尿苷5＇－二磷酸－N－乙酰半乳糖胺的制备方法

摘要

本发明提供了一种使用价廉的底物，可以有效地制备尿苷5′－二磷酸－N－乙酰半乳糖胺(UDP－GalNAc)的实用的方法。涉及UDP－GalNAc的制备方法，其特征在于：(1)在由UTP和GalNAc1－P酶促制备UDP－GalNAc的方法中，酶使用来源于微生物的UDP－GlcNAc焦磷酸化酶、(2)GalNAc1－P是使用N－乙酰半乳糖胺激酶，由N－乙酰半乳糖胺和磷酸供体在反应体系内制备的、(3)N－乙酰半乳糖胺激酶使用以与UDP－GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白质的形式制备的激酶、和/或(4)组合使用UMP和用酵母菌体由UMP生成UTP的体系代替使用UTP。

说明书

技术领域

本发明涉及作为低聚糖合成的重要底物尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)的制备方法。

背景技术

用酶合成低聚糖的方法包括利用低聚糖水解酶的逆反应的方法和利用转糖基酶的方法这两种。使用转糖基酶的合成法，从合成收率和用于合成具有复杂结构的低聚糖等方面考虑，比利用水解酶的逆反应的方法更好，此外，近年随着重组DNA技术的进步，各种转糖基酶的大规模生产也随该技术的发展而发展。

但是，在转糖基酶的合成法中所用的糖供体糖核苷酸除了一部分之外，其它的价格仍较高，目前的供应量仅在试剂水平。例如，作为UDP-GalNAc的制备方法，报道了使用半乳糖胺作为起始材料，将酶法和化学乙酰化组合合成UDP-GalNAc的方法。

但是，由于存在如下问题：(A)只是实验室的小规模反应、(B)酶的制备难、(C)半乳糖胺磷酸化时必需补充ATP再生体系，整个反应工序的收率也低、(D)在反应液中残留UDP-半乳糖胺的情况下，目的物UDP-GalNAc与它的分离存在问题，因此未必是实用的方法(Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)、J.Org.Chem.，57，152-157.(1992))。

此外，已报道了用尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺4-表异构酶(UDP-GlcNAc 4-表异构酶)由尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成UDP-GalNAc的方法(WO2002/050267)，由于存在如下问题：(i)UDP-GlcNAc 4-表异构酶在动物组织或菌体中的存在量极少、(ii)尽管可以通过重组DNA法制备UDP-GlcNAc 4-表异构酶，但是该酶反应是平衡反应因此转化率低，并且作为底物的UDP-GlcNAc未完全消耗，大量留在反应液中，因此UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的分离非常困难，因此该方法也不是实用的方法。

【专利文献1】

WO2002/050267

【非专利文献1】

Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)

【非专利文献2】

J.Org.Chem.，57，152-157.(1992)

【非专利文献3】

J.Biol.Chem.271，23653-23656，(1996)

【非专利文献4】

J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)

【非专利文献5】

J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)

【非专利文献6】

J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996)

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种使用价廉的底物，有效地酶促制备UDP-GalNAc的实用的方法。

本发明者们对UDP-GalNAc的生物合成路径进行了详细探讨，发现结果如下，从而完成了本发明。

首先，已报道病原性金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源于人、猪肝脏的各种尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)，除了具有催化下述(A)固有的转化反应的活性之外，还具有催化下述(B)的转化反应的活性(J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)、J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)、J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996))，尽管除了Staphylococcus aureus之外，还没有无病原性的来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的这样的报告，然而试验结果证实除了具有下述(A)的活性之外还具有下述(B)的活性。而且，例如如果使用来源于大肠杆菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由N-乙酰半乳糖胺1-磷酸(GalNAc1-P)和尿苷5′-三磷酸(UTP)合成UDP-GalNAc的话，可以解决UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖胺等按照现有方法与其它糖核苷酸分离的问题。

(A)UDP-GlcNAc+焦磷酸UTP+GlcNAc1-P

(B)UDP-GalNAc+焦磷酸UTP+GalNAc1-P

其次，GalNAc1-P昂贵，化学上也不容易制备，在探讨是否能够将N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)酶促磷酸化的过程中，报道了在人或猪的肝脏或肾脏等组织中存在使GalNAc磷酸化的活性(J.Biol.Chem.271，39.23653-23656，(1996))，通过该酶可以由GalNAc酶促制备GalNAc1-P。

