid(5 μg/ml) 粗flavnoid (50μg/ml) PLC纯化的 flavnoid(50 μg/ml)％LTC4 vs.对照100 63 36 6存活力(MTT％)100 83 87 65

实验3：使用小鼠模型，ZZ-ACE的抗过敏活性

实验3的方法：ZZ-ACE的抗过敏活性，小鼠模型，体外实验

动物处理，治疗和脾细胞收获：将来自国家实验室动物中心(台北，台湾)的总共24只雌性ICR小鼠随机分成3组：阴性对照组(n＝4)，平行对照组(n＝7)和ZZ-ACE组(n＝10)。阴性对照组的小鼠进行没有任何治疗地无限制的喂养。平行对照组和ZZ-ACE组的小鼠分贝用水或ZZ-ACE喂养56天，同时经历预定诱导的哮喘反应。通过在第42天连续3天给每只小鼠I.P.施用在100μl 0.9％盐水中的20μg卵清蛋白和2mg氢氧化铝而将小鼠第一次致敏，从而诱发哮喘反应，然后通过向每只小鼠的气管中滴入具有1％卵清蛋白的10μl气溶胶而诱发过敏性哮喘。哮喘诱发后20分钟，将小鼠处死。通过机械切割而分离小鼠脾细胞，并且在细胞悬浮液中进行红细胞的低渗裂解。将脾细胞用或不用12μg Con A/2×10⁶个细胞/孔(Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA)在37℃刺激24小时。从培养的脾细胞中分离总RNA样品，并且通过定量竞争性-RT-PCR(qc-RT-PCR)进行评估，以确定它们的基因表达水平。

存qc-RT-PCR中用于测定IFN-γ和IL-4基因表达的引物设计：分别按照GeneBank登记号NM_008337和BC027514的序列，设计用于干扰素-γ和白细胞介素-4的引物(表3A)。对于每个基因，设计了2对引物，具有相同的3′反向引物但是具有不同的5′正向引物。在第一对引物中，5′正向引物的DNA序列(叫作标准引物)与目标基因片段相同。这对引物用于PCR扩增，以合成天然长度的DNA片段(标准片段)。将标准片段克隆以形成“标准质粒”。在第二对引物中，5′正向引物(叫作竞争引物)具有由其后紧接着与下游多于100个碱基对的基因序列相同的短片段序列的标准引物组成的DNA序列。将第二对引物用于PCR扩增以获得具有与标准片段的5′和3′序列相同的DNA片段(竞争片段)，但是缩短了多于100个碱基对。将竞争片段用于构建竞争质粒。mIFN-γ(见图2)和mIL-4(见图3)的DNA序列在下文中显示。引物设计，预计的PCR产物长度在表3A中显示。

表3A.用于确定mIFN-γ和mIL-4基因表达的qc-RT-PCR检测的引物

5′正向引物3′反向引物PCR产物长度(DNA序列)IFN-γ标准质粒gctctgagacaatgaacgcta cgactccttttccgcttcc473b.p.(99-570)竞争质粒gctctgagacaatgaacgctacaagtggcatagatgtgg 同标准的473b.p.(99-119，225-570)IL-4标准质粒gctagttgtcatcctgctcttc tcagtgatgtggacttggac365b.p.(56-411)竞争质粒gctagttgtcatcctgctcttcggagatggatg 同标准的473b.p.(56-77，182-411)

制备标准质粒和竞争质粒：将用PCR试剂盒和所述引物扩增的干扰素-γ或白细胞介素IL-4的小鼠cDNA片段克隆到pGEM-T载体(Promega，Madison，WI)中以构建这两种基因的标准质粒和竞争质粒。将标准质粒和竞争质粒全部测序以确定插入序列的正确度。

建立标准曲线：遵循qc-RT-PCR方法原理，将已知量的竞争质粒与已知标准质粒的连续稀释液混合物，并且将所述混合物用作DNA模板，使用一对标准引物和3′反向引物进行PCR扩增。然后，将从PCR反应获得的标准片段和竞争片段用于溴化乙啶凝胶电泳。计算片段的谱带强度比例和用于每种混合物的质粒的量的比例之间的相互关系，以建立标准曲线。

