用作细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂的吡唑并嘧啶类衍生物

摘要

本发明公开了用作细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂的吡唑并嘧啶类衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，结构式如式I所示，它可以用于制备治疗癌症的药物，式I中的取代基X、Y、Q

说明书

技术领域：

本发明涉及通式I所示的吡唑并[1，5-a]嘧啶类衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，和以该衍生物为活性成分的药物组合物，以及在制备细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂以及用于治疗和/或预防各种癌症的药物中的用途。

背景技术：

癌症，又称为恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的一类常见病，目前癌症的死亡率仍在上升，对常见的实体瘤还缺乏有效的药物。现有的化疗药物大多通过干扰细胞分裂过程的某些环节杀死癌细胞，其作用靶点在癌细胞和正常细胞中并无本质区别，在杀死癌细胞的同时，也会产生毒副作用。

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下次有丝分裂结束所经历的整个过程。细胞周期运行与否受控于精密的细胞周期调控机制。该机制的核心是细胞周期的正性调节因子和细胞周期负性调节因子在细胞周期内协调作用，通过对相应的底物磷酸化，驱使着细胞完成细胞周期。细胞正性调节因子是一组蛋白激酶，称为细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent-kinase，CDKs)，目前已找到CDK1-77，它们在整个细胞周期中的含量中相对稳定。细胞周期的负性调节因子则是阻断细胞周期、抑制细胞分化的抑制蛋白，称为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂。

细胞周期与多种人类疾病相关，其中最重要的是与癌症具有密切的关系。癌症的主要原因是细胞周期失调后导致的细胞无限制分化和增殖的异常，从而危及机体的整体安全。细胞的去分化和恶性生长往往与细胞周期调节因子密切相关。正性细胞周期调节因子过度表达，可以引起细胞分裂失控，导致癌症形成。在子官瘤、乳腺癌和肺癌中CDK2-Cyclin E不正常的表达是很典型的特征。

CDKs活性的调控是很有前途的抗癌作用靶点，目前有很多新颖的CDKs抑制剂，特别是CDK2抑制剂正处于临床前或临床研究中，被证明有很好的疗效。

本发明人在参考文献的基础上，设计合成了一系列的咪唑并[1，5-a]嘧啶类衍生物，经体外抗肿瘤活性筛选，表明具有抗肿瘤活性。

发明内容：

本发明涉及定义如下的通式I的衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，

其中

Q₁和Q₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基、C₂-C₁₀烯基和C₂-C₁₀炔基，可以被1～3个相同或不同的R₄任选取代；

或Q₁和Q₂与和它们所连接的氮原子一起形成5-10元杂环基，所述杂环基可以含有1-4个选自N、O和S的杂原子，任选包括1或2个碳碳双键或叁键，所述杂环基可以被1～3个相同或不同的R₄任选取代；

或者Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为-(CH₂)_m-Ar₁；

当X为直接键、-O-(CH₂)_p-时，Y为

当X为时，Y为或-OR₃；当X为时，Y为Ar₂；

Ar₁为C₆-C₁₀芳基、5-10元杂芳基，其中，所述杂芳基可以含有1-4个选自N、O或S的杂原子，并且Ar₁可以被1-3个相同或不同的R₅任选取代；

Ar₂为C₆-C₁₀芳基、5-10元杂芳基，其中，所述杂芳基含有1-4个选自N、O或S的杂原子，并且Ar₂可以被1-3个相同或不同的R₆任选取代；

R₁和R₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基，C₂-C₁₀烯基和C₂-C₁₀炔基，C₆-C₁₀芳基，C₆-C₁₀芳基C₁-C₄烷基，5-10元杂环基，5-10元杂环基C₁-C₄烷基，5-10元杂芳基，5-10元杂芳基C₁-C₄烷基，可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；所述环烷基可以包括1～2个碳碳双键或叁键，所述杂环基和杂芳基含有含有1-4个选自N、O或S的杂原子；R₁和R₂可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；

或R₁和R₂与和它们所连接的氮原子一起形成5-10元杂环基或5-10元杂芳基，所述杂环基和杂芳基可以含有1-4个选自N、O和S的杂原子，任选包括1或2个碳碳双键或叁键，可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；

R₃为氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基、C₆-C₁₀芳基、5-10元杂环基、5-10元杂芳基，可以被1～3个相同或不同的R₈任选取代；

