瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱测试方法

摘要

本发明公开了一种瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱的测试方法，其步骤为：(1)将瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液制成样品溶液；(2)分别吸取瓜氨酸水溶液和样品溶液注入液相色谱仪，依次用含邻苯二甲醛的溶液和含一氯甲酸芴甲酯的溶液进行柱前衍生化；(3)液相色谱测定。本发明的测试方法为首次公开的瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱测试方法，且精密度高、稳定性好、重现性好，可作为一种较好的控制产品质量的分析测试方法应用于产品质量测试。采用本发明的测试方法首次获得了瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液的高效液相色谱对照指纹图谱，如图1、图2所示。

说明书

技术领域

本发明涉及一种产品质量测试方法，尤其涉及一种瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱的测试方法。

背景技术

瓜蒌皮为葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)或双边栝楼(Trichosanthes rosthomii Harms)的干燥成熟果皮，收载于中国药典2005版一部。其主要含有氨基酸，及少量挥发油等。

瓜蒌皮注射液是上海第一生化药业有限公司在国内首创的唯一有批准文号的瓜蒌皮药用制剂，收载于国家标准产品。其是以瓜蒌皮为原料，经水提醇沉，再通过上海树脂厂的“732”型阳离子交换树脂，而制成的灭菌水溶液。

现有技术中，尚未有关于瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的高效液相色谱指纹图谱测试方法的文献报道。瓜蒌皮的主要成分为氨基酸，但由于氨基酸本身没有紫外吸收，不能直接进行测定。但是，一级氨基酸与邻苯二甲醛(OPA)、二级氨基酸与9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)衍生化后能产生共轭基团，可在紫外或荧光检测器上产生响应。

发明内容

本发明的目的是公开一种瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱的测试方法。

本发明的测试方法包括以下步骤：

(1)将瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液制成样品溶液。

本发明中，当测试对象为瓜篓皮时，所述的步骤(1)的制备步骤为：将瓜篓皮制成粉，过筛，加水配制成溶液，称重，加热回流，冷却后称重，用水补足减失重量，摇匀，离心，取上清液即得。

其中，所述的过筛步骤所用的筛较佳的为二号筛；所述的加水配制步骤采用的比例较佳的为1g瓜篓皮/20ml水；所述的加热回流的时间较佳的为30分钟；所述的离心步骤采用的转速较佳的为5000-10000转/分钟。

本发明中，当测试对象为瓜篓皮注射液时，所述的步骤(1)的制备步骤为：将瓜篓皮注射液用水稀释制得样品溶液。

其中，所述的用水稀释步骤采用的比例较佳的为瓜篓皮注射液比水1∶5。

(2)分别吸取瓜氨酸水溶液和样品溶液注入液相色谱仪，依次用含邻苯二甲醛的溶液和含一氯甲酸芴甲酯的溶液进行柱前衍生化。

本发明中，由于瓜氨酸为瓜蒌皮中的主要成分之一，其色谱峰面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定，因此选其作为参照物，并用水作溶剂，测定结果显示该方法可行。当测试对象为瓜篓皮时，步骤(2)所述的瓜氨酸水溶液的浓度较佳的为1mg/ml；当测试对象为瓜篓皮注射液时，步骤(2)所述的瓜氨酸水溶液的浓度较佳的为0.5mg/ml。

本发明中，所述的步骤(2)中，吸取的瓜氨酸水溶液和样品溶液的体积都较佳的为1μl。

本发明中，步骤(2)所述的柱前衍生化步骤所采用的进样程序为：

①吸取硼酸盐缓冲液、含邻苯二甲醛的溶液、样品溶液，在空气中混合。

其中，所述的含邻苯二甲醛的溶液中，邻苯二甲醛的浓度较佳的为0.01g/ml。该溶液可由下述方法制得：每80mg邻苯二甲醛，取pH10.2的0.4mol/L硼酸盐缓冲液7ml，乙腈1ml，巯基丙酸125μl，混匀即得。

其中，所述的硼酸盐缓冲液较佳的为pH10.2的0.4mol/L硼酸盐缓冲液。该溶液可由下述方法制得：0.4mol/L硼酸水溶液，用0.4g/ml氢氧化钠水溶液调节pH值至10.2即得。

步骤①中，所述的硼酸盐缓冲液所吸取的体积较佳的为5μl，所述的含邻苯二甲醛的溶液所吸取的体积较佳的为1μl，所述的样品溶液所吸取的体积较佳的为1μl。所述的空气中混合的次数较佳的为10次，所述的空气中混合的体积较佳的为7μl。