通过定量竞争-RT-PCR(qc-RT-PCR)确定干扰素-γ或白细胞介素IL-4在脾细胞中的基因表达：离心后，将脾细胞细胞块与1ml Trizol制剂混合，然后用Trizol RNA提取试剂盒分离总RNA(Gibco，Life Technologies)。每份样品的总RNA纯度通过A_260nm/A_280nm比例进行评估。使用反转录酶将mRNA转化成cDNA，然后通过qc-PCR分析。在1μl标准引物(0.5μg每种正向引物和反向引物)，2.5μl 10×PCR缓冲液，2.5μl dNTP(2mM)，0.1μl DNA聚合酶(5U/μl)，0.5μl样品cDNA和0.5μl竞争质粒的混合物中，将所述混合物用纯净水调整到总体积25μl后，进行qc-PCR反应。然后用凝胶电泳分析PCR产物。用Image Quant Densitometer读取凝胶中每条带的溴化乙啶密度，并且将结果与确定的标准曲线相比较，以计算脾细胞样品中的cDNA拷贝数。

实验3：ZZ-ACE的抗过敏活性，小鼠模型，先体外后体内(ex vivo)实验

ZZ-ACE通过平衡Th1/Th2免疫应答的抗过敏活性：小鼠用ZZ-ACE处理后，从处理的小鼠收集脾细胞，并且使用qc-PCR分析IFN-γ和IL-4基因的表达水平。结果(表3B)表明，与对照相比，在处理的小鼠的脾细胞中，使用或不使用ConA刺激，IFN-γ的基因表达水平(p＜0.05)显著增加，并且IL-4基因表达水平(p＜0.05)显著减少。由于IFN-γ与IL-4基因表达水平的比例显著地增加，ZZ-ACE可以有利地作用而通过调整Th1/Th2平衡而消除过敏反应。因此，这一实验的结果表明，在连续60天施用ZZ-ACE后，ZZ-ACE具有通过调节小鼠免疫细胞中的细胞因子基因表达而减弱过敏反应。对于IFN-γ(图4)和IL-4(图5)基因表达的qc-RT-PCR PCR产物的凝胶电泳图片的实例在下文中显示。

表3B.在从饮用或不饮用ZZ-ACE、和具有或不具有哮喘诱导的小鼠收集的脾细胞中，使用或不使用ConA刺激，IFN-γ和IL-4的基因表达水平1

水，没有哮喘水，哮喘ZZ-ACE，哮喘IFN-γ w/o ConA(拷贝/2×10⁶细胞)^a6.28×10^3b1.19×10^5c2.04×10⁵IL-4 w/o ConA(拷贝/2×10⁶细胞)^a2.04×10^5b24.9×10^5c8.61×10⁵²IFN-γ/IL-4 w/oConA^a0.039^a0.046^b0.242IFN-γ w/ConA(拷贝/2×10⁶细胞)^a1.26×10^4a1.59×10^5b6.34×10⁵IL-4 w/ConA(拷^a5.29×10^5b5.68×10^6a1.49×10⁶贝/2×10⁶细胞)²IFN-γ/IL-4 w/ConA ^a0.026^a0.032 ^b0.378

¹同一行中不同的上标表示显著差异(p＜0.05)。

²通过先计算每只小鼠IFN-γ/IL-4的比例然后平均所述比例而计算的值。

实验4：鉴定球姜酮作为活性化合物调控Th1/Th2免疫应答的平衡

实验4的方法：

活性化合物鉴定：首先将干燥的ZZ根用乙醇提取(乙醇提取物)，然后将所述提取物用硅胶和PLC进一步进行层析纯化，并且用体外生物活性筛选(步骤在下文实验4A-4E中描述)进行分析，以鉴定含有强抗过敏活性的纯化级分(结果在下文实验4A-4E中描述)。然后将活性化合物从所鉴定的活性级分中分离。