R₄、R₇、R₈独立地选自羟基、卤素、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基甲基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基、C₃-C₇环烷基，所述环烷基可以包括1～2个碳碳双键或叁键；

R₅、R₆独立地选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、羟基、任选被羟基、氨基或卤代的C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、卤代、C₁-C₄烷基酰基、硝基、氰基、氨基、C₁-C₆烷基酰胺基或被单或二(C₁-C₄烷基)取代的胺基、C₁-C₄烷氧基甲基、氨基甲酰基、N-C₁-C₄烷基氨基甲酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基甲酰基、氨基磺酰基、N-C₁-C₄烷基氨基磺酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基磺酰基、C₁-C₃亚烷基二氧基；

m为0～4之间的整数；

p、q为1～4之间的整数；

r为0～2之间的整数。

本发明优选Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为-(CH₂)_m-Ar₁的通式I衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物。

本发明还优选定义如下的通式I衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，

其中

Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为-(CH₂)_m-Ar₁；

当X为直接键、-O-(CH₂)_p-时，Y为

当X为时，Y为或-OR₃；

当X为时，Y为Ar₂；

Ar₁为苯基或者被1-3个相同或不同的R₅任选取代的苯基；

Ar₂为苯基或者被1-3个相同或不同的R₆任选取代的苯基，或者为含有1-4个选自N、O或S的杂原子的5-6环杂芳基，所述杂芳基可以被1-3个相同或不同的R₆任选取代；

R₁和R₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基、C₆-C₁₀芳基、C₆-C₁₀芳基C₁-C₄烷基、5-10元杂环基、5-10元杂环基C₁-C₄烷基、5-10元杂芳基、5-10元杂芳基C₁-C₄烷基，可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；所述环烷基可以包括1～2个碳碳双键或叁键，所述杂环基和杂芳基含有含有1-4个选自N、O或S的杂原子；R₁和R₂可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；

或R₁和R₂与和它们所连接的氮原子一起形成5-10元杂环基或5-10元杂芳基，所述杂环基和杂芳基可以含有1-4个选自N、O和S的杂原子，任选包括1或2个碳碳双键或叁键，可以被1～3个相同或不同的R₇任选取代；

R₃为氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基，可以被1～3个相同或不同的R₈任选取代；

R₇、R₈独立地选自羟基、卤素、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基甲基、C₃-C₇环烷基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基，所述环烷基可以包括1～2个碳碳双键或叁键；

R₅、R₆独立地选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、羟基、任选被羟基、氨基或卤代的C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、卤代、C₁-C₄烷基酰基、硝基、氰基、氨基、C₁-C₆烷基酰胺基或被单或二(C₁-C₄烷基)取代的胺基、C₁-C₄烷氧基甲基、氨基甲酰基、N-C₁-C₄烷基氨基甲酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基甲酰基、氨基磺酰基、N-C₁-C₄烷基氨基磺酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基磺酰基、C₁-C₃亚烷基二氧基；

m为0～4之间的整数；

p、q为1～4之间的整数；

r为0～2之间的整数。

本发明特别优选定义如下的通式I衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，

其中

Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为苯基或者被1-3个相同或不同的R₅任选取代的苯基；

当X为直接键、-O-(CH₂)_p-时，Y为

当X为时，Y为或-OR₃；

R₁和R₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、C₃-C₆环烷基甲基，C₃-C₆环烷基乙基，苯基，苯甲基，苯乙基，呋喃甲基，呋喃乙基，吡啶甲基，吡啶乙基，环己烯甲基，环己烯乙基，环戊烯甲基，环戊烯乙基；

或R₁和R₂与和它们所连接的氮原子一起形成1-吡咯烷基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-甲基哌嗪基、1-咪唑基、2-甲基-1-咪唑基、1-三氮唑基、1-四氮唑基；

