一种表皮生长因子眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂

摘要

本发明涉及一种含有表皮生长因子的眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂，该表皮生长因子眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂由表皮生长因子、脂质材料、乳化剂、增稠剂、等渗调节剂、抑菌剂、pH调节剂、纯化水配制而成。其特点在于采用安全、无刺激性的磷脂为乳化剂；具有离子和/或pH敏感特性的高分子材料作为增稠剂；主要辅料还包括等渗调节剂、抑菌剂、pH调节剂。本发明表皮生长因子眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂在体外为流动性很好的低粘度流体，滴入眼内后很快形成水凝胶，从而增加药物的眼内滞留时间和生物利用度，具有对眼部无刺激性及毒副作用，制剂质量稳定等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种凝胶制剂，更具体的说涉及一种含有人表皮生长因子(hEGF)的眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂。

背景技术

表皮生长因子是一种含有53个氨基酸的重要的生物多肽生长因子(Cohem，et al.，J.Biol.Chem.248，7669-7672，1973)，其具有促有丝分裂和促非有丝分裂两重活性，能刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞增殖分化，促进组织生长、发育和成熟。EGF是哺乳动物眼中最强的细胞因子之一，在伤口愈合中能刺激角膜上皮细胞增殖、趋化和移行，因此治疗各种原因引起的角膜上皮缺损和角膜病变、轻中度干眼症、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、角膜溃疡和大疱性角膜炎等。

表皮生长因子易溶于水，也能溶于有机溶剂，但其在水溶液中不稳定，容易发生降解反应而失去活性，因此表皮生长因子水溶液必须在低温条件下保存。目前，市售表皮生长因子滴眼液必须在4℃低温保存，尽管如此，其稳定性也只能维持约2个月，因此需要开发出表皮生长因子滴眼液的新剂型，以提高其稳定性和治疗作用。

中国专利CN1289619报道了一种表皮生长因子滴眼液的制备方法，该制剂将表皮生长因子及相关辅料制成水溶液，然后制成冻干粉再将其注入溶媒中，虽然在制备过程中保持了EGF的活性，但仍然无法避免其在水性溶媒中缓慢降解失去活性。欧洲专利EP0267015报道了表皮生长因子在纤维素类聚合物水溶液制剂中能够较稳定地存在，但在常温下仍不免降解失去活性。美国专利UP4944948报道了一种EGF脂质体凝胶制剂，能够达到缓释目的，但水溶性的EGF容易发生渗漏，从而影响包封率和药物稳定性。中国专利CN1362883和欧洲专利EP0312208分别报道了几种表皮生长因子的普通凝胶制剂，但是普通凝胶剂存在如下缺陷：①体外黏度较大，流动性不好，临床用药不方便；②制备过程中容易产生大量的气泡，工业生产和灌装不便；③不具有假塑性变形性，药物不易在角膜和结膜表面靠眨眼动作涂布均匀。

脂质纳米载体作为眼科药物载体具有物理稳定性高、药物泄露少、具有缓释性和靶向性、可以灭菌等优点，且衍生的原位凝胶剂克服了传统滴眼剂眼内滞留时间短和普通凝胶剂用药不便的问题，因此脂质纳米载体原位凝胶是研制新型EGF眼用制剂的一个方向。乳化剂是脂质纳米载体处方中一个必需成份，不同的乳化剂制备的脂质纳米载体粒径、生物相容性等均不同；增稠剂是形成原位凝胶的一个必需成分，增稠剂的种类及用量会导致原位凝胶的形成机理及其性质有所不同，因此选择合适的乳化剂和增稠剂是研制表皮生长因子脂质纳米载体原位凝胶的关键之一。

发明内容

本发明目的在于提供一种表皮生长因子脂质纳米载体原位凝胶制剂，使其能适用于眼部敏感部位，并能达到延缓药物的消除，提高眼部滞留时间和局部生物利用度。

为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的人表皮生长因子的眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂，其组成为(以1000ml脂质纳米载体原位凝胶制剂中的含量计)：

表皮生长因子        0.1～50mg；

脂质材料            3～15g；

乳化剂              1～100g；

增稠剂              0～500g；

等渗调节剂          加至渗透压为0.280～0.310mOsmol/kg；

抑菌剂              0.0～0.5g；

pH调节剂            加至pH为6.0～8.0；

纯化水              加至1000ml。

所述的脂质材料包括：三酰甘油类，如三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、二十二酸单、双、三甘油酯混合物、链长在C₈-C₁₀之间的中等链长脂肪酸甘油酯；脂肪酸类，如硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸；固醇类，如：胆固醇；天然植物油，如大豆油、蓖麻油、红花油、橄榄油；维生素类，如维生素E、维生素A、维生素酯类中的一种或其混合物。