然而，在采用大肠杆菌等的微生物作为宿主的体系内难以生产来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶，因此不可能实用地提供相应的酶，然而将编码来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因与编码来源于其它微生物的蛋白质(例如，大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因3′末端下游相连，产生融合蛋白质，这样可以在大肠杆菌内以活性状态制备来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶。

而且，还发现使用这种来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶和来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶、或者它们的融合蛋白质可以由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc，另外通过酵母菌体进行腺苷5′-三磷酸(ATP)生产和尿苷5′-一磷酸(UMP)的磷酸化的同时使N-乙酰半乳糖胺激酶和大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶起作用，可以由价廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc，由此完成了本发明。

即，本发明涉及UDP-GalNAc的制备方法，它是由UTP和GalNAc1-P酶促制备UDP-GalNAc的方法，其特征在于所述的酶使用来源于微生物(但是，病原性微生物除外)的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。

此外，本发明涉及UDP-GalNAc的制备方法，其特征在于所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶是用来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)经重组DNA法制得的。

另外，本发明涉及UDP-GalNAc的制备方法，其特征在于所述GalNAc1-P是用N-乙酰半乳糖胺激酶，由GalNAc和磷酸供体在反应体系内制得的。

在本发明中，所述N-乙酰半乳糖胺激酶可以是使用来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因(GALK 2)经重组DNA法制得的，可以是采用重组DNA法以与来源于微生物的蛋白质的融合蛋白质的形式制得的，或者可以使用以与来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白质的形式制得的。

此外，在本发明中，所述磷酸供体可以是腺苷5′-三磷酸(ATP)，所述腺苷5′-三磷酸(ATP)也可以经酵母菌体产生。

此外，在本发明的UDP-GalNAc的制备方法中，取代使用UTP，可以组合使用采用微生物菌体或酶的UTP生成/再生体系，取代使用UTP，也可以组合使用UMP和用酵母菌体由UMP产生UTP的体系。

另外，在本发明中，所述来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)可以是来源于大肠杆菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因。此外，在由所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc时，也可以向反应体系内添加将生成的焦磷酸分解的酶。

此外，在本发明中，所述酵母菌体可以使用来源于选自酵母属、接合酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属、汉森酵母属、德巴利酵母属中的一种或多种酵母的菌体，作为所述酵母菌体的一个实例，可以使用干燥酵母菌体。在使用所述酵母菌体的反应中，添加无机磷酸和所需的能量源也是有益的。

另外，在本发明中，可以添加氟化钠以防止由所述N-乙酰半乳糖胺激酶制备的GalNAc1-P的分解。

发明效果

根据本发明，发现来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶具有由GalNAc1-P和UTP产生UDP-GalNAc的活性，因此采用该酶和来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶，进行GalNAc的磷酸化并交替地添加UDP，首次可以有效地制备UDP-GalNAc。

此外，由于可以将N-乙酰半乳糖胺激酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作为融合蛋白质生产，首次可以在大肠杆菌内制备来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶，并且可以一次生产两种酶，因此酶制备变得容易。

另外，通过酵母菌体生产ATP和UMP的磷酸化的同时使N-乙酰半乳糖胺激酶和来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作用，可以有效地由价廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc。

再次，本发明的方法，由于几乎不产生UDP-GalNAc之外的糖核苷酸，因此可以极其简单地进行从反应液中分离精制目标UDP-GalNAc。

本发明的最佳实施方式

本发明涉及UDP-GalNAc的制备方法，它是由UTP和GalNAcl-P酶促制备UDP-GalNAc的方法，特征在于酶使用来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。

作为向反应体系内添加的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，可以使用没有病原性的来源于微生物的酶。通过将各自酶的基因克隆，可以在微生物菌体内大量表达这些酶，也可以采用所谓的重组DNA法制备。作为来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，列举有来源于属于埃希氏杆菌(Escherichia)属(Journal of Bacteriology，175，6150(1993))、酵母(Saccharomyces)属(Agricultural Biological Chemistry，40，2275(1976))或链孢霉(Neurospoa)属(Can.J.Microbiology，25，1381(1979))的微生物的酶，特别优选来源于大肠杆菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。