②再吸取含一氯甲酸芴甲酯的溶液，在空气中混合。

其中，所述的含一氯甲酸芴甲酯的溶液中，一氯甲酸芴甲酯的浓度较佳的为0.005g/ml。该溶液可由下述方法制得：每50mg一氯甲酸芴甲酯，用适量乙腈使其溶解，用水稀释至10ml即得。

步骤②中，所述的含一氯甲酸芴甲酯的溶液所吸取的体积较佳的为1μl。所述的空气中混合的次数较佳的为30次，所述的空气中混合的体积较佳的为8μl。

③再吸取水，在空气中混合。

步骤③中，所述的水所吸取的体积较佳的为32μl。所述的空气中混合的次数较佳的为2次，所述的空气中混合的体积较佳的为20μl，所述的空气中混合的速度较佳的为仪器最大速度。

④进样。

(3)液相色谱测定。

本发明中，所述的液相色谱较佳的为高效液相色谱。本发明中，高效液相色谱的理论板数按瓜氨酸峰计算，应不低于20000。

本发明中，所述的高效液相色谱所采用的色谱柱较佳的为以十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充剂的色谱柱，如美国Hypersil公司的ODS产品，即孔径为5μm，直径为4.6mm，长度为20cm的色谱柱。

本发明中，所述的高效液相色谱所采用的流动相较佳的为：

流动相A，可由下述方法制得：取醋酸钠10.88g，加水4000ml使溶解，加三乙胺0.8ml，四氢呋喃24ml，混匀，用2％冰醋酸溶液调节pH值至7.20，即得。

流动相B，可由下述方法制得：取醋酸钠10.88g，加水800ml使溶解，用2％冰醋酸溶液调节pH值至7.20，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀即得。

本发明中，所述的高效液相色谱所采用的洗脱程序较佳的如表1所示：

              表1高效液相色谱洗脱程序

  时间(分钟) 流动相A(wt％)  流动相B(wt％)  流速(ml/min)  0  100  0  1  8  92  8  1  22  86  14  1  31  73  27  1  38  71  29  1  54  21  79  1.5  58  85  15  1.5  60  100  0  1

本发明中，所述的高效液相色谱所采用的检测波长较佳的为338nm，所采用的柱温较佳的为25℃。

采用本发明的测试方法分别对9批瓜蒌皮样品进行了测试。9批瓜蒌皮样品的高效液相色谱指纹图谱相似度均在0.94以上，且共有峰基本一致。因此，以该9批瓜蒌皮样品经“中药色谱分析和数据管理系统”计算机软件(中国药物生物制品鉴定所开发)模拟生成了瓜蒌皮高效液相色谱对照指纹图谱，如图1所示。

采用本发明的测试方法分别对9批瓜蒌皮注射液进行了测试。9批瓜蒌皮注射液样品的高效液相色谱指纹图谱相似度均在0.95以上，且共有峰基本一致。因此，以该9批瓜蒌皮注射液样品经“中药色谱分析和数据管理系统”计算机软件(中国药物生物制品鉴定所开发)模拟生成了瓜蒌皮注射液高效液相色谱对照指纹图谱，如图2所示。

本发明的实例中，采用本发明的测试方法测得瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液中的氨基酸主要为瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等。

本发明的积极进步效果在于：本发明为首次公开的瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的高效液相色谱指纹图谱测试方法。本方法有较强的专属性，且精密度高、稳定性好、重现性好，可作为一种较好的控制产品质量的分析测试方法应用于产品质量测试。采用本发明的测试方法首次获得了瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的高效液相色谱对照指纹图谱，如图1、图2所示。

附图说明

图1为瓜蒌皮高效液相色谱对照指纹图谱，图中峰S为参照物瓜氨酸的色谱峰。

图2为瓜蒌皮注射液高效液相色谱对照指纹图谱，图中峰S为参照物瓜氨酸的色谱峰。

图3为瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱，图中峰S为参照物瓜氨酸的色谱峰，指纹图谱中1号峰～7号峰分别为丝氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。

图4为9批瓜篓皮样品高效液相色谱指纹图谱。

图5为瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱，图中峰S为参照物瓜氨酸的色谱峰，指纹图谱中1号峰～7号峰分别为丝氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。

图6为9批瓜篓皮注射液样品高效液相色谱指纹图谱。

图7为测试方法精密度试验中6次进样的瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱。

图8为测试方法精密度试验中6次进样的瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱。

图9为测试方法稳定性试验中连续四天进样的瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱。

图10为测试方法稳定性试验中连续四天进样的瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱。

图11为测试方法精密度试验中同批号的6份样品的瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱。

图12为测试方法精密度试验中同批号的6份样品的瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱。

具体实施方式

实施例1 瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱测定

具体步骤为：

(1)精密称量瓜篓皮粉末约1g，过二号筛，精密加水20ml，称定重量，加热回流30分钟，冷却后，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，5000～10000转/分钟离心，取上清液，即得；