R₃为氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基；

R₅独立地选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、羟基、任选被羟基、氨基或卤代的C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、卤代、C₁-C₄烷基酰基、硝基、氰基、氨基、C₁-C₆烷基酰胺基或被单或二(C₁-C₄烷基)取代的胺基；C₁-C₄烷氧基甲基、氨基甲酰基、N-C₁-C₄烷基氨基甲酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基甲酰基、氨基磺酰基、N-C₁-C₄烷基氨基磺酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基磺酰基、C₁-C₃亚烷基二氧基；

p、q为1～4之间的整数。

本发明还特别优选定义如下的通式I衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，

其中

Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为苯基或者被1-3个相同或不同的R₅任选取代的苯基；

当X为直接键、-O-(CH₂)_p-时，Y为

当X为时，Y为或-OR₃；

R₁和R₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、C₃-C₆环烷基甲基、C₃-C₆环烷基乙基、苯基、苯甲基、苯乙基、呋喃甲基、呋喃乙基、吡啶甲基、吡啶乙基、环己烯甲基、环己烯乙基、环戊烯甲基、环戊烯乙基；

或R₁和R₂与和它们所连接的氮原子一起形成1-吡咯烷基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-甲基哌嗪基、1-咪唑基、2-甲基-1-咪唑基、1-三氮唑基、1-四氮唑基；

R₃为氢、C₁-C₄烷基、C₃-C₇环烷基；

R₅独立地选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、羟基、任选被羟基、氨基或卤代的C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、卤代、C₁-C₄烷基酰基、硝基、氰基、氨基、C₁-C₆烷基酰胺基或被单或二(C₁-C₄烷基)取代的胺基、C₁-C₄烷氧基甲基、氨基甲酰基、N-C₁-C₄烷基氨基甲酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基甲酰基、氨基磺酰基、N-C₁-C₄烷基氨基磺酰基、N，N-二C₁-C₄烷基氨基磺酰基、C₁-C₃亚烷基二氧基；

p为1或2；

q为1～4之间的整数。

本发明还特别优选定义如下的通式I衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物，

其中

Q₁和Q₂其中之一为H，另一个为苯基或者被1-3个相同或不同的R₅任选取代的苯基；

当X为直接键、-O-(CH₂)_p-时，Y为

当X为时，Y为或-OR₃；

R₁和R₂相同或不同，分别独立地选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、C₃-C₆环烷基甲基、C₃-C₆环烷基乙基、苯基、苯甲基、苯乙基、呋喃甲基、呋喃乙基、吡啶甲基、吡啶乙基、环己烯甲基、环己烯乙基、环戊烯甲基、环戊烯乙基；

或R₁和R₂与和它们所连接的氮原子一起形成1-吡咯烷基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-甲基哌嗪基、1-咪唑基、2-甲基-1-咪唑基、1-三氮唑基、1-四氮唑基；

R₃为氢、C₁-C₄烷基、C₃-C₇环烷基；

R₅选自氟、氯、溴、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、氰基、氨基、亚甲基二氧基，氨基磺酰基、氨基甲酰基、二(C₁-C₄烷基)取代的胺基。

p为1或2；

q为1～4之间的整数。

而且，按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明的上式I的吡唑并[1，5-a]嘧啶类衍生物可以与酸生成它的药物上可接受的盐。酸可以包括无机酸或有机酸，与下列酸形成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、洒石酸、苯磺酸、苯甲酸或对甲苯磺酸等。

本发明衍生物可以以立体异构体形式存在，这些立体异构形式可以是对映体或非对映体。本发明既涉及对映体或非对映体，也涉及它们各自的混合物，象非对映体一样，可按照自身已知的方法将外消旋形式分离成为立体异构的单一组分。

此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。依据本发明，前药是通式I的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

除非另外指出，本发明所用的术语“卤代”是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“亚烷基”是指直链或支链的亚烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；杂芳基包括含有一个或多个选自O、N和S的杂原子，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的，环状体系是芳香性的，可以举出例如咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、(1，2，3)-和(1，2，4)-三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、吲哚基、喹啉基等；饱和杂环基包括含有一个或多个选自O、N和S的杂原子，环状体系可以是单环或多环的，可以举出例如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、咪唑烷基和噻唑啉基等。

本发明的特定衍生物可具有不对称中心，因此以不同的对映体和非对映体的形式存在。本发明涉及本发明衍生物的所有旋光异构体、消旋体及其混合物。“消旋体”是指含有等量的一对对映异构体的混合物。

本发明包括药物组合物，该组合物含有上式I的吡唑并[1，5-a]嘧啶类衍生物，及其光学活性体和其药物上可接受的盐、水合物或作为活性成分，以及药物上可接受的赋型剂。所述药物上可接受的赋型剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的衍生物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