这种UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，只要具有相应活性，任何形态都可以。具体地说，可以列举有微生物菌体、该菌体的处理物或由该处理物获得的酶制剂等。

作为微生物菌体处理物，可以将上述微生物菌体经机械破碎(利用涡流混合机、法式压力机、均化器、乳钵等)、冻融、自溶、干燥(利用冷冻干燥、风干等)、酶处理(利用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(利用酸、碱处理等)等普通处理方法而获得的菌体破坏物或者菌体细胞壁或细胞膜的变性物。

作为酶制剂，可以列举由对来源于上述菌体处理物的具有相应酶活性的部分施加常用的酶精制手段(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)获得粗酶或精制酶。

对由微生物菌体制备UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的方法进行具体说明，对收集到的菌体进行超声波处理使菌体破碎，然后使菌体破坏液离心，获得上清液，对该上清液施加离子交换层析法、凝胶层析法等各种层析法处理，将UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性部分浓缩、脱盐之后就可以获得作为目标酶制剂。

反应所用的UTP和GalNAc1-P，也可以在反应体系内分别制备。例如，可以使用N-乙酰半乳糖胺激酶，在GalNAc1-P的反应体系内由GalNAc和磷酸供体进行制备。

反应所用的N-乙酰半乳糖胺激酶，存在于人、猪、鼠等哺乳类肾脏或肝脏、胰脏、肺、心脏、大动脉、脑等的组织中，特别是在肾脏或肝脏内含有大量的该酶，因此可以由这些组织制得。此外，向反应体系中添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，只要具有相应活性，任何形态都可以。具体地说，可以列举有猪肝脏处理物或由该处理物获得的酶制剂等。

但是，从酶制备的简便性等的角度，按照常规方法克隆N-乙酰半乳糖胺激酶基因，可以在微生物菌体内大量表达，最优选通过重组DNA法制备。采用微生物作为宿主，通过重组DNA法制备来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶时，按照常规方法不能制得目标酶，即使能够产生其量也极少，因此不适合实用。为此，与宿主相同的编码来源于微生物的蛋白质(例如，大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因的下游相连，以生产融合蛋白质，可以在大肠杆菌等的宿主内以具有活性的状态制备来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶。

用于生产上述融合蛋白质的基因的连接、质粒的构建、宿主的性状转变、酶的生产等，已经是本领域公知的技术，如后面实施例所示，可以按照常规方法进行。

作为反应添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，与UDP-GlcNAc焦磷酸化酶相同，只要具有相应活性，任何形态都可以。具体地说，可以列举有微生物菌体、该菌体的处理物或由该处理物获得的酶制剂等。

此外，UTP在反应体系内的制备，可以组合使用采用微生物菌体或酶的UTP生成/再生体系来实施。具体地说，可以利用采用UMP和酵母菌体由UMP生产UTP的体系，首先对此进行说明(参见图1)。

作为使用的酵母菌体，只要可用于糖核苷酸的制备，没有特别的限制。具体地说，可以列举有来源于酵母(Saccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、假丝酵母(Candida)属、球拟酵母(Torulopsis)属、汉森酵母(Hansenula)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属等的酵母的菌体。这种酵母菌体，可以是活酵母菌体、干燥酵母菌体中任意一种，从反应收率、获取的容易性等的角度优选使用干燥酵母菌体。

此外，UTP在反应体系内的制备，并不限于使用上述UMP和酵母菌体由UMP生产UTP的体系，例如，可以利用采用微生物菌体由乳清酸生产UTP的体系(特开平5-276974号)、或者同时使用使用了酶的UTP生成体系和ATP再生体系(具体地说，可以利用使多磷酸激酶、腺苷酸激酶及多磷酸作用于腺苷酸(AMP)使ATP再生，同时尿苷酸激酶，及根据需要使核苷酸二磷酸激酶作用于UMP生成UTP的体系)等。

