结合磁镊观测生物大分子的全反射近场显微镜

摘要

本发明涉及一种观测生物大分子的全反射近场显微镜，包括：显微镜成像系统、微量加样器、中央处理系统、磁镊样品控制台、样品反应槽。磁镊样品控制台包括主样品台、滑块、磁镊、滑块控制柄、滑轴、中间凹槽。磁镊固定于滑块上，可沿着滑轴的x轴轴向移动，其间的距离通过滑块控制柄控制，主样品台上装有磁镊和磁镊控制装置，其中间凹槽用来固定样品反应槽，样品反应槽为设置在磁镊上方的透明密闭系统，两端开有孔供样品进出，内部的生物大分子的一端连到槽内的上表面，另一端连有一顺磁性小球，磁球的上下位置可由磁镊控制；本发明有益效果是可对生物单分子进行研究，该显微镜不但可以保持很高的测量精确度而且能控制施加到单分子上的力的大小。

说明书

技术领域

本发明属于单分子操纵和观测装置。具体来说，本发明涉及一种装有磁镊装置的观测生物大分子的近场显微镜。

背景技术

在过去的比较长的一段时间内，研究生物大分子，比如蛋白质、DNA等大都是利用生化方法，从系统层次上进行研究。最近十几年中，随着新技术的发展，出现了许多新的研究方法，例如：光镊、磁镊、原子力显微镜等，使得从单分子层次上去研究生物大分子成为可能。同时，随着显微镜技术的发展，利用近场显微镜，这种分辨率更高的研究工具，可以从更小的尺度上观察所研究的对象。目前这些单分子的研究，已经越来越多的应用于研究DNA以及能与其相互作用的各种酶和蛋白，比如各类DNA解旋酶、RNA酶等。

目前大部分的单分子操纵装置中，DNA的一端连接到样品槽的表面之上，另一端连接到一个小球或者其它力传感器上面。通过操纵小球来控制单分子的受力情况，并且通过观察小球位置的变化来推测单分子的构象等变化。它们的观察系统基本上都是通过普通显微镜观察小球位置的变化，受到显微镜系统的限制，所观察的分辨率也相对较低。利用全反射近场显微镜能够在非常小的尺度和距离上观察距离的变化，但是难以控制作用于小球上的力的大小。

1999年开始，Zocchi利用全反射场中的小球的光强变化来计算出DNA长度变化的信息，从而研究DNA退火，以及DNA跟蛋白质之间的相互作用。该方法能够在非常小的尺度上观测DNA构象上的变化，并可达到其它方法很难达到的精确度。但是他所用的方法只能通过表面之间的静电斥力作为主要的力，难以控制和改变这种静电斥力，而且表面处理方法也受到一定的限制。其具体实验图如图1所示。

中国专利CN1869650A也公开了一种单分子操纵横向磁镊装置，该装置包括显微镜成像装置、磁镊装置、样品槽和中央监视器，所述磁镊装置包括磁镊和磁镊控制器，磁镊被水平放置在样品槽的侧面，并由磁镊控制器控制；单个生物分子的一端连接到样品槽内远离磁镊的侧壁上，另一端连接一顺磁性磁球，磁球通过磁镊控制；通过磁镊装置的移动或旋转，对磁球进行控制，然后寻找生物大分子并获取其长度的信息。

上述技术虽然也可以对生物单分子，包括生物大分子相关的酶及蛋白质等进行研究分析并可直接操纵并测量单分子的伸长及旋转。但是，上述的磁镊装置置于样品槽的侧面，其对顺磁小球产生水平的力的作用，不利于观察，并且操作起来比较困难，精度也不是太高。并且由于该方法用普通显微镜观测，分辨率较低，而且要自所观测的单分子本身需要相对较大的尺度，大概需要在微米量级，分辨率也在几十纳米量级。而本发明所观测单分子尺度在几十纳米量级，分辨率是几纳米量级。两者所做的研究对象基本不在一个尺度之上。本发明可以研究更加细微的单分子对象。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种将表面近场显微镜跟处于镜头和样品池之间的磁镊相结合的一种观测生物大分子的全反射近场显微镜装置及利用其观测生物大分子的方法。利用该装置可以克服普通单一近场显微镜不能灵活控制作用于单分子的力的缺点，可以方便地利用磁性小球给生物大分子施加可控大小的力，并且在高分辨率、高精度下实时快速的观察生物大分子。

为了实现此目的，本发明提供了一种结合磁镊的观测生物大分子的全反射近场显微镜，其包括：显微镜成像系统1、微量加样器2、中央处理系统3、磁镊样品控制台4、样品反应槽5。所述磁镊样品控制台4主要包括主样品台3-1、滑块3-2、磁镊3-3、滑块控制柄3-4、滑轴3-5、中间凹槽3-6。其中磁镊固定于滑块之上，可以沿着滑轴的x轴向移动，其间的距离可以通过滑块控制柄来控制，主样品台上安装有上述磁镊及磁镊控制装置，并且主样品台上的中间凹槽3-6用来固定样品反应槽，所述样品反应槽设置在磁镊的上方。

本发明的结合磁镊观测生物大分子的全反射近场显微镜，其中，所述的样品反应槽由载玻片和盖玻片夹成，中间利用双面胶隔开，再在两侧用环氧树脂胶密封，形成多条封闭的样品槽，优选5-8条，特别优选7条。这些封闭的样品槽两端设置有供样品进出的孔。

本发明的全反射近场显微镜中，样品反应槽中利用生化方法将单个生物分子一端连在该槽的内表面上，另一端连在顺磁性小球上。该磁球的上下位置可以通过设置在样品反应槽下部的磁镊进行控制。

其中，对样品反应槽内主要的施力控制设备是磁镊控制样品台中的磁镊。

其中，所述显微镜成像系统包括显微镜、普通光源、激光光源、CCD(电荷耦合器件)、物镜。其中，普通光源用于初步寻找合适的磁球，激光光源用于产生全反射光，形成衰逝场；最终磁球反射衰逝场中光强信息通过物镜和CCD传输到所述中央处理系统显示并记录。并且为了激光在样品反应槽与溶液界面产生全反射，需要利用棱镜进行光路调节，从而确定入射角度，进一步确定穿透深度。

