滚动载荷用于培养物培养的方法及生物反应器

摘要

本发明公开了一种滚动载荷用于培养物培养的方法及生物反应器。它在包括具备O

说明书

【技术领域】

本发明涉及细胞工程和组织工程领域，特别是一种滚动载荷应用于细胞、组织培养和保持的方法及相关的生物反应器。

【背景技术】

随着组织工程的发展，人们对移植物和培养物培养条件的生物力学(biomehanics)和力学生物学(mechanobiology)研究越来越重视。最近几年相关研究者对不同的力学刺激，以优化培养物的结构和功能做了大量研究。国内有研究者采用静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应进行研究，实验表明细胞增殖数量随静张应力增高而升高[华西口腔医学杂志，2003，21(1)，57-60]；也有研究空气压应力对体外培养软骨细胞分泌细胞因子的影响[解剖学报，2001，32(4)，385-387]，离心力在体外构建组织工程软骨中的作用[中华实验外科杂志。2005，22(3)，281-283]，周期性流体应力刺激对组织工程软骨分化影响的实验研究[骨与关节损伤杂志，2003，18(9)，620-622]。这些加载方法可以促进细胞增殖或功能发挥，但和真正软骨受载是有差别的。Mauck等[J Biomech Eng，2000；122(3)：252-260]把软骨细胞接种在琼脂糖凝胶进行动态直接施压，载荷大小是使复合体变形10％，频率为1Hz，探索功能化软骨组织工程的培养，4周后发现GAG(氨基葡聚糖)升高45％，胶原含量增加37％，明显高于未加载组。Buschmann等施加1Hz，应变3％的动态压载荷进行软骨构建，实验表明硫酸软骨素增加15％-25％，脯氨酸增加10％-25％，同时，在这种力学条件下研究不同培养时间培养物弹性模量的变化。

实现组织工程化培养，生物反应器是至关重要条件。生物反应器为体外组织工程构建提供合适的生长条件，使工程化组织获得与活体组织有相似的结构与功能。合适的生物反应器的研制除考虑生化因素外还取决于对组织结构与功能关系的理解程度。

当前的生物反应器对细胞培养、组织和细胞-支架培养物培养、保持，通常使用的有四种反应器：即静态、旋转培养瓶、旋转壁式生物反应器和灌流式生物反应器[Advanced Drug Delivery Reviews 33(1998)15-30，Tissue Engineering.2003，9(3)，549-553，不同种子细胞、新型支架材料、生长因子等构成培养物，分别在这几种生物反应器中培养，主要是促进培养物形态、结构的生长。尽管现有技术中各种生物反应器的使用优化了培养物的生长，但培养物的生长、发育还是没达到临床要求。如生物反应器在组织工程化培养中，也包括各种力学环境的应用，人工组织发育不良，力学性能差、细胞退化、死亡等问题。这些问题的解决一方面需要使用当前生物反应器更进一步的实验，以及其它相关领域的发展，如细胞生物学研究，支架材料的研制，活性因子的制造；另一方面需要生物反应器培养条件的优化。力学环境在生物反应器的研制占有重要位置，力学因素影响生物体的整体，器官、组织、细胞和分子水平等各层次的生物学过程[Guilak et al.Functional Tissue Engineering，2003，Springer]。力学条件的优化十分重要。比如关节软骨组织受到压载荷作用，受到剪切力作用，但滚动载荷更能体现关节受力的本质。人在行走时关节处受到复杂力的作用，关节有大部分时间处于滚动过程，因此滚动作用可能是关节软骨合适的力学环境，因此滚动载荷的加入可能优化生物反应器的力学条件。

专利WO2004/046304给出了压力和剪应力耦合作用的生物反应器；发明专利(申请号200480038317.9，公开号CN 1898375A)介绍了用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应器。以软骨组织工程为例，Schulz和Bader，Ivan Martin总结了组织培养时的环境[TRENDS in Biotechnology Vol.22No.2，2004，pp80-86；Eur Biophys J，DOI 10.1007/s00249-007-0139-1，2007]。包括(a)为电场；(b)锥形粘度计条件，细胞在旋转锥形体下方受到剪切力作用；(c)旋转壁式生物反应器给细胞提供微重力环境，传质过程较好；(d)单项灌流系统；(e)拉伸条件；(f)水压及灌流条件；(g)直接压缩。其后介绍了各种培养条件的耦合系统；特别是各种力学条件的联合使用。但都没有涉及滚动加载的培养。其它组织的培养中，如皮肤按生理过程也需要滚动加载的培养.