使用这种酶和底物制备UDP-GalNAc的条件，随所用的酶和底物不同而略有不同。

(1)酶使用来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由UTP和GalNAc1-P酶促制备UDP-GalNAc时，

反应所用的UTP和GalNAc1-P可以使用市售品，或者可以按照公知的方法(J.Am.Chem.Soc.，115，2260-2267(1993))制得。作为使用的浓度，没有特别的限制。可以分别适当设定在约1～200mM，优选约1～100mM的范围内。

UDP-GalNAc的合成反应，例如在pH约6.0～9.0的磷酸缓冲液中添加UTP和GalNAc1-P，然后在该反应液中添加共存上述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶约0.1U/ml以上，优选约0.5～20.0U/ml，在约5～30℃，优选约5～25℃下，根据需要进行搅拌使反应进行1～70小时左右。

此外，通过UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc的反应，是平衡反应，为了提高UDP-GalNAc的合成收率，优选向反应体系内添加0.1U/ml以上的酶分解生成的焦磷酸(例如，焦磷酸酶)。

(2)酶使用来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它们的融合酶，由UTP和GalNAc酶促制备UDP-GalNAc时，

反应所用的UTP和GalNAc可以使用市售品。使用浓度没有特别的限制，各自可以适当设定在约1～200mM，优选约1～100mM的范围内。

UDP-GalNAc的合成反应，例如在pH约6.0～9.0的磷酸缓冲液中添加UTP和GalNAc，然后向该反应液中分别添加共存上述两种酶、或者融合酶约0.1U/ml以上，优选约0.5～20.0U/ml，在约5～30℃，优选约5～25℃下根据需要搅拌使反应进行1～70小时左右。

另外，与上述(1)相同地，添加分解焦磷酸的酶(例如，焦磷酸酶)0.1U/ml以上，再者为了防止经N-乙酰半乳糖胺激酶制得的GalNAc1-P分解，添加1mM以上的氟化钠是理想的。

(3)酶使用来源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和来源于动物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它们的融合酶，组合使用用酵母菌体由UMP生成UTP的体系，由UMP和GalNAc制备UDP-GalNAc时，

反应所用的UMP和GalNAc可以使用市售品。作为使用浓度，没有特别的限制，可以分别适当设定在约1～200mM，优选约10～50mM的范围内。

UDP-GalNAc的合成反应，例如在pH约6.0～9.0的磷酸缓冲液中添加UMP和GalNAc，然后向该反应液中分别添加上述两种酶、或者它们的融合酶约0.1U/ml以上，优选约0.5～20.0U/ml，再添加共存酵母菌体1～10％(w/v)，在约5～30℃下根据需要搅拌使反应进行1～70小时左右。

上述反应中，优选在反应体系内添加无机磷酸和能量源。无机磷酸可以直接使用磷酸钾等，但是优选以磷酸缓冲液的形态使用。作为能量源，可以使用葡萄糖、果糖等糖类，乙酸、柠檬酸等有机酸。各自的使用浓度，没有特别的限制，但是可以适当设定在约10～1000mM，优选约100～500mM的范围内。

而且，在上述反应体系中，上述(1)和(2)的酶反应不同，不必向反应体系中加入防止焦磷酸分解的酶和用于防止GalNAc1-P分解的氟化钠。

如此所得的UDP-GalNAc可以通过糖核苷酸常用的分离精制手段(离子交换层析法、吸着层析法、盐析等)进行分离精制。

实施例

下面，显示实施例对本发明进行具体说明，然而本发明并不限于此是显而易见的。而且，实施例中，采用HPLC法对反应液中的UDP-GalNAc进行定量。即，分离时用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脱液采用0.5M磷酸一钾溶液。DNA的制备、利用限制性酶进行的剪切、利用T4DNA连接酶进行的DNA连接、以及大肠杆菌的性状转变法都参照《分子克隆》(Maniatis等编，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork(1982))进行。限制性酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶从タカラバイオ(株)获得。

实施例1

(1)编码来源于人肾脏的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因的克隆

将来源于人肾脏的c DNA库(可以从クロンテツク公司获得)作为模板，按照常规方法合成下面所示的两种引物DNA，通过PCR法使人肾脏GALK 2基因(提交到国家生物技术信息中心(NCBI)，登录号为NM_002044，(Submitted to NCBI、Accession No.NM_002044))扩增。

