富硒铬酿酒酵母、富硒铬酵母产品及其生产方法

摘要

本发明涉及一种富硒铬酿酒酵母、得自该富硒铬酿酒酵母的富硒铬酵母产品及其生产方法。本发明的富硒铬酵母产品得自上述富硒铬酿酒酵母，其中每kg所述富硒铬酵母产品中含有100～4000mg的硒和100～4000mg的铬。该富硒铬酵母产品可以作为硒和铬的营养素补充剂添加到各种食品中，也可以单独做成制剂。它比无机的硒和铬毒性低，食用更安全，而且可以同时补充硒和铬两种重要的微量元素。

说明书

技术领域

本发明涉及一种富硒铬酿酒酵母、得自该富硒铬酿酒酵母的富硒铬酵母产品及其生产方法。

背景技术

硒和铬是人体所必需的微量元素，对人体有重要的生理功能，特别是对维护体内血糖、血脂和血压和抗癌等方面有重要作用。无机的硒和铬对人体毒性较大，而酵母在生长过程中能够吸收利用培养基中的无机硒和铬，并将无机硒和铬转化酵母细胞内的组分。将无机的硒和铬转化酵母硒和酵母铬，可以大大降低毒性。有许多研究是将硒和铬分开进行生产。但是，单纯的富硒酵母和富铬酵母要单独生产，工艺比较复杂，相应需要较高的生产成本。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了一种富硒铬酿酒酵母Z1.1(Saccharomycescerevisiae Hansen Z1.1)，已经于2005年10月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，保藏编号为CCTCC M 205123。它是由富硒酵母菌株S205和富铬酵母菌株C460通过原生质融合技术选育出来的。

在另一个方面中，本发明提供了一种富硒铬酵母产品，其得自上述富硒铬酿酒酵母，其中每kg富硒铬酵母产品中含有100～4000mg的硒和100～4000mg的铬。在一个优选的实施方案中，所述富硒铬酵母产品还含有40～55重量％的蛋白质、4～12重量％的灰分和0.5～8重量％的水，所述重量％基于富硒铬酵母产品的总重量。

在另一个方面中，本发明提供了用上述富硒铬酿酒酵母生产富硒铬酵母产品的方法，其包括下列步骤：

(a)使上述酿酒酵母在含硒1～1000μg/ml和铬1～1000μg/ml的培养基中，于26～36℃的温度下进行发酵；

(b)将酵母发酵液干燥，即得富硒铬酵母产品。

在一个实施方案中，所述培养基中硒含量优选为100μg/ml，铬含量优选为100μg/ml。在另一个实施方案中，所述的发酵优选在30℃温度下进行。

在另一个实施方案中，所述的干燥是将酵母发酵液进行喷粉干燥。

在一个可替代实施方案中，所述的干燥是将酵母发酵液进行转鼓过滤并将转鼓过滤后的酵母进行流化干燥。

本发明的一个有利之处是使酵母在生长的同时吸收利用硒和铬，从而生产出一种复合硒和铬的酵母产品。本产品富含硒和铬，可以作为硒和铬的营养素补充剂添加到各种食品中，也可以单独做成制剂。它比无机的硒和铬毒性低，食用更安全，而且可以同时补充硒和铬两种重要的微量元素。

附图说明

图1说明富硒铬酵母产品的生产工艺。

具体实施方式

下面将通过具体的实施例来详细描述本发明的特征和各个方面。除非特别指明，本发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试剂。此外，实施方案应理解为说明性的，而不是要限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：酵母菌种的获得

本发明中使用的富硒铬酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen Z1.1)已经于2005年10月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，保藏编号为CCTCC M 205123。它是由富硒酵母菌株S205(参见由本申请人与本申请同时提交的发明名称为“一种富硒酿酒酵母、富硒酵母产品及其生产方法”的专利申请)和富铬酵母菌株C460(参见与本申请同时提交的发明名称为“一种富铬酿酒酵母、富铬酵母产品及其生产方法”的专利申请)通过原生质融合技术选育出来的。具体实施步骤如下：

1)使用富硒酵母酵母菌株S205和富铬酵母菌种C460作为出发菌株。

2)利用单倍体生成技术，得到上述两菌株的单倍体菌株：SS013a和CS018a。

3)用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变SS013a营养缺陷突变，得到trp缺陷型：SS013a-15trp-。