实验4的结果：鉴定球姜酮作为活性化合物调控Th1/Th2免疫应答的平衡

活性化合物鉴定：活性级分中的化合物鉴定为球姜酮。球姜酮的结构参见图6。

4A：ZZ样品对IL-13/TNF-α刺激的人BEAS-2B细胞的Eotaxin分泌水平的影响

实验4A的方法：

细胞培养，用ZZ样品处理，并且对于eotaxin表达的刺激：将转化了人支气管上皮细胞BEAS-2B的SV40接种在具有F12/DMEM培养基的96孔平板中，并且在37℃温育以达到连片生长。然后将细胞用不同浓度的ZZ样品处理。处理20分钟后，将细胞用50ng/ml人IL-13(Peprotech，200-13)和100ng/ml人TNF-α(Peprotech，300-01A)在37℃刺激22小时。收集培养基并且测定它们的eotaxin浓度。

对于细胞因子Eotaxin的ELISA检测：通过使用Opt EIA Set，确定Eotaxin浓度；人eotaxin来自Pharmingen；2623KI.96孔平板来自IWAKI，3801-096。按照制造者提供的用法说明进行检测。

实验4A的结果：

将转化了人支气管上皮细胞BEAS-2B的SV40用ZZ样品处理，并且用人TNF-α刺激表达eotaxin后，收集培养基并且用ELISA试剂盒测定它们的eotaxin浓度。结果总结在表4A中。发现乙醇提取级分中富含Eotaxin抑制活性，并且甚至在具有球姜酮的级分中更加富含。

表4A.ZZ样品对IL-13/TNF-α刺激的人BEAS-2B细胞的Eotaxin分泌水平的影响

对照，无ZZ处理乙醇提取物(50μg/ml)粗球姜酮(50μg/ml)释放的Eotaxin，作为％对照100 23 12

4B：ZZ样品对小鼠腹膜巨噬细胞TNF-α分泌水平的影响

实验4B的方法：

细胞培养：通过向雄性BALB/c小鼠(6-10wk龄)腹膜腔内i.p.(腹膜内)注射1ml 4％Brewer′s巯基乙酸酯培养基(Sigma，B2551)，而引出小鼠腹膜内巨噬细胞。在通过用冰冷的RPMI-1640培养基腹膜灌洗后7天，获得腹膜细胞。

药物治疗：将小鼠腹膜巨噬细胞(1×10⁵)接种在具有RPMI-1640培养基的平底96孔平板上。在收集培养基用于TNF-α检测之前，将细胞用不同浓度的ZZ-ACE样品处理20分钟，然后用1.5μg/ml LPS(脂多糖)(Sigma，L-2880)继续刺激22小时。

TNF-αELISA检测：按照制造者推荐的流程，使用R&D小鼠TNF-αELISA(Duoset，DY410)，确定TNF-α。

实验4B的结果：

当在收集培养基用于TNFα检测前，将小鼠腹膜巨噬细胞在体外用不同浓度的ZZ-ACE样品处理，然后用LPS处理时，结果表明，ZZ-ACE和富含球姜酮的纯化级分都具有对释放的TNFα的抑制活性。