引物(A)：5’-CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT-3’

引物(B)：5’-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3’

利用PCR法使GALK 2基因扩增时，使用タカラバイオ公司制造的DNA热循环仪使反应液100μl(50mM氯化钾、10mM Tris盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分别进行热变性(94℃、1分钟)、退火(59℃、1分)、延伸反应(72℃、2分钟)的步骤，反复30次。

基因扩增后，按照文献(分子克隆，前述)的方法，通过琼脂糖凝胶电泳使DNA分离，精制相当于1.4kb的DNA片段。用限制性酶BamH I及Sal I剪切该DNA，同样用限制性酶BamH I及Sal I消化质粒pMAL-c2x(从New England BioLabs公司获得)再用T4DNA连接酶连接。使用连接反应液使大肠杆菌K12株JM109菌(从タカラバイオ株式会社获得)进行性状转变，从所得耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pMAL-hGLK2。pMAL-hGLK2是在麦芽糖结合蛋白基因的3′-末端下游的BamH I-Sal I剪切部位插入含有人肾脏GALK 2结构基因的BamH I-Sal I DNA片段的质粒。

(2)人肾脏GALK 2基因产物的制备

将具有质粒pMAL-hGLK2的大肠杆菌JM109菌接种在100ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的培养基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)中，于37℃振荡培养。当菌数达到4×10⁸个/ml时，添加IPTG使培养液的最终浓度分别达到0、0.01、0.1或1.0mM，然后在25℃分别继续振荡培养20小时。培养结束后，离心分离(4℃、9000xg，10分钟)回收菌体，使其悬浮于20ml缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.5))中。使用ブランソン公司制造的超声波粉碎机(モデル450ソニフア一)于冰冷下进行超声波处理(50W，2分钟，3次)，在4℃、12000xg的条件下离心分离20分钟，回收可溶性部分(上清液)。

将所得上清液部分作为酶样品，测定该酶样品中的N-乙酰半乳糖胺激酶活性。将其结果示于下表。

【表1】

  菌/质粒  IPTG浓度  (mM)  N-乙酰半乳糖胺激酶活性  (U/mg蛋白质)  JM 109/pMAL-hGLK 2  0  ＜0.01  0.01  0.04  0.1  0.24  1.0  0.25

另外，N-乙酰半乳糖胺激酶活性是按照下面所示方法测定由ATP和GalNAc磷酸化为GalNAc1-P的活性而算出的值。即，在100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、10mM氯化镁、5mMGalNAc、5mM ATP·3Na、5mM氟化钠中添加N-乙酰半乳糖胺激酶酶样品，于37℃反应10分钟。将反应液煮沸5分钟使反应停止，用糖分析仪HPAEC-CD(偶联有导电计检测的高效阴离子交换色谱法)进行分析。分离时使用ダイオネクス公司制造的Carbopac PA1柱(4×250mm)，洗脱液采用(A)0.1M NaOH溶液和(B)0.1M NaOH，0.5M乙酸钠溶液的浓度梯度(0-15分钟：B＝1％-50％、15-20分钟：B＝100％)。从HPAEC-CD分析结果可以算出反应液中的GalNAc1-P生成量，将37℃时1分钟内生成1μmol的GalNAc1-P的活性计为1单位(U)。

(3)UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的制备

由大肠杆菌(IFO3972＝NBRC3972)的染色体DNA，按照文献中公知的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))制得的大肠杆菌JM109[pTrc--glmU]，在含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基(Methods Enzymol.，153，3-11，(1987))10ml中于37℃下培养一晚。将其接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基500ml中。37℃下培养2小时后，添加IPTG使得终浓度为0.1mM，37℃下连续培养一夜。培养结束后，通过离心分离(4℃，9000xg，20分钟)回收菌体。将回收的菌体悬浮于50mMTris盐酸(pH7.5)中，使用ブランソン公司制造的超声波粉碎机(モデル450ソニフア一)粉碎后(50W，2分钟，3次)，在4℃、15000rpm的条件下离心分离20分钟，回收可溶性部分(上清液)。