4)吖啶黄诱发CS018a呼吸缺陷型突变，得到呼吸缺陷型菌株CS018a-11。

5)利用原生质体制备、融合、再生等技术，采用双标记将SS013a-15trp-和CS008a-11融合，在硒(硒酸盐或亚硒酸盐)含量为100μg/ml、铬(三氯化铬或醋酸铬)含量为100μg/ml、pH值为4～6.5的筛选培养基中26～36℃下培养18～48小时，筛选得到本发明的保藏编号为CCTCC M 205123的酵母菌株。该菌株具有强的富集硒铬的能力，保持两个亲本的特性，而且生长快，适合作为生产用菌株。

实施例2：生产富硒铬酵母产品

富硒铬酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将富硒铬酵母菌种接种到含糖量为5重量％、硒(亚硒酸盐)浓度为1μg/ml、含铬(三氯化铬)1μg/ml、pH值为4的麦芽汁固体斜面上，在26℃下培养48小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～6环到装有500ml的含糖量为5重量％、硒(亚硒酸盐)浓度为1μg/ml、含铬(三氯化铬)1μg/ml、pH值为4的麦芽汁专用培养瓶中，在26℃下培养48小时。

3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10升的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5重量％、硒(亚硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(三氯化铬)1μg/ml、pH值为4的卡氏培养瓶中，在26℃下培养48小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.1m³的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5重量％、硒(亚硒酸盐)浓度为1μg/ml、含铬(三氯化铬)1μg/ml、加1重量％磷酸氢氨、pH值为4的种子发酵罐中，在26℃下培养48小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1m³的含糖(淀粉水解糖)量为5重量％、硒(亚硒酸盐)浓度为1μg/ml、含铬(三氯化铬)1μg/ml、加1重量％磷酸氢氨、pH值为4的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，硒分批次加入，在26℃下培养36小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：用3～6Kpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性，是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。

8)包装：可以采用多种形式的包装成为富硒铬酵母。每kg富硒铬酵母中硒含量为105mg/kg，铬含量为112mg/kg，蛋白质41重量％，灰份小于4.5重量％，水分7.8重量％，所述重量％基于富硒铬酵母的总重量。

实施例3：生产富硒铬酵母产品

富硒铬酵母的生产流程同实施例2，具体工艺如下：

1)斜面菌种培养：将富硒铬酵母菌种接种到含糖量为25％、硒(硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(醋酸铬)1000μg/ml、pH值为6.5的麦芽汁固体斜面上，在36℃下培养18小时。

2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～6环到装有500ml的含糖量为25重量％、硒(硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(醋酸铬)1000μg/ml、pH值为6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在36℃下培养18小时。

3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有1000升的含糖(糖蜜)量为25重量％、硒(硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(醋酸铬)1000μg/ml、pH值为6.5的卡氏培养瓶中，在36℃下培养18小时。

4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有50m³的含糖(糖蜜)量为25重量％、硒(硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(醋酸铬)1000μg/ml、加5重量％磷酸氢氨、pH值为6.5的种子发酵罐中，在36℃下培养18小时。

5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到500m³的含糖(糖蜜)量为25重量％、硒(硒酸盐)浓度为1000μg/ml、含铬(醋酸铬)1000μg/ml、加5重量％磷酸氢氨、pH值为6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，硒、铬分批次加入，在36℃下培养14小时。

6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

7)干燥：采用100～180℃喷粉干燥

8)包装：可以采用多种形式的包装成为富硒铬酵母。每kg富硒铬酵母中硒含量为3980mg/kg，铬含量为3970mg/kg，蛋白质为55重量％，灰份小于11.8重量％，水分小于1.2重量％，所述重量％基于富硒铬酵母的总重量。

实施例4

本实施例增加一级发酵罐种子培养，其方法和发酵罐培养大致相同，其他工艺同实施例2，只是发酵罐发酵培养选择淀粉水解糖8重量％和糖蜜5重量％作碳源、氨水3重量％作氮源、磷酸氢氨重量％作磷源，培养液中的硒(亚硒酸钠)含量为100μg/ml，含铬(三氯化铬)100μg/ml，pH值为5.2，温度30℃鼓风培养26小时。

生产工艺为斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→一级发酵罐种子培养→二级发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。

本实施例生产出来的富硒铬酵母硒含量达到2100mg/kg，铬含量1995mg/kg，蛋白质48重量％，灰份7.6重量％，水份4.5重量％，所述重量％基于富硒铬酵母的总重量。