表4B.ZZ样品对LPS刺激的小鼠腹膜巨噬细胞TNF-α分泌水平的影响

对照，无ZZ处理 ZZ-ACE (5μg/ml) 粗球姜酮 (5μg/ml)释放的TNF-α，作为％对照100 63 55

4C：ZZ样品对LPS刺激的小鼠脾细胞B细胞增殖水平的体外影响

实验4C的方法：

制备脾细胞：从BALB/c雄性小鼠(8-12周龄)收集小鼠脾。在补充了10％(v/v)胎牛血清(FCS；Biological Industries，04-001-1B)，5μg/ml庆大霉素(Biological Industries，03-035-1B)，1μg/ml卡那霉素(BiologicalIndustries，03-049-1B)，1.2mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，0.12mM非必需氨基酸(Gibco，11140-050)，0.2mM 2-巯基乙醇(Sigma，M7522)，和2g/l碳酸氢钠(Sigma，S5761)的10ml RPMI-1640培养基(GIBCO Cat.No.23400-013)中，将脾用10-ml注射器的推动活塞碾碎。然后，加入15mlACK裂解缓冲液(0.15M NH₄Cl，10mM KHCO₃，0.1mM Na₂EDTA，pH7.2)，以裂解红细胞。ACK裂解缓冲液处理后，通过在4℃以1500rpm离心10min而收集脾细胞，然后将脾细胞用10ml细胞培养基洗涤，并且最后重悬在培养基中。

对BALB/c小鼠脾细胞B细胞增殖的药物影响

对脾细胞的药物处理，和对B细胞增殖的刺激：将脾细胞(1.5×10⁵)接种在具有10％FCS RPMI-1640培养基的平底96孔平板上。在检测前，将脾细胞用各种浓度的ZZ样品在37℃处理2h，然后在含有10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640培养基中用15μg/ml的LPS(Sigma，L2880)在37℃处理66h，以刺激B细胞增殖。

对于B细胞的增殖检测：使用Roche BrdU ELISA试剂盒(Roche，1647229)确定增殖。将在96孔平板中的细胞首先用100μM BrdU在37℃处理6h。然后，将平板在4℃以1500rpm离心10min。不搅动细胞而移出上层清液。将平板在60℃温育1h，然后每孔加入200μl FixDenat。在RT温育30min后，倒掉FixDenat，每孔加入300μl封闭溶液。将平板在RT放置1h，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤3次，然后每孔加入100μl抗-BrdU-POD。在RT温育1h后，将平板用洗涤缓冲液洗涤4次，然后每孔加入100μl底物，并且在RT在暗处培养5min。加入25μl储液/孔而将反应终止，并且使用微量平板读数仪在450nm处测定OD。

实验4C的结果：

表4C.ZZ样品对LPS刺激的小鼠脾细胞B细胞增殖水平的体外影响

对照，无ZZ处理 水提取物 (5μg/ml) 粗球姜酮 (5μg/ml)B细胞增殖，作为％对照100 62 60

4D：ZZ样品对ConA刺激的小鼠脾细胞INF-γ分泌水平的体外影响

实验4D的方法：

脾细胞制备和药物治疗：将制备(参见实验4C)并且稀释到6×10⁵个细胞/100μl的脾细胞，接种在具有10％FCS RPMI-1640培养基的平底96孔平板上。然后，将脾细胞用各种浓度的ZZ样品(30μl)在37℃处理2h，并且最后用1μg/ml伴刀豆蛋白A(conA)刺激18h。通过ELISA检测确定培养基中的IFN-v浓度，通过MTT检测测定细胞存活力。

IFN-γELISA：使用R&D小鼠IFN-γ(Duoset，DY485)试剂盒，确定小鼠IFN-γ。按照制造者推荐的流程，进行Elisa检测。

实验4D的结果：

表4D总结了ZZ样品对ConA刺激的小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平的影响。ZZ-ACE和乙醇提取级分都表现出增加培养基中IFN-γ浓度的能力。

表4D.ZZ样品对ConA刺激的小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平的体外影响

对照，无ZZ处理 ZZ-ACE (5μg/ml) 乙醇提取物 (5μg/ml)释放的IFN-γ，作为％对照100 132 127

4E：ZZ样品对PMA/A23187刺激的小鼠EL-4细胞分泌IL-4水平的影响实验4E的方法：

细胞培养：在补充了10％(v/v)胎牛血清，5μg/ml庆大霉素(BiologicalIndustries)，1μg/ml卡那霉素(Biological Industries)，1.2mM丙酮酸钠，0.12mM非必需氨基酸，0.2mM 2-巯基乙醇，和2g/l碳酸氢钠的RPMI-1640培养基中，将EL-4细胞在5％CO₂和37℃培养在75-cm²培养瓶中。