本发明的药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

通过体外抗肿瘤试验，我们发现本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如乳腺、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺和卵巢的癌。

根据本发明的衍生物可作为活性成分用于制备治疗和/或预防各种癌症，本发明也提供治疗或预防上述疾病的方法，包括给予患有或易患有此病的病人治疗有效量的根据本发明的衍生物。上式I的吡唑并[1，5-a]嘧啶类衍生物用于患者的临床剂量必需依赖被治疗的主体、给药的具体途径、被治疗疾病的严重性而变化，而最佳剂量由治疗具体患者的医生确定。

本发明活性化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者可以与一种或多种其它抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。在下述实施例中，除非另有说明，否则具有一个手性中心的分子以外消旋混合物的形式存在。除非另有说明，否则具有两个或更多个手性中心的分子是作为非对映体的外消旋混合物存在。单独的对映体/非对映体可通过本领域技术人员已知的方法获得。

下面的合成路线描述了本发明的式I衍生物的制备，所有的原料都是通过这些示意图中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终衍生物都是通过这些示意图中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些示意图中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。

                             路线1

按照本发明的式I衍生物，在路线1中，X为直接键、-O-(CH₂)_p-、-S-，其它各取代基如发明内容部分所定义。

当X为-SO-，或-SO₂-时，即按照路线1的方法首先制得式II化合物，，然后采用适当的氧化剂(单氧化采用过硼酸钠，双氧化采用钨酸钠和双氧水)进行氧化反应制得目标产物(路线2)。

                             路线2

具体实施方式：

实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。衍生物的核磁共振氢谱用Bruker ARX-300测定，质谱用Agilent 1100LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

实施例1：3-氰基-5-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

步骤A：乙氧甲叉基丙二腈的制备

将132g(2.0mol)丙二腈和440g(4.32mol)乙酸酐加到1L的三颈瓶中，加热至110℃反应45分钟后，滴加304g(2.1mol)原甲酸三乙酯，约用40分钟。此反应是放热反应，控制滴加的速度使温度保持在108-120℃。滴加原甲酸三乙酯完毕后开始常压蒸馏，用配有搅拌及装有68mL氨水(1.0mol)和132mL水的混合液的容器来接收馏分，直到反应容器内温度超过115℃，约用1.5小时。然后逐渐减压(＞100mm)，继续蒸馏1小时至反应容器内温度升到125℃。在蒸馏最开始阶段，接收瓶会有铵盐固体挂壁，且液体分成两相。随着蒸馏液中醋酸量相对增加，铵盐逐渐溶解，蒸馏最后阶段液体也变成均相。

步骤B  3-氨基-4-氰基吡唑的制备

在1L三颈瓶中将乙氧甲叉基丙二腈加热到65℃，然后在约半小时内滴加400mL异丙醇。滴加过程中，温度要始终保持65℃以避免结晶固化，混合物的温度也不宜超过65℃，因为异丙醇和乙氧甲叉基丙二腈混合会放热，温度过高会导致产品收率低。滴加完毕后使溶液冷却到10℃，再滴加112g(2.24mol)水合肼，在外浴冷却下滴加约2.5小时，得到浆状物。加热至20℃反应1小时，然后在35℃反应1小时，再把混合物加热到65℃后，在60℃-63℃减压蒸掉异丙醇。接着每20分钟滴加一份50mL水，共滴加350mL水，需要2.5小时，最后得到440mL蒸馏液。得到黑红色的液体在0℃-5℃冷却2小时，过滤得到浅褐色的固体，用150mL冷水清洗，然后再用400mL冷水搅拌成浆状再过滤，150mL冷水清洗。真空干燥得到134.5g固体，两步收率62％。

步骤C  3-氰基-5-氯甲基-7-羟基吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

在250mL三颈瓶中用100mL冰乙酸作为溶剂，加入10.8g(0.1mol)3-氨基-4-氰基-吡唑和23g(0.15mol)氯乙酰乙酸乙酯，开始阶段原料不溶解，加热至80℃左右原料基本溶解，回流反应4小时，有固体生成，反应完毕后将反应液冷却到室温，过滤，用冰醋酸清洗，自然干燥，得到乳黄色固体19.7g，收率95％。