所述的乳化剂包括：磷脂类，如卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类，如泊洛沙姆；脂肪酸山梨坦类(Span类)；聚山梨酯类，如Tween60、Tween80；聚氧乙烯脂肪酸酯类；聚氧乙烯脂肪醇醚类中的一种或其混合物。其中乳化剂优选卵磷脂。

所述的增稠剂可采用结冷胶、海藻酸钠、瓜儿胶、果胶质、玻璃酸钠、卡波姆(Carbopol)、羟丙甲纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)中的一种或几种。

其中，结冷胶分子量为10⁵～10⁷，甲基化程度＜30％；海藻酸钠分子量为1×10⁶～2.4×10⁶；瓜儿胶分子量约为220000；Carbopol分子量为10⁶～10⁷；HPMC分子量为86000；MC分子量为20000～380000；PVP分子量为5000～70000。

在本发明优选的实施方式中，所述的增稠剂可以为海藻酸钠、结冷胶、卡波姆或其混合物。其中，基于1000ml制剂中，海藻酸钠浓度为0.5～50g，结冷胶浓度为0.5～50g，卡波姆浓度为1～200g。

所述的等渗调节剂为甘油、硼砂、葡萄糖、甘露糖醇、丙二醇、氯化钠中的一种或其混合物。等渗调节剂在本发明的眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂中的含量，为使该制剂的渗透压在0.280～0.310mOsmol/kg的范围内。

抑菌剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵、尼泊金甲、乙、丙酯、三氯叔丁醇、山梨酸中的一种或几种的混合物。

所述的pH调节剂为盐酸、氢氧化钠、磷酸盐、硼酸、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷、枸橼酸、枸橼酸盐、三乙醇胺中的一种或其混合物。对于磷酸盐，例如可采用磷酸盐的各种缓冲液。pH调节剂在本发明的眼用脂质纳米载体原位凝胶制剂中的含量，为使该制剂的pH值在6.0～8.0的范围内。

本发明所述的纯化水可以为去离子水。

本发明凝胶的制备方法如下：

将EGF、脂质材料、乳化剂溶解于乙醇溶液，水浴50℃。在高剪切条件下(IKA，T25 basic型，10,000rpm)，加入冰水浴中，搅拌30min，得到EGF脂质纳米载体混悬液。20000rpm离心30min，得到载体沉淀，进一步用去离子水分散载体沉淀。

将增稠剂、等渗调节剂溶解于去离子水，40℃搅拌溶解，将分散的载体混悬液加入其中，加入抑菌剂；最后用PH调节剂调节到pH6～8，用去离子水补至1000ml，灌装，即得。

本发明中离子敏感型原位凝胶是指在Na⁺，K⁺，Ca²⁺等阳离子作用下，聚合物发生胶凝，而形成的一种原位凝胶，可形成离子敏感型原位凝胶的增稠剂包括结冷胶、海藻酸钠等；pH敏感型原位凝胶是指由于pH值的改变，聚合物的黏度急剧增大，发生相变形成凝胶的一类原位凝胶，可形成pH敏感型原位凝胶的增稠剂为卡波姆；离子/pH双敏感的原位凝胶是指在上述两种条件下均会发生胶凝的一类原位凝胶，当上述两种增稠剂合用时，可形成离子/pH双敏感的原位凝胶。

本发明的有益效果：

本发明制成的hEGF脂质纳米载体，能够减少hEGF与水溶液的接触，使其不容易发生空间构型的改变，从而能够增加其物理/化学稳定性。并且脂质纳米载体本身具有良好的物理化学稳定性，能够采用过滤法或高压蒸汽灭菌，易于实现工业化生产。除此之外，脂质纳米载体能够减少药物从鼻泪管流失，增加药物在眼部的滞留时间，使角膜表面维持较高的药物浓度，减少给药次数，提高药物疗效。

本发明采用Carbopol、结冷胶、海藻酸钠等为增稠剂，制成原位凝胶具有如下优点：(1)体外情况下为液态，易于工业化生产，使用方便，剂量容易准确控制；(2)凝胶为水性基质，黏度适中，润滑性好，不影响视线；(3)凝胶滴入眼后，均匀铺展，粘附于眼球及眼睑表面形成凝胶，能够克服传统滴眼液迅速流失的缺点，从而延长药物眼部滞留时间，实现缓慢释药，增强疗效。