将由此获得的上清液部分作为酶样品，测定酶样品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。将其结果与对照菌(具有pTrc99A的大肠杆菌JM109菌)一起示于下表2。

【表2】

  菌/质粒  UDP-GlcNAc焦磷酸化酶  (U/mg蛋白质)  JM 109/pTrc 99A  0.19  JM 109/pTrc-glmU  30.97

另外，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性是按照Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))中所示的方法，即测定由UDP-GlcNAc和焦磷酸分解为N-乙酰葡糖胺1-磷酸和UTP的活性而算出的值。即，在50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、5mM氯化镁、3mM焦磷酸钠、1mM UDP-GlcNAc中添加UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶样品，于37℃反应5分钟。此外，使用水替代焦磷酸钠溶液进行同样的反应，依次作为对照。

将反应液煮沸5分钟使反应停止，用HPLC进行分析。分离时使用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脱液采用0.5M磷酸钾溶液。从HPLC分析结果可以算出反应液中产生的UTP量，将37℃时1分钟内生成1μmol的UTP的活性计为1单位(U)。

(4)用大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶合成UDP-GalNAc

在含有50mMTris盐酸缓冲液(pH7.5)、5mM氯化镁、1mM 5′-UTP·3Na、1mM GalNAc1-P的溶液0.5ml中添加上述(3)制得的规定活性量的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.8U)，于37℃下进行反应。在反应过程中从反应液中取出适量，煮沸5分钟后离心分离，将其上清液进行HPLC分析。

反应开始后进行反应液的分析的结果证实，由1mM的UTP和1mM的GalNAc 1-磷酸合成0.33mM的UDP-GalNAc。另外通过向反应液中添加无机焦磷酸酶(シグマ公司制造)使平衡向UDP-GalNAc合成侧倾斜，也证实合成收率提高(提高60％左右)。

实施例2

(1)用人N-乙酰半乳糖胺激酶和大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc

在含有100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、10mM氯化镁、5mM 5′-UTP·3Na、5mM GalNAc、5mM 5′-ATP·3Na、5mM氟化钠的0.2ml溶液中添加上述实施例1制得的规定活性量的N-乙酰半乳糖胺激酶酶液(0.094U)和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.4U)和无机焦磷酸酶(シグマ公司制造、0.5U)，37℃下进行反应。

在反应过程中从反应液中取出适量，煮沸5分钟后进行离心分离，将该上清液进行HPLC分析。反应开始4小时后进行反应液的分析的结果证实，在有N-乙酰半乳糖胺激酶、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶及无机焦磷酸酶的情况下，合成3.2mM的UDP-GalNAc。而且，在没有N-乙酰半乳糖胺激酶，仅有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和无机焦磷酸酶的反应条件下不能生成UDP-GalNAc。

实施例3

(1)使用干燥酵母和人N-乙酰半乳糖胺激酶和大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc

在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、50mM UMP、200mM磷酸钾(pH8.0)、20mM氯化镁、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)的1ml溶液中，添加实施例1中制得的重组酶(N-乙酰半乳糖胺激酶；0.32U，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；10.4U)，于26℃下以300rpm的搅拌速度搅拌的同时进行反应。而且，在反应开始后的第16、24、40、48小时向反应液中各自添加2M的葡萄糖溶液0.1ml。不同时间的反应液进行分析的结果于图2所示。反应49小时时UDP-GalNAc的蓄积量达到32mM。

实施例4

实施例2和3中显示了使用二种酶的反应例，然而这里显示使用使二种酶以融合蛋白质生产来进行UDP-GalNAc合成反应的结果。

(1)大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和来源于人肾脏的N-乙酰半乳糖胺激酶的融合

将大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因表达用质粒，pTrc-glmU作为模板，使下面所示的两种引物DNA按照常法合成，利用PCR法使含有glmU基因的DNA片段扩增。

引物(C)：5’-GAGCGGATAACAATTTCAC-3’

引物(D)：5’-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3’