步骤D  3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

在带有机械搅拌的1L三颈瓶中加入3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶82g(0.36mol)和34g(0.43mol)吡啶，再加入90g(0.59mol)POCl₃，产生大量的烟雾，原料固化变硬，用空气浴慢慢加热，当温度达到85℃时，混合物呈熔融状态，使用机械搅拌，在120℃反应1小时，当反应液变成黑亮的浆状物反应完毕。将反应液降温至60℃时，加入500mL氯仿搅拌1小时，冷却至0-5℃后加入300mL冷水，过滤除掉少量不溶固体，分液，再用300mL冷水清洗氯仿层直至中性，减压蒸馏脱掉氯仿，自然干燥，得到土黄色固体70g，收率78％。

步骤E  3-氰基-5-氯甲基-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

用50mL异丙醇作溶剂，在100L三颈瓶中加入8g(0.035mol)3-氰基-5-氯甲基-7-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶和7.9g(0.045mol)的3-氯-4-氟苯胺，加热至60℃，开始原料不溶解，随着温度的升高原料逐渐溶解，反应半个小时后有固体生成，2小时后反应完毕。反应液冷却到室温，过滤，固体用冷的异丙醇清洗两次，自然干燥，得到白色固体10.7g，收率84％。

步骤F  3-氰基-5-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

将3-氰基-5-氯甲基-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶1g(0.0027mol)和0.8g(0.006mol)K₂CO₃及0.6g(0.006mol)N-甲基哌嗪一起加入到装有20mL DMF的50mL三颈瓶中，油浴中加热至50℃，1小时后反应完毕，冷却，将反应液倒入装有100mL的250mL烧杯中，有白色固体析出，用布氏漏斗过滤，再用10mL冷水清洗三次，然后自然干燥，得到固体1g，收率85％。

MS：(M+H)432.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.13(s，3H)，2.26(t，4H)，2.49(t，4H)，3.53(s，2H)，6.62(s，1H)，7.50(d，2H)，7.58(d，2H)，8.73(s，1H)，10.53(s，1H).

按照实施例1的制备方法，选择适当的原料，制得实施例2-实施例28化合物。

实施例2  3-氰基-5-[(1-四氢吡咯基)甲基]-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)387.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.69(3，4H)，2.50(t，4H)，3.68(s，2H)，6.74(s，1H)，7.65(d，2H)，7.82(d，2H)，8.73(s，1H)，10.67(s，1H).

实施例3  3-氰基-5-[(N，N-二甲基胺基)甲基]-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)377.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.18(s，6H)，3.45(s，2H)，6.66(s，1H)，7.50(d，2H)，7.50(d，2H)，8.60(s，1H)，10.53(s，1H).

实施例4  3-氰基-5-[(N-甲基-N-乙基胺基)甲基]-7-[(3-氯苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)341.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.17(t，3H)，2.50(s，3H)，2.94(q，2H)，4.15(s，2H)，6.75(s，1H)，7.41(d，1H)，7.47(d，1H)，7.54(d，1H)，7.57(s，1H)，8.82(s，1H)，10.47(s，1H).

实施例5  3-氰基-5-[(1-四氢吡咯)甲基]-7-[(2-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)337.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.90(3，4H)，3.09(t，4H)，4.27(s，2H)，6.28(s，1H)，7.36(d，1H)，7.45(1H)，7.48(1H)，7.53(1H)，8.83(s，1H)，10.57(s，1H).

实施例6  3-氰基-5-[(1-哌啶基)甲基]-7-[[3，5-双(三氟甲基)苯基]胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)469.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.36(m，2H)，1.42(m，4H)，2.36(t，4H)，3.27(s，2H)，6.22(s，1H)，7.48(s，1H)，7.56(s，2H)，8.21(s，1H).

实施例7  3-氰基-5-[(1-哌啶基)甲基]-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)351.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.45(m，2H)，1.59(3，4H)，2.82(t，4H)，3.99(s，2H)，6.33(s，1H)，7.37(t，1H)，7.50(m，3H)，8.81(s，1H)，10.70(s，1H).

实施例8  3-氰基-5-[(N-甲基-N-丙基胺基)甲基]-7-[(3-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)339.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：0.88(t，3H)，162(q，2H)2.60(s，3H)，2.83(q，2H)，4.13(s，2H)，6.81(s，1H)，7.16(t，1H)，7.35(m，2H)，7.55(q，1H)，8.82(s，1H)，10.47(s，1H).