本发明制备的纳米载体原位凝胶在体外粘度较低(1.0～100.0cp)，流动性好，可以方便的滴入眼内。入眼后受pH和/或离子引发发生胶凝，形成假塑性凝胶，粘度迅速增加(100～2000cp)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。乳滴平均粒径用动态光散射原理的粒度测定仪测定，凝胶粘度采用旋转粘度计(Brookfield DV-III)测定，1～100rpm/min。

实施例1：

首先按照下面表1中给出实施例1的组成，将0.1mg EGF、20g MCT、80g单硬脂酸甘油脂、10g大豆卵磷脂溶解于100ml乙醇溶液，水浴50℃。在高剪切条件下(IKA，T25 basic型，10,000rpm)，加入500ml冰水浴中，搅拌30min，得到EGF脂质纳米载体混悬液。20000rpm离心30min，得到载体沉淀，进一步用200ml去离子水分散载体沉淀。

将0.5g结冷胶、20g甘油溶解于400ml去离子水，40℃搅拌溶解，将分散的载体混悬液加入其中，加入0.05g抑菌剂苯扎氯胺；最后用浓度为0.3M三乙醇胺溶液调节到pH6.2，用去离子水补至1000ml，灌装，即得。

实施例2～4：

采用与实施例1相同的制备方法，由表1中给出的组成和工艺参数，制得实施例2～4的脂质纳米载体原位凝胶制剂。

表1：实施例1～4脂质纳米载体离子敏感型原位凝胶制剂组成和制备工艺

  实施例1  实施例2  实施例3  实施例4  hEGF  0.1mg  20mg  40mg  50mg  脂质材料  MCT：20g  单硬脂酸甘油  脂：80g  IPM：14.5g  三棕榈酸甘油酯：  48g  大豆油：15g  单硬脂酸甘油酯：  65g  MCT：30g  油酸：120g  乳化剂  大豆卵磷脂：10g  Tween20：25g  Span20：15g  聚氧乙烯氢化蓖麻  油：50g  Tween80：7.5g  蛋黄卵磷脂：45g  增稠剂  结冷胶0.5g  结冷胶：1.5g  海藻酸钠：8g  结冷胶：2g  结冷胶：50g  抑菌剂  苯扎氯胺：0.05g  苯扎氯胺：0.05g  三氯叔丁醇：0.05g  苯扎氯胺：0.05g  等渗调节剂  甘油：20g  甘油：22g  丙二醇：25g  甘油：14g  pH调节剂  0.3M三乙醇胺  0.5M三乙醇胺  0.5M NaOH  0.5M三羟甲基氨  基甲烷  纯化水  至1000ml  至1000ml  至1000ml  至1000ml  pH  6.2  7.2  6.8  7.7  平均粒径  188nm  469nm  366nm  418nm  PI  0.201  0.398  0.468  0.376

实施例5

首先按照下面表2中给出实施例5的组成，将10mg EGF、6g大豆油、24g单硬脂酸甘油脂、30g大豆卵磷脂、15g聚氧乙烯蓖麻油溶解于100ml乙醇溶液，水浴50℃。在高剪切条件下(IKA，T25 basic型，10,000rpm)，加入500ml冰水浴中，搅拌30min，得到EGF脂质纳米载体混悬液。20000rpm离心30min，进一步用200ml去离子水分散载体沉淀。

将1g Carbopol 1934、15gMC、16g甘油溶解于400ml去离子水，40℃搅拌溶解，将分散的载体混悬液加入其中，再加入0.5g抑菌剂苯扎氯胺；随后用浓度为0.5MNaOH溶液调节到pH6.8；用去离子水补至1000ml，灌装，即得。