【发明内容】

本发明的目的旨在为克服现有技术的不足，而提供一种主要是将滚动载荷应用于培养物培养的方法及专用的生物反应器。在通常细胞、组织培养的条件下，施加滚动载荷形成培养物生长的力学环境，培养物在这种条件下生长，可克服培养物生长、发育的缺陷。培养后培养物可作为移植物应用于临床或在生物学检测等方面应用。

本发明为实现上述目的提供了一种滚动载荷用于培养物培养的方法。包括具备O₂、CO₂和温度调节、细胞培养的培养箱，及保持培养液新鲜的灌流等条件，其特征在于所说的培养方法还包括：将培养物固定于培养室底板；在培养期间，对培养物表面施加滚动的力学载荷，其中：滚动速度按生理载荷为0.1-15cm/s，加载体往复滚动频率为0.1-3Hz，加载时间为每24h加载1-3次，每次10min-180min，培养1-60天；滚动加载处培养物变形5％-40％。

所说的培养物是：细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组织。所说的培养物表面可以直接施加滚动载荷或覆盖弹性硅胶膜间接受载。

本发明为滚动载荷用于培养物培养的方法设计了一种生物反应器。包括底板，与底板连接的培养室，培养室内的培养液灌注系统，及加载机构，其特征在于所说的加载机构是一个使加载体作纯滚动的机构；所说的滚动加载体置于培养室内，滚动加载体轴的两端通过一个叉形连杆连接在由电机带动的曲柄轴上；所说的滚动加载体通过轴部支撑结构调整滚动加载体距离培养室底面的高度。

本发明为滚动载荷用于培养物培养的方法还设计了另一种生物反应器，包括底板，与底板连接的培养室，培养室内的培养液灌注系统，及加载机构，其特征在于所说的生物反应器是连接在一个动力源上的多组生物反应器；其中：每个生物反应器的加载机构是一个使加载体作纯滚动的机构，滚动加载体置于培养室内，滚动加载体通过轴部支撑结构调整滚动加载体距离培养室底面的高度；所说的多组生物反应器的滚动加载体轴之间通过连接杆连接，而第一组的滚动加载体轴通过叉形连杆连接在由电机带动的曲柄轴上。

本发明的有益效果是：滚动载荷比其加载方式更接近某些组织生长发育的力学环境，滚动载荷条件可能有利于细胞、组织的生长、发育。实验表明滚动载荷组的软骨细胞总量远远高于静态培养组，达到1.5-3倍。

【附图说明】

图1为生物反应器立体示意图；

图2为生物反应器俯视示意图；

图3为生物反应器主视示意图；

图4为生物反应器侧视示意图；

图5为多组生物反应器组合示意图。

图中：1电机；2驱动轴；3曲柄轴；4培养室上盖；5叉形连杆；6培养液出口；7培养室；8培养物；9高度调节螺杆；10支板；11轨道；12导轨轴；13加载体轴；14导向轮；15滚动加载体；16培养液进口；17底板。

以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。

【具体实施方式】

在无菌条件下把目标细胞和支架材料复合、离体组织或临床移植物转移到消毒过的培养室内，按细胞、组织培养标准过程操作；培养在培养箱中进行，培养箱内有O₂、CO₂、温度控制，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，培养液中加入活性因子。力学环境是对培养物施加滚动载荷，加载体是圆柱体，其重量通过内部配重变换重量。滚动载荷以使培养物变形大小为指标，确定滚动强度大小。以软骨为例，培养物变形为5％-25％。加载体靠自重可使培养物接触部分达到较大变形，通过高度调节螺杆旋转，改变轨道高度，也就改变导向轮的高度，同时改变加载体的水平位置，这样调整培养物到合适的变形。加载体轴可以在滚动轨道上纯滚动，且是来回滚动，滚动速度按生理载荷约为0.1-15cm/s，是由电动机驱动，电动机由计算机控制，这样实现滚动载荷的施加。加载时间可为以24h加载1次，1次加载10min-180min或24h内1-3次加载，培养1-60天；按生理载荷作用来回滚动的频率为0.1-3Hz；来回滚动频率为0.1-3Hz。最后把优化培养的培养物应用到临床或其它方面检验。