(2)配制下列溶液：

1mg/1ml瓜氨酸水溶液。

0.01g/ml邻苯二甲醛(OPA)溶液：称取邻苯二甲醛(OPA)80mg，加0.4mol/L硼酸缓冲液(pH10.2)7ml，乙腈1ml，巯基丙酸125μl，混匀，冷藏待用。

0.4mol/L硼酸缓冲液(pH10.2)：取硼酸配制成0.4mol/L的溶液，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至10.2，冷藏待用。

0.005g/ml一氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液：称取一氯甲酸芴甲酯(FMOC)50mg，用乙腈适量使其溶解，并用水稀释至10ml，冷藏待用。

分别精密吸取瓜氨酸水溶液和样品溶液各1μl，注入液相色谱仪，用0.01g/ml邻苯二甲醛溶液(OPA)与0.005g/ml一氯甲酸芴甲酯溶液(FMOC)全自动柱前衍生化，柱前衍生化进样程序为(瓶1～5分别为0.4mol/L硼酸缓冲液(pH10.2)、0.005g/ml一氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液、水、硼酸盐缓冲液、水)：

①从瓶4吸取5μl(0.4mol/L硼酸缓冲液(pH10.2))，从瓶1吸取1μl(0.01g/ml邻苯二甲醛(OPA)溶液)，吸取样品溶液1μl，空气中混合7μl，10次；

②从瓶2吸取1μl(0.005g/ml一氯甲酸芴甲酯溶液(FMOC))，空气中混合8μl，30次；

③从瓶5中吸取32μl(水)，空气中混合20μl，最大速度，2次；

④进样。

(3)高效液相色谱测定，色谱条件如下：

仪器：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，色谱工作站(Chemstation)；

色谱柱：Hypersil-ODS色谱柱(5μm，4.6mm×20cm)；

流动相A：取醋酸钠10.88g，加水4000ml使溶解，加三乙胺0.8ml，四氢呋喃24ml，混匀，用2％冰醋酸溶液调节pH值至7.20即得；

流动相B：取醋酸钠10.88g，加水800ml使溶解，用2％冰醋酸溶液调节pH值至7.20，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀即得；

检测波长：338nm；

柱温：25℃；

梯度洗脱程序如表1所示：

                表1 高效液相色谱洗脱程序

  时间(分钟) 流动相A(wt％)  流动相B(wt％)  流速(ml/min)  0  100  0  1  8  92  8  1  22  86  14  1  31  73  27  1  38  71  29  1  54  21  79  1.5  58  85  15  1.5  60  100  0  1

积分参数：斜率灵敏度(Slope Sensitivity)2；峰宽度(peak width)0.1；最小峰面积为10，最小峰高为1.5。积分结束或开始(Intergration off或on)参数如表2所示：

        表2 积分结束或开始(Intergration off或on)参数

 与参照峰(S)的相对保留时间  积分Intergration  0.00  off  0.25  on  0.40  off  0.90  on  1.50  off  2.00  on

测得瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱如图3所示。理论踏板数按瓜氨酸胺峰2计算为21788。通过22种氨基酸对照品的定位，发现瓜蒌皮药材中含有瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸七种氨基酸。在指纹图谱中具体表现为：指纹图谱中1号峰～7号峰分别为丝氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。

实施例2 瓜篓皮高效液相色谱指纹图谱测定及瓜篓皮高效液相色谱对照指纹图谱模拟合成

按照实施例1的方法，对上海第一生化药业公司提供的9批瓜篓皮样品进行测试。记录色谱图，如图4所示。用计算机模拟相似度软件计算相似度，结果如表3所示。

                    表3 9批瓜篓皮样品高效液相色谱图相似度

  样品批号  031101  030709  030801  030901  030902  030903  030904  031001  031002  相似度  0.993  0.957  1.000  0.991  0.998  0.989  0.996  0.999  0.996

将9批瓜篓皮样品高效液相色谱指纹图谱进计算机模拟合成得瓜篓皮高效液相色谱对照指纹图谱，如图1所示。

实施例3 瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱测定

按照实施例1的方法，其中步骤(1)为：精密量取瓜篓皮注射液2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得；其中，瓜氨酸水溶液的浓度为0.5mg/ml，其余步骤及参数不变。