实施例6～8

采用与实施例5相同的制备方法，由表2中给出的组成和工艺参数，制得实施例6～8的脂质纳米载体原位凝胶制剂。

表2：实施例5～8PH敏感型脂质纳米载体原位凝胶制剂组成和制备工艺

 实施例5  实施例6  实施例7  实施例8  hEGF 10mg  20mg  40mg  40mg  脂质材料 大豆油：6g 单硬脂酸甘油脂 24g  大豆油：10g  维生素A：40g  维生素E：12g  三棕榈酸甘油酯：  40g  大豆油：20g  胆固醇：4g  单硬脂酸甘油脂：  85g  乳化剂 聚氧乙烯蓖麻油： 15g 大豆卵磷脂：30g  聚氧乙烯蓖麻油：  45g  聚氧乙烯蓖麻油：  15g  Tween80：40g  蛋黄卵磷脂：15g  泊洛沙姆188：15g  增稠剂 Carbopol 1934：1g MC：15g  Carbopol 1934：5g  MC：15g  Carbopol 1974：  200g  Carbopol 1974：  200g  抑菌剂 苯扎氯胺：0.5g  三氯叔丁醇：0.1g  苯扎氯胺：0.05g  苯扎氯胺：0.35g  等渗调节剂 甘油：16g  甘油：18g  甘油：10g  甘油：10g  pH调节剂 0.5M NaOH  0.5M NaOH  0.5M NaOH  0.5M NaOH  纯化水 至1000ml  至1000ml  至1000ml  至1000ml  pH 6.8  6.6  7.0  6.7  平均粒径 297nm  375nm  387nm  366nm  PI 0.268  0.312  0.258  0.387

实施例9

首先按照下面表3中给出实施例9的组成，将20mg EGF、10g大豆油、24g单硬脂酸甘油脂、50g大豆卵磷脂溶解于100ml乙醇溶液，水浴50℃。在高剪切条件下(IKA，T25 basic型，10,000rpm)，加入500ml冰水浴中，搅拌30min，得到EGF脂质纳米载体混悬液。20000rpm离心30min，得到载体沉淀，进一步用200ml去离子水分散载体沉淀。

将5g Carbopol 1934、3g结冷胶、12g葡萄糖溶解于400ml去离子水，40℃搅拌溶解，将分散的载体混悬液加入其中，加入0.05g抑菌剂尼泊金乙酯；随后用浓度为0.5M三羟甲基氨基甲烷溶液调节到pH6.8，用去离子水补至1000ml，灌装，即得。

实施例10～12

采用与实施例9相同的制备方法，由表3中给出的组成和工艺参数，制得实施例10～12的脂质纳米载体原位凝胶制剂。

表3：实施例9～12离子/pH双敏感型脂质纳米载体原位凝胶制剂组成和制备工艺

 实施例9  实施例10 实施例11  实施例12  hEGF 20mg  30mg 5mg  20mg  脂质材料 大豆油：10g 单硬脂酸甘油脂： 24g  蓖麻油：10g  三棕榈酸甘油酯：  60g 维生素E：12g 三棕榈酸甘油酯： 40g  蓖麻油：20g  单硬脂酸甘油脂：  85g  乳化剂 大豆卵磷脂：50g  蛋黄卵磷脂：15g  Tween80：40g 蛋黄卵磷脂：20g 泊洛沙姆188：12g  蛋黄卵磷脂：68g  增稠剂 Carbopol 1934：5g 结冷胶：3g  Carbopol 1934：5g  结冷胶：3g  海藻酸钠：15g Carbopol 1974：5g 结冷胶：3g 海藻酸钠：15g  Carbopol 1940：  5g  海藻酸钠：15g  抑菌剂 尼泊金乙酯： 0.05g  苯扎氯胺：0.25g 苯扎溴胺：0.05g  苯扎氯胺：0.5g  等渗调节剂 葡萄糖：12g  甘油：15g 甘油：16g  甘油：18g  pH调节剂 0.5M三羟甲基氨 基甲烷  pH6.8磷酸盐缓  冲液 pH6.8磷酸盐缓 冲液  pH7.4磷酸盐缓  冲液  纯化水 至1000ml  至1000ml 至1000ml  至1000ml  pH 7.2  6.8 6.8  7.4  平均粒径 482nm  275nm 370nm  381nm  PI 0.378  0.219 0.388  0.316

实施例13

实施例1～12流变学考察，采用旋转粘度计(Brookfield DV-III)，1～100rpm/min；测定结果如表4所示：

表4：实施例1～12流变学考察数据

  实施例  体外粘度(25℃)  和人工泪液混合后粘度(37℃)  1  13.3cp  44cp  2  15.1cp  66cp  3  16.3cp  50cp  4  39.8cp  1680cp  5  48cp  1178cp  6  38.8cp  1709cp  7  68.9cp  1355cp  8  67.7cp  1209cp  9  32.5cp  766cp  10  40.1cp  1677cp  11  56.4cp  1300cp  12  28cp  784cp

由上述测定结果可见，实施例1～12制得的制剂在胶凝前粘度均较低，而与37℃人工泪液接触后其粘度均发生显著增加。从而，提示该制剂可实现原位胶凝的效果。在体外为粘度较低的液体，滴眼后发生胶凝，形成粘度较大的透明凝胶，以粘附于角膜表面，从而延长药物的角膜滞留时间，实现更加良好的治疗效果。