实施例5

本发明可以根据不同的干燥工艺生产有活性或没有活性的富硒铬酵母，本实施例采用沸腾干燥的方法干燥出具有活性的富硒铬酵母产品，干燥工艺是：进风温度100～180℃，出风温度50～120℃，干燥10～40分钟。

生产工艺：

斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。

本实施例生产出来的富硒铬酵母产品的活细胞率达到80％以上。其他工艺同实施例2。

实施例6：小鼠急性毒性试验

雌雄小鼠各20只，体重18～22克，按体重随机分成四组，每组5雌5雄，剂量依次为1.00g/kg.bw.、2.15g/kg.bw.、4.64g/kg.bw.、10.00g/kg.bw.。各组动物经停食16小时后，一次性经口给上述制备的富硒铬酵母粉，连续观察7天，记录各组动物的中毒反应情况和死亡只数，以确定富硒铬酵母对小鼠的半数致死量(LD₅₀)，结果见下表1。

                                  表1

组别与剂量 (g/kg.bw.) 性别  受试物 数量 (只)途径  动物反应  死亡数 (只)结论：LD₅₀  1.002.154.6410.00雌富硒铬酵母粉5555经口灌胃正常正常正常正常0000＞10.001.002.154.6410.00雄富硒铬酵母粉5555经口灌胃正常正常正常正常0000＞10.00

观察期间，各组动物均未发现有明显中毒反应，也无一例死亡，说明富硒铬酵母粉对雌、雄性小鼠的半数致死剂量(急性毒性)均为LD₅₀＞10.00g/kg.bw.。按急性毒性分级，富硒铬酵母粉应属实际无毒物质。

实施例6：小鼠精子畸形试验

25只昆明种雄性小鼠(体重27～35g)，按体重随机分成5组(每组5只)，即阴性对照组(蒸馏水灌胃)、阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg.bw)和低、中、高三个剂量组(受试物依次为1/8 LD₅₀、1/4 LD₅₀、1/2 LD₅₀即1.25、2.50、5.00g/kg.bw)。连续灌胃5天，再继续喂养30天，然后脱臼处死，取两侧副睾涂片，甲醇固定，伊红染色，高倍镜下检每片1000个精子中各种畸形精子的数量，并计算精子畸形率。结果见下表2。

                                  表2

  组别与剂量  (g/kg.bw.)  动物数  (只)  受试物  受检精子  数(个)  精子畸形  数(个)  精子畸形  率(％)  统计量  阴性对照  阳性对照  1.25  2.50  5.00  5  5  5  5  5  -  环磷酰胺  富硒铬  酵母粉  1000×5  1000×5  1000×5  1000×5  1000×5  86  311  86  91  89  1.72  6.22  1.72  1.82  1.78  三剂量组/阴性：  x²＝0.2082，p＝0.9763  三剂量组/阴性：  x²＝264.7，p＜0.0001

经X²检验三剂量组与溶剂对照组相比，小鼠精子畸形率均无显著性差异(P＞0.05)，但与阳性对照组比较存在极显著性差异(P＜0.01)，表明富硒铬酵母粉小鼠精子畸形试验为阴性。

实施例7：大鼠30天喂养试验

将80只SD大鼠(40雌40雄)适应性喂养5天后，按体重随机分为四组(每组10雌10雄)，依次为对照组和低、中、高三个剂量组。三个剂量组分别按人体最高推荐摄入量(每天1.67mg/kg.bw)的25倍、50倍、100倍(分别为41.75、83.50、167.00mg/kg.bw.d)给予受试物。受试物以掺入饲料的方式给予，大鼠日摄食量按其体重的10％计，三个剂量组每1000g动物饲料中受试物的添加量分别为2.5、5.5、10.0g。试验期间，各组大鼠单笼饲养，自由进食和饮水，连续喂养30天，每周称一次体重，并结算一次进食量。试验期间，各组动物均表现正常，无一例死亡，也未发现有明显中毒反应。试验结束时各组动物隔夜停食，次日断头处死，取脏器称重并作对照组和100倍剂量组的肝、肾、胃肠、脾、卵巢和睾丸病理切片检查；取血作血液学指标和血清生化指标的测定。