测得瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱如图5所示。理论踏板数按瓜氨酸胺峰2计算为21788。通过22种氨基酸对照品的定位，发现瓜蒌皮注射液中含有瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸七种氨基酸。在指纹图谱中具体表现为：指纹图谱中1号峰～7号峰分别为丝氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。

实施例4 瓜篓皮注射液高效液相色谱指纹图谱测定及瓜篓皮注射液高效液相色谱对照指纹图谱模拟合成

按照实施例3的方法，对上海第一生化药业公司提供的9批瓜篓皮注射液样品进行测试。记录色谱图，如图6所示。用计算机模拟相似度软件计算相似度，结果如表4所示。

                       表4 9批瓜篓皮注射液样品高效液相色谱图相似度

  样品批号  031104  030905  030906  030907  031001  031002  031101  031102  031103  相似度  0.993  0.989  0.994  0.989  0.999  0.999  0.997  0.991  0.994

将9批瓜篓皮注射液样品高效液相色谱指纹图谱进计算机模拟合成得瓜篓皮注射液高效液相色谱对照指纹图谱，如图2所示。

实施例5 瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液液相色谱指纹图谱测试方法精密度测试

采用瓜蒌皮样品，按照实施例1的方法，连续进样分析6次，记录色谱图，如图7所示，用计算机模拟相似度计算软件计算，结果如表5所示，指纹图谱相似度均在0.948以上。

                表5 精密度试验中连续6次进样的瓜篓皮高效液相色谱图相似度

  进样号  1  2  3  4  5  6  平均  相对平均偏差  相似度  0.955  0.954  0.952  0.948  0.951  0.951  0.952  0.26％

采用瓜蒌皮注射液样品，按照实施例3的方法，连续进样分析6次，记录色谱图，如图8所示，用计算机模拟相似度计算软件计算，结果如表6所示，指纹图谱相似度均在0.99以上。

              表6 精密度试验中连续6次进样的瓜篓皮注射液高效液相色谱图相似度

  进样号  1  2  3  4  5  6  平均  相对平均偏差  相似度  0.993  0.992  0.992  0.993  0.993  0.993  0.993  0.052％

以上数据表明，本方法精密度良好。

实施例6 瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液液相色谱指纹图谱测试方法稳定性测试

在瓜蒌皮样品溶液制备后的当天，第二、三、四天，按照实施例1的方法，进行测定，记录色谱图，如图9所示，经计算机模拟相似度计算软件计算，结果如表7所示，指纹图谱相似度均在0.955以上

     表7 稳定性试验中连续四天进样的瓜篓皮高效液相色谱图相似度

  时间  第一天  第二天  第三天  第四天  平均  相对平均偏差  相似度  0.955  0.961  0.963  0.978  0.964  1.0％

在瓜蒌皮样品溶液制备后的当天，第二、三、四天，按照实施例3的方法，进行测定，记录色谱图，如图10所示，经计算机模拟相似度计算软件计算，结果如表8所示，指纹图谱相似度均在0.969以上。

表8 稳定性试验中连续四天进样的瓜篓皮注射液高效液相色谱图相似度

  时间  第一天  第二天  第三天  第四天  平均  相对平均偏差  相似度  0.984  0.97  0.969  0.969  0.973  0.8％

以上数据表明，本方法稳定性良好。

实施例7 瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液液相色谱指纹图谱测试方法重现性测试

取同一批号的6份瓜篓皮样品，按实施例1的方法测定，记录色谱图，如图11所示，用计算机模拟相似度软件计算，结果如表8所示，指纹图谱的相似度均在0.953以上。

            表9 重现性试验中同批号的6份瓜篓皮样品高效液相色谱图相似度

  样品  1  2  3  4  5  6  平均  相对平均偏差  相似度  0.957  0.955  0.956  0.955  0.955  0.953  0.955  0.14％

取同一批号的6份瓜篓皮注射液样品，按实施例1的方法测定，记录色谱图，如图12所示，用计算机模拟相似度软件计算，结果如表10所示，指纹图谱的相似度均在0.977以上。

        表10 重现性试验中同批号的6份瓜篓皮注射液样品高效液相色谱图相似度

  样品  1  2  3  4  5  6  平均  相对平均偏差  相似度  0.988  0.977  0.979  0.984  0.981  0.980  0.982  0.40％

以上数据表明，本方法重现性良好。

本发明中，瓜氨酸(批号：0875-200104)由中国药品生物制品检定所提供，瓜篓皮和瓜篓皮注射液由上海第一生化药业公司提供。所用甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。本发明所用试剂均市售可得。