利用PCR法使含有glmU基因的DNA片段扩增时，使用タカラバィオ公司制造的DNA热循环仪使反应液100μl(50mM氯化钾、10mM Tris盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分别进行热变性(94℃、1分钟)、退火(64℃、1分钟)、延伸反应(72℃、2分钟)的步骤，反复30次。

DNA片段扩增后，按照文献(分子克隆，前述)的方法，通过琼脂糖凝胶电泳使DNA分离，精制相当于1.4kb的DNA片段。用限制性酶EcoR I及BamH I剪切该DNA，同样用限制性酶EcoR I及BamH I消化质粒pTrc99A(从フアルマシア公司获得)再用T4DNA连接酶连接。使用连接反应液使大肠杆菌K12株JM109菌(从タカラバイオ株式会社获得)进行性状转变，从所得耐氨苄青霉素的性状转变体中分离出质粒pTrc-glmU 3。pTrc-glmU 3的glmU基因是，取代缺失的起始密码子，插入BamH I识别部位的基因。

接下来，使pTrc-hGLK2经限制性酶BamH I和Sal I消化，分离精制相当于1.4kb的DNA片段。同样用限制性酶BamH I和Sal I对其消化的质粒pTrc-glmU 3和T4DNA连接酶进行连接。使用连接反应液使大肠杆菌JM109菌进行性状转变，从所得耐氨苄青霉素的性状转变体中分离质粒pTrc-glmU·hGLK2。pTrc-glmU·hGLK2是在glmU基因的3′-末端下游构架一致地连接hGLK2基因的质粒。接下来使pTrc-glmU·hGLK2经限制性酶Sac I和SalI消化，分离精制相当于1.4kb的DNA片段。同样用限制性酶Sac I和Sal I使其消化的质粒pTrc12-6和T4DNA连接酶连接。采用连接反应液使大肠杆菌DH1株(ATCC 33849)进行性状转变，从得到的耐卡那霉素的性状转变体中分离质粒p12-6-glmU·hGLK2。

另外，质粒pTrc12-6是以质粒载体πAG1(具有质粒载体πAG1的大肠杆菌K-12株TNC111菌的保藏号：FERMBP-6901号：平成11年9月30日保藏)和pTrc99A DNA为基础构建，pTrc99A的β-内酰胺酶基因完全缺失(第567-1816位缺失)，在该缺失部位插入来源于Tn903的耐卡那霉素的基因的质粒(特开2001-103973)。

(2)大肠杆菌glmU基因产物和人肾脏GALK 2基因产物的融合蛋白质的制备

将具有质粒p12-6-glmU·hGLK2的大肠杆菌DH1株接种于含有100μg/ml的卡那霉素的培养基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)50ml中，37℃下振荡培养。菌数达到4×10⁸个/ml时向培养液中添加IPTG使得最终浓度为0.1mM，再于25℃下连续振荡培养20小时。培养结束后，通过离心分离(4℃，9000xg，10分钟)回收菌体，将其悬浮于20ml的缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.5))中。于冰冷下经过超声波处理将菌体破碎，再离心分离(4℃，12000xg，10分钟)除去菌体残渣。

将由此获得的上清液部分作为酶样品，按照实施例1中记载的方法测定酶样品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性和N-乙酰半乳糖胺激酶活性。其结果示于下表3。

【表3】

  菌/质粒  UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性  (U/mg蛋白质)  N-乙酰半乳糖胺激酶活性  (U/mg蛋白质)  DH1/pTrc1  2-6  0.16  ＜0.01  DH1/p12-6-g  1mU·hGLK 2  9.11  0.18

(3)使用融合蛋白质的UDP-GalNAc的合成

使用上述融合酶样品进行UDP-GalNAc合成。即，在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、28mM UMP、200mM磷酸钾(pH8.0)、20mM氯化镁、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)的2.5ml溶液中添加上述重组融合酶液(N-乙酰半乳糖胺激酶；1.75U、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；88.9U)，于27℃、100rpm下搅拌的同时进行反应。反应开始后的第14、24、40小时向反应液中添加葡萄糖0.09g。此外，在反应开始24小时后向反应液中添加0.5M的UMP溶液110μl。