实施例9  3-氰基-5-[[N-甲基-N-(2-羟基乙基)胺基]甲基]-7-[(3-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)341.

H¹-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.25(s，3H)，2.49(t，2H)，3.47(t，2H)，3.61(s，2H)，4.20(s，1H)，6.81(s，1H)，7.16(t，1H)，7.35(m，2H)，7.53(q，1H)，8.74(s，1H)，10.51(s，1H).

实施例10  3-氰基-5-[(1-四氢吡咯基)甲基]-7-[(4-甲氧基苯基)甲胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)363

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.75(3，4H)，2.66(t，4H)，3.71(s，3H)，3.86(s，2H)，4.57(d，2H)，6.52(s，1H)，6.90(d，2H)，7.35(d，2H)，8.66(s，1H)，9.18(t，1H).

实施例11  3-氰基-5-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-7-[(4-甲氧基苯基)甲胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)392.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.16(s，3H)，2.24(t，4H)，2.32(t，4H)，3.46(s，2H)，3.72(s，3H)，4.57(d，2H)6.38(s，1H)，6.90(d，2H)，7.30(d，2H)，8.63(s，1H)，9.12(t，1H).

实施例12  3-氰基-5-[(N，N-二甲基胺基)甲基]-7-[(4-甲氧基苯基)甲胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)337，(2M+Na⁺)695.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.15(s，6H)，3.43(s，2H)，3.71(s，3H)，4.57(d，2H)，6.43(s，1H)，6.90(d，2H)，7.32(d，2H)，8.63(s，1H)，9.04(t，1H).

实施例13  3-氰基-5-[[N-甲基-N-(2-羟基乙基)胺基]甲基]-7-[(4-甲氧基苯基)甲胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)367.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.20(s，3H)，2.46(t，2H)，3.48(m，2H)，3.56(s，2H)，3.71(s，3H)，4.25(t，1H)，4.55(d，2H)，6.59(s，1H)，6.90(d，2H)，7.32(d，2H)，8.62(s，1H)，9.04(t，1H).

实施例14  3-氰基-5-[[2-(1-环己烯基)乙胺基]甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)441.

实施例15  3-氰基-5-[2-(4-吗啉基)乙胺基]甲基-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)446.

实施例16  3-氰基-5-[[3-(2-甲基-1-哌啶基)丙胺基]甲基]-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)472.

实施例17  3-氰基-5-[(2-呋喃基甲胺基)甲基]-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)413.

实施例18  3-氰基-5-(戊胺基甲基)-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)403

实施例19  3-氰基-5-[(3-异丙氧基丙胺基)甲基]-7-[(4-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)383.

实施例20  3-氰基-5-[[3-(4-吗啉基)丙胺基]甲基]-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)428.

实施例21  3-氰基-5-[[(1-苯甲基-4-哌啶基)胺基)甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)506.

实施例22  3-氰基-5-[((2-呋喃甲基)胺基)甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)413.

实施例23  3-氰基-5-[[(2-(1-环己烯基)乙胺基]甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)441.

实施例24  3-氰基-5-[[3-(N-甲基苯胺基)丙胺基]甲基]-7-[(4-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)480.

实施例25  3-氰基-5-[[(4-环己基胺基)丁胺基]甲基]-7-[(4-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)436.

实施例26  3-氰基-5-[(3-丁氧基丙胺基)甲基]-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)415。

实施例27  3-氰基-5-[[(3-吡啶基)甲胺基]甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)424.

实施例28  3-氰基-5-[(环己基甲基胺基)甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)429.

实施例29  3-氰基-5-[[2-(4-吗啉基)乙氧基]甲基]-7-[(3-三氟甲基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶

按照实施例2化合物的制备方法步骤A～E制备得到3-氰基-5-氯甲基-7-(3-三氟甲基苯胺基)吡唑并[1，5-a]嘧啶，然后按照以下方法制得目标产物。

将干燥的20mL DMF和0.6g(0.0062mol)的2-(4-吗啉基)乙醇加入到50mL三颈瓶中，然后加入60％的NaH 0.3g(0.0062mol)，搅拌，放热并且会有气泡产生。升温到35℃，再搅拌半小时，加入3-氰基-5-氯甲基-7-(3-三氟甲基苯胺基)吡唑并[1，5-a]嘧啶1g(0.00284mol)，保持这个温度2小时后反应完毕。把反应液倒入装有150mL水的250mL烧杯中，有固体产生，静置半天，过滤，用20mL水清洗，自然干燥，得到白色固体1.1g，收率86％。

MS：(M+H).