如图1-4所示。生物反应器包括在底板17上安装的培养室7，滚动加载机构，培养液灌注系统和上盖4等。各系统由计算机控制，在培养箱内运行，培养室设有培养液进口16和培养液出口6。生物反应器的加载机构是一个使加载体作纯滚动的机构。滚动加载体15置于培养室内，滚动加载体轴的两端通过一个叉形连杆5连接在由电机1带动的曲柄轴3上。滚动加载体通过轴部支撑结构调整滚动加载体距离培养室底面的高度。

这种调整高度的机构，可以是滚动加载体轴的两端于培养室的外侧各装有一个导向轮，与导向轮接触的轨道通过高度调节螺杆调整滚动加载体距离培养室底面的高度。即：与轨道11接触，在轨道11上做纯滚动；轨道11可沿导轨轴12上下滑动，通过高度调节螺杆9调整轨道11高度，也调整导向轮14的高度，这样就调整了滚动加载体15距离培养室底面的高度。该导向轮的直径可与滚动加载体的直径相等或不等。此外，调整高度的机构也可以是将滚动加载体轴的两端支撑在支撑板(图中未显示)上，通过调整支撑板高度，来调整滚动加载体距离培养室底面的高度。

本发明的滚动加载过程：电机1带动驱动轴2驱动曲柄轴3，带动叉形连杆5，通过加载体轴13拉动滚动加载体15作往复直线滚动。导向轮14沿轨道11滚动，轮与轨之间磨擦足够大，轮只能纯滚动。滚动加载体内部可添加不同配重，配重分别为10g，20g，50g，100g。不同配重或组合可调整滚动加载体的重量。滚动加载体重力作用下可使滚动加载处培养物最大变形50％。同时通过高度调节螺杆9调整滚动加载体的水平位置，使培养物8滚动加载处达到合适的变形。

实例1

用于移植物的培养方法

以软骨组织工程为例，培养物在生物反应器中培养，其受到滚动载荷作用，刺激培养物的生长、发育。

从患者非负重区活检获得一块软骨，D-Hanks液充分漂洗，再初步切碎1-2mm3后移入青霉素小瓶，用胰酶、胶原酶用消化后，离心分离获得软骨细胞，移入培养瓶中加培养液培养，扩增后细胞备用。

消化收集扩增的软骨细胞。利用纤维蛋白原溶液重悬细胞成为2×106/ml，通过Y形共推针头混合，注入模具中，37℃静置10min充分固化，成形复合体。然后移到培养室内，固定到培养室底板，加培养液培养。

反应器放在培养箱内，培养箱内有O₂、CO₂、温度自动控制，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，灌注速度为0.01ml/min。培养液中加入标准浓度的胰岛素样生长因子(IGFs)。

施加滚动载荷，培养物变形为10％；加载体来回滚动频率0.5Hz，24h内总共加载1h。施加滚动载荷20min，间隔1h后，再滚动加荷20min，间隔1h后再滚动加载20min。培养30天，培养物生长良好，取出培养物用于临床治疗软骨缺损。

实例2

多个培养室同时培养，多个培养物同时受滚动载荷(如图5所示)。

过程与实例1相同，培养物分别固定各个培养室中，同样在培养箱中进行培养，滚动加载过程中电机同时驱动带动两组滚动加载体滚动。

实例3

用于细胞力学响应的研究

以软骨组织工程为例，培养物在生物反应器中培养，其受到滚动载荷作用，刺激支架内细胞生物学活动。

采用软骨细胞分离、培养的标准方法，获得第二代软骨细胞，或采用软骨细胞系。把定量细胞种植在规则、多孔弹性胶原支架上，然后移到培养室内，固定到培养室底板，加培养液培养。

反应器放在培养箱内，培养箱内有O₂、CO₂、温度自动控制，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，灌注速度为0.01ml/min。培养液中加入标准浓度的胰岛素样生长因子(IGFs)。

施加滚动载荷，培养物变形为10％；加载体来回滚动频率1Hz，24小时加载1h，其中施加滚动载荷20min，间隔1h后再滚动加荷20min，间隔1h后再滚动加载20min。培养4天，取出复合体检测细胞总量的变化，滚动载荷组的细胞总量远远高于静态培养组，达到1.5-3倍。滚动载荷条件可能有利于细胞、组织的生长、发育。