一般临床表现、体重与食物利用率、脏器重量与脏器系数、血液学检查、血清生化指标测定、组织病理学检查、细胞变性结果如下表3至表8所示。

表3.富硒铬酵母粉对大鼠体重的影响

性别  组别与剂量  (mg/kg.bw.)  动物数  (只)  始重  (g) 第1周 (g) 第2周 (g) 第3周 (g) 末重雌  对照  41.75  83.50  167.00  10  10  10  10  55±6  55±5  55±6  55±5 100±8 105±7 104±11 100±6 129±7 134±8 133±8 128±6 148±8 149±9 149±9 144±7 163±11 161±10 165±6 160±7雄  对照  41.75  83.50  167.00  10  10  10  10  62±6  61±6  62±5  61±5 117±7 121±10 120±6 122±7 165±11 167±13 167±9 172±10 201±16 207±12 206±12 209±9 230±17 231±11 240±9 235±15

经方差分析，各剂量组动物体重变化与对照组之间无显著性差异，说明受试物对生长期大鼠的体重变化没有明显影响。

表4.富硒铬酵母粉对大鼠总食物利用率的影响。

性别    组别与剂量    (mg/kg.bw.)    动物数    (只)体重增重(g) 进食量 (g) 食物利用 率(％) 统计量 (F) 概率值 (P)雌    对照    41.75    83.50    167.00    10    10    10    10108±14106±8101±7103±9 550±48 542±29 543±20 535±26 19.6±2.04 19.5±1.29 20.3±1.73 19.7±1.66 0.47 0.7022雄    对照    41.75    83.50    167.00    10    10    10    10169±17170±10178±10173±16 704±18 722±16 740±18 733±22 23.9±2.99 23.5±1.31 24.0±1.20 23.6±1.63 0.22 0.8798

表4结果表明：各剂量组动物在食物利用率上与两对照组相比，没有显著性差异(F检验)，说明加入受试物对大鼠食物利用率没有影响。

表5结果表明：对照组和各剂量组的各项血清生化指标均在正常值范围内。方差分析和两两分析结果表明：各剂量组和对照组相比，各项血清生化指标均无显著性差异。

表6结果表明：对照组和各剂量组的各项血液学指标均在正常值范围，且各组间各项血液学指标均无显著差异，表明富硒铬酵母粉对大鼠的血液学指标没有影响。

                                       表5富硒铬酵母粉对大鼠清生化指标的影响

性别  剂量组  (mg/kg.bw.) GPT(U/L) GOT (U/L)  BUN  (mmol/L) Glu (mmol/L) TG (mmol/L) TC (mmol/L)  TP(g/L)  Alb(g/L)  Cre(μ  mol/L)  雌   对照  41.75  83.50  167.00 38.2±5.1 40.4±6.7 37.0±6.9 37.5±6.8 167±21 161±12 155±18 161±19  5.62±0.65  5.81±0.78  5.91±0.65  5.46±0.68 5.46±0.42 5.46±0.39 5.22±0.50 5.34±0.30 0.87±0.14 0.86±0.14 0.82±0.19 0.76±0.17 2.25±0.23 2.01±0.30 2.16±0.17 2.20±0.23  77.2±6.1  77.9±6.3  76.4±4.9  80.9±3.8  33.8±2.4  34.3±2.9  34.8±2.4  35.3±1.6  71.1±4.4  68.8±3.3  69.0±3.1  69.6±4.3  雄    对照  41.75   83.50  167.00 37.3±7.7 35.7±6.9  34.3±7.8 39.1±7.4 170±21 170±19  160±19 166±11  5.67±0.48  5.67±0.61   5.71±0.65  5.47±0.53 5.41±0.56 5.49±0.31  5.37±0.30 5.01±0.33 0.75±0.12 0.64±0.15  0.79±0.14 0.66±0.18 2.11±0.17 2.04±0.16  2.12±0.17 2.10±0.20  77.6±4.6  79.0±7.4   76.9±7.4  80.6±5.6  33.2±2.0  34.1±3.1   34.2±1.9  32.9±3.4  66.0±4.3  67.1±3.8   69.4±3.3  67.9±4.4