将分析不同时间的反应液的结果示于图3。使用融合蛋白质与分别将制得的两种酶混合使用大致相同地合成UDP-GalNAc，反应40小时时UDP-GalNAc达到30mM。

(4)大肠杆菌glmU基因产物和人肾脏GALK 2基因产物的融合蛋白质的制备(放大试验)

将具有质粒P12-6-glmU·hGLK2的大肠杆菌DH1株接种到含有100μg/ml的卡那霉素的培养基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)3mL中，37℃下振荡培养一夜。将该培养液全部接种到125mL的相同培养基中，37℃下振荡培养8-11小时。将该培养液全部接种到5L相同培养基中，在37℃、通气量1.0vvm、搅拌翼转数300rpm的条件下培养。菌数达到4×10⁸个/ml时添加IPTG使得在培养液中的最终浓度为0.1mM，使培养温度降低至28℃继续培养14小时。培养结束后，通过离心分离(9000xg，10分钟)回收菌体，然后将其悬浮于500ml的缓冲液(50mM磷酸钾(pH7.5))中。于冰冷下经超声波处理将菌体破碎，同时经离心分离(12000xg，10分钟)除去菌体残渣。

将由此获得的上清液部分作为酶样品，以实施例1中记载的方法测定UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。该值是9.50U/mg蛋白质。

(5)UDP-GalNAc合成反应的放大试验

使用融合酶样品进行UDP-GalNAc合成反应的放大试验，在发酵缸中进行。即，添加200mM葡萄糖、50mM N-乙酰半乳糖胺、28mM UMP、200mM磷酸钾(pH8.0)、20mM氯化镁、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工业)、和上述重组融合酶液(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性为525000U)加注至1500ml，在27℃、通气量0.1vvm、搅拌翼转数150rpm的条件下进行反应。从反应开始的第14，24，38小时向反应液中添加葡萄糖54g。此外，在反应开始24小时后向反应液中添加0.5M的UMP溶液66mL。

将分析不同时间的反应液的结果示于图4。即使在发酵缸中进行反应合成UDP-GalNAc，反应40小时时UDP-GalNAc达到35mM。

保藏证明

国际表格

[关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约]

本页底部签章的国际保藏机构根据7.1条颁发

原始保藏的受理

保藏者：姓名(名称)：雅玛山酱油株式会社社长滨口道雄

              地址：千叶县銚子市新生町2丁目10番地1号

  I.微生物鉴定  交存人给与的鉴定符号  大肠杆菌K-12株TNC 111菌  (Escherichia coli K-12-TNC 111)  国际保藏单位给与的保藏  号：FERM BP-6901  II.科学性质和/或所分类学命名  上述I所鉴定的微生物附有：  ■科学性质  ■分类学命名  III.接收和受理  该国际保藏单位于1999年9月30日(原保藏日)接受并受理上述I中所命名  的微生物  IV请求.转化的受理  上述I所命名的微生物于    (原保藏日)由该国际保藏单位接收  V.国际保藏单位  名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所  所长  大箸  信  地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番3号  (邮编：305-8566)     平成11年(1999)9月30日

【附图简述】

【图1】

图1是显示由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc的体系的图。

【图2】

图2是显示来源于人肾脏的N-乙酰半乳糖胺激酶和大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶共存时UDP-GalNAc的生成量随时间变化的图。

【图3】

图3是显示使用来源于人肾脏的N-乙酰半乳糖胺激酶和大肠杆菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白质时UDP-GalNAc的生成量随时间变化的图。

【图4】

图4是显示在发酵缸中的合成反应的UDP-GalNAc的生成量随时间变化的图。

                        序列表

<110>YAMASA CORPORATION

<120>尿苷5’-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制备方法

<130>5043-001PCT

<150>JP P2004-306783

<151>2004-10-21

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>扩增GALK2基因用的引物

<400>1

cggggatcca tggctacaga gagccctgct                                       30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>扩增GALK2基因用的引物

<400>2

tacgtcgact taggcctcaa gcaaaaccaa                                       30

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>扩增glmU基因用的引物

<400>3

gagcggataa caatttcac                                                   19

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>扩增glmU基因用的引物

<400>4

ccaggatccc tttttcttta ccggacgacg                                       30