药物处理：将EL-4细胞(1×10⁴个细胞/100μl)接种在具有10％FCS的RPMI-1640培养基的平底96孔平板中。将细胞用不同浓度的ZZ-ACE样品(30μl)在37℃处理2小时，然后在具有10％(v/v)胎牛血清(总体积150μl)的RPMI-1640培养基中用1.5ng/孔PMA和15ng/孔A23187在37℃刺激22小时。通过ELISA检测确定没有细胞的上层清液中的IL-4分泌水平，并且通过MTT检测测定细胞存活力。

IL-4 ELISA：使用R&D小鼠IL-4 ELISA(Duoset，DY404)确定IL-4。将96孔平板(IWAKI，3801-096)用100μl/孔捕获抗体(PBS中4μg/ml)包被，并且在室温下温育过夜。然后将平板用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，并且通过用300μl封闭缓冲液/孔(含有1％牛血清白蛋白和5％蔗糖的PBS)在室温温育1h进行封闭。在向孔中加入100μl测试和标准物前，将平板用洗涤缓冲液洗涤3次。将平板在室温温育2h，洗涤，并且用检测抗体[100μl/孔，在稀释试剂中(PBS含有1％牛血清白蛋白)200ng/ml]在室温温育2h。洗涤后，向每个孔中加入100μlStreptavidin-HRP，在室温温育20min，并且，洗涤后，每孔用100μl TMB(临床)温育20min。通过加入100μl的1N HCl/孔，而将反应终止，并且使用微量平板读数仪在450nm测定OD。

实验4E的结果：

表4E.ZZ样品对PMA/A23187刺激的小鼠EL-4细胞分泌IL-4水平的影响

对照，无ZZ处理 乙醇提取物 (50μg/ml) 粗球姜酮 (50μg/ml)释放的IL-4，作为％对照100 25 12

实验5：使用ZZ-ACE用于过敏性鼻炎的人志愿者

5名志愿者采用ZZ-ACE治疗过敏性鼻炎。它们的经历总结在这里。志愿者A：

文先生患有多年的严重过敏性鼻炎。为了治疗他的鼻炎，每天将新鲜采集的ZZ根(干燥前)300gm在水中煮熟，并且服用汤。治疗重复7天作为1个治疗疗程。在治疗后期他的症状显著地减轻了。3个月后，当症状复发时，成功地重复治疗疗程。

志愿者B：

另一位文先生(志愿者A的父亲)，按照志愿者A的治疗疗程，已经成功地减轻了他的过敏性鼻炎症状。当过敏性季节到来时，重复治疗疗程。志愿者C：

李先生煮了1000gm湿的新鲜的ZZ根，并且将汤在密封容器中冷冻。他每天饮用1/4的汤，连续4天，以治疗他的过敏性鼻炎。结果是令人满意的。当以后症状复发时，他再次成功地重复相同的治疗疗程。

志愿者D：

杜先生服用ZZ胶囊持续2个月，每天早上6粒胶囊和晚上6粒胶囊，以成功地治疗十分严重的过敏性鼻炎。

ZZ胶囊按照下述方法制备。将干燥的ZZ根在10倍的水(重量比重量比例)中煮熟。将汤浓缩大约5倍，然后使用淀粉作为赋形剂干燥成颗粒。将颗粒用于填充胶囊。每个胶囊含有0.5gm的颗粒，其相当于约2.0gm干燥的ZZ根或约20gm新鲜收获的ZZ根。

志愿者E：

志愿者D所用的相同批次的ZZ胶囊还用于治疗志愿者E，黄先生，持续约180天，每天3粒胶囊。在这180天中，志愿者经历了比以前更轻的过敏性问题。

本发明不受到上述实施方案的限制，上述实施方案仅仅作为实例描述，但是可以在由附上的专利权利要求所定义的保护范围内进行各种方式的改进。

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