                                     表6富硒铬酵母粉对大鼠血液学指标的影响

性别    剂量    (mg/kg.bw.) RBC (×10¹²/L)  Hb(g/L)  WBC  (×10⁹/L)                 WBC分类(％) 淋巴中性粒 单核其他  雌     对照    41.75    83.50    167.00 7.34±0.24 7.51±0.29 7.41±0.42 7.50±0.27  137.3±9.81  139.9±6.31  137.7±7.4  133.8±8.7  6.61±0.76  6.64±0.70  6.75±0.83  6.23±0.79 77.5±2.7 78.2±1.7 77.1±2.7 78.1±3.120.0±2.519.4±1.620.5±3.319.3±3.2 1.5±1.3 1.6±1.3 1.4±1.3 1.6±0.8各组均在0～1之间  雄      对照    41.75     83.50    167.00 7.36±0.25 7.41±0.16  7.11±0.29 7.28±0.27  137.7±5.3  135.6±6.2   134.5±6.8  138.5±8.7  6.34±0.65  6.81±0.46   6.52±0.65  6.37±0.72 78.3±2.9 77.7±1.8  78.1±2.8 77.3±2.519.4±2.919.8±2.1 19.6±2.220.0±2.4 1.3±1.4 1.4±1.1  1.4±1.5 1.8±1.2各组均在 0～1之间

                               表7.富硒铬酵母粉对大鼠脏器系数的影响

 性 别  剂量  (mg/kg.bw.  )  心  (％)   肝  (％)    肾   (％)    脾   (％)    卵巢/睾丸(％)    雌   对照 41.75  83.50 167.00 0.38±0.03 0.40±0.04  0.37±0.03 0.37±0.04 3.37±0.21 3.33±0.21  3.36±0.19 3.29±0.25  0.76±0.03  0.78±0.05   0.76±0.06  0.77±0.05  0.40±0.04  0.39±0.04   0.38±0.06  0.42±0.05 0.069±0.013 0.064±0.013  0.064±0.012 0.063±0.008  雄   对照 41.75  83.50 167.00 0.35±0.03 0.36±0.02  0.33±0.03 0.35±0.04 3.28±0.21 3.25±0.20  3.30±0.30 3.32±0.16  0.76±0.05  0.77±0.03   0.74±0.06  0.75±0.06  0.37±0.06  0.38±0.05   0.40±0.08  0.39±0.07 1.02±0.06 1.02±0.04  1.00±0.09 1.00±0.07

从表7可以看出，对照组和各剂量组的各项脏体比指标均在正常值范围，且各组间无显著性差异，表明富硒铬酵母粉对大鼠的脏器系数没有影响。

表8所示为对照组和高剂量组肝、肾、脾、胃肠、卵巢、睾丸显微镜检结果。对照组和各剂量组脏器外观颜色和大小没有发现异常，也没有发现明显的渗出、增生、水肿或萎缩等病变。

                                 表8

 组织病变程 度对照   0.25g/kg.bw.   0.50g/kg.bw.   1.00g/kg.bw. 例数    积分  例数  积分  例数  积分  例数    积分  肝脏  ±+ ++合计90 0     9    0    0    9  9  0   0     9    0     0    9肾脏  ± +0 0    0     0  0   0    0     0++合计    0     0    0    0     0    0  胃肠  ±+ ++合计    0    0     0     0    0     0    0    0    0     0     0    0     0    0  脾脏  ±+ ++合计    0    0     0     0    0     0    0    0    0     0     0    0     0    0 卵巢 /睾 丸 ± + ++ 合计    0     0     0      0     0     0     0    0     0     0      0     0     0     0总积分    9    9

富硒铬酵母粉急性毒性试验结果表明其LD₅₀＞10.00g/kg.bw.，属实际无毒物质，精子畸形试验结果均为阴性。大鼠30天喂养试验中，测定结果显示各项生理、生化指标均在正常值范围内波动，病理切片中也未发现有与受试物有关的毒性问题，故判定其通过食品安全性毒理学第一、二阶段的检验。

综上所述，本发明富硒铬酵母产品的特点是：

1、本发明使用的酵母菌种性能稳定，生长速率快，对硒、铬的利用率高，硒含量大于等于100mg/kg，铬含量大于等于100mg/kg，蛋白质大于重量40％，灰份小于12重量％，水分小于8重量％，所述重量％基于富硒铬酵母产品的总重量。

2、本发明生产的富硒铬酵母综合富硒酵母和富铬酵母的优势，而以前只能单独生产那富硒酵母和富铬酵母。

3、本发明生产的富硒铬酵母经试验证明是安全的，可以广泛食品和药品。