H¹-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.32(t，4H)，2.46(t，2H)，3.43(t，4H)，3.61(t，2H)，4.54(s，1H)，6.58(s，1H)，7.16(t，2H)，7.35(t，1H)，7.53(s，1H)，8.77(s，1H)，10.71(s，1H).

按照实施例29的制备方法制得实施例30～36化合物。

实施例30  3-氰基-5-[[2-(4-吗啉基)乙氧基]甲基]-7-[(3，4-二氯苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)447.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：2.89(t，4H)，2.99(t，2H)，3.66(t，4H)，3.76(t，2H)，4.59(s，1H)，6.60(s，1H)，7.55(dd，1H)，7.77(m，2H)，8.78(s，1H)，10.51(s，1H).

实施例31  3-氰基-5-[[2-(N，N-二乙基胺基)乙氧基]甲基]-7-[(2-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+Na)383.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.11(m，6H)，3.10(q，4H)，3.27(t，2H)，3.82(t，2H)，4.60(s，1H)，6.31(d，1H)，7.53(m，4H)，8.79(s，1H)，10.51(s，1H).

实施例32  3-氰基-5-[[2-(1-哌啶基)乙氧基]甲基]-7-[(3-氯苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)411.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.49(m，2H)，1.68(m，4H)，3.11(t，4H)，3.22(t，2H)，3.84(t，4H，)，4.60(s，1H)6.57(s，1H)，7.55(dd，1H，)，7.77(m，2H)，8.78(s，1H)，10.51(s，1H).

实施例33  3-氰基-5-[2-[(N，N-二乙基胺基)乙氧基]甲基]-7-[(3-氟-4-溴苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)461.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：1.11(m，6H)，3.11(q，4H)，3.28(t，2H)，3.83(t，2H)，4.62(s，1H)，6.64(s，1H)，7.30(d，1H)，7.53(d，1H)，7.78(m，4H)，8.79(s，1H)，10.36(s，1H).

实施例34  3-氰基-5-[[2-(1-四氢吡咯基)乙氧基]甲基]-7-[(3，4-亚甲基二氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)407.

实施例35  3-氰基-5-[[2-(4-吗啉基)乙氧基]甲基]-7-[(3，4-亚甲基二氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶草酸盐的制备

MS：(M+H)423.

实施例36  3-氰基-5-[(3-辛氧基丙胺基)甲基]-7-[(4-氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)453.

实施例37  3-氰基-5-(4-羟基)苯硫甲基-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

把1.2g(0.0094mol)苯硫酚和0.3g(0.007mol)NaOH于室温加入装有30mL乙醇的50mL三颈瓶中，搅拌半小时，再加入3-氰基-5-氯甲基-7-(3，5-二氟苯胺基)吡唑并[1，5-a]嘧啶1.5g反应，4小时后反应完毕，将反应液倒入装有150mL水的250mL烧杯中，析出白色固体，静置5小时，过滤，用20mL水清洗，得到1.9g浅黄色固体，收率98％。

MS：(M+H)410.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.12(s，2H)，6.60(s，1H)，6.66(d，2H)，7.15(m，3H)，7.23(d，2H)，8.77(s，1H)，9.58(s，1H)，10.71(s，1H).

按照实施例37的制备方法制得实施例38～39化合物。

实施例38  3-氰基-5-[(4-羟基苯基)硫甲基]-7-[(3-氟-4-澳苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+Na)492.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.07(s，2H)，6.39(s，1H)，6.70(d，2H)，7.02(dd，1H)，7.22(d，2H)，7.35(dd，1H)，7.75(t，1H)，8.75(s，1H)，9.66(s，1H)，10.58(s，1H).

实施例39  3-氰基-5-[(4-羟基苯基)硫甲基]-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)480.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.04(s，2H)，6.16(s，1H)，6.74(d，2H)，7.22(d，2H)，7.32(d，2H)，7.44(d，2H)，8.74(s，1H)，9.72(s，1H)，10.52(s，1H).

实施例40  3-氰基-5-[(4-羟基苯基)亚磺酰甲基]-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

用3-氰基-5-[(4-羟基苯基)硫甲基]-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶0.4g(0.00098mol)作为原料，加入到装有30mL冰醋酸的100mL的三颈瓶中，再加入0.16g(0.00102mol)过硼酸钠，升温到50℃后原料不溶解，随着反应的进行，原料逐渐溶解，4小时后溶液澄清，反应完毕，加入到装有150mL水的250mL烧杯中，析出固体，静置过滤，用20mL水清洗得到0.3g白色固体，收率72％。

MS：(M+Na⁺)448.

H¹-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.32(d，2H)，6.66(s，1H)，6.88(d，2H)，7.17(m，3H)，7.48(d，2H)，8.79(s，1H)，10.08(s，1H)，10.72(s，1H).

实施例41  3-氰基-5-[(4-羟基苯基)磺酰甲基]-7-[(3，5-二氟苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

用3-氰基-5-(4-羟基)苯硫甲基-7-(3，5-二氟苯胺基)吡唑并[1，5-a]嘧啶0.4g(0.00098mol)作为原料，加入到装有30mL甲醇的100mL的三颈瓶中，加入30％的H₂O₂1.1g(0.00098mol)和0.08g钨酸钠，室温搅拌原料溶解，随着反应进行有固体逐渐析出，6小时后反应完毕，过滤，用甲醇清洗，得到白色固体0.4g，收率92％。

MS：(M+H)442.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.79(s，2H)，6.68(s，1H)，6.87(d，2H)，7.22(m，3H)，7.59(d，2H)，8.79(s，1H)，10.57(s，1H)，10.78(s，1H).

按照实施例41的制备方法制得实施例42化合物。

实施例42  3-氰基-5-[(4-羟基苯基)磺酰甲基]-7-[(4-三氟甲氧基苯基)胺基]吡唑并[1，5-a]嘧啶的制备

MS：(M+H)490.

¹H-NMR(DMSO，δ(ppm))：4.74(s，2H)，6.27(s，1H)，6.90(d，2H)，7.37(d，2H)，7.47(d，2H)，7.60(d，2H)，8.78(s，1H)，10.66(s，1H).

本发明产物的药理研究

体外抗肿瘤活性测试

1)细胞复苏

从液氮中小心取出细胞(冻存管)在37～40℃水浴中迅速全部融化，使细胞迅速越过极易受损的0～5℃温度范围。在无菌条件下用移液枪吸出细胞放入离心管中，在1300r/min下离心3min，轻轻弃去上清液后加入培养液，吹打混匀细胞，移入培养瓶中放入二氧化碳培养箱中培养，4h后换液一次。

2)细胞传代

细胞复苏后需培养传代2-3次待其稳定后方可进行实验，每次传代以细胞贴满培养瓶底部为准。

3)细胞埋板

细胞生长贴满培养瓶底部时用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中而后加入培养液以终止消化。将离心管在1300r/min下离心3min，轻轻弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10uL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为10⁴个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100uL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。

4)细胞加药

先用50μl DMSO溶解药物。而后加入适量培养液，使药物溶解成2mg/mL药液。然后在24孔板中将药物溶解成16，8，4，2，1μg/mL。每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只作为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养24h。

5)MTT法测定结果

将96孔板中带药培养液弃去，用PBS将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(0.5mg/mL)100uL放入培养箱中4h后，弃去MTT(四氮唑)溶液，加入DMSO 100uL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物IC₅₀值。

6)化合物的抑制口腔癌和纤维肉瘤活性结果见表1。

表1

   实施例序号   IC₅₀KB  (口腔癌细胞)  (ug/mL)  IC₅₀HT-1080  (纤维肉瘤)  (ug/mL)  实施例1  7  5  实施例2  10  11  实施例5  8  6  实施例6  7  12  实施例12  8  14  实施例15  10  8  实施例18  11  14  实施例19  14  14  实施例20  2  8  实施例27  4  11  实施例29  6  7  实施例30  10  12  实施例31  4  14  实施例32  8  11  实施例33  9  8  顺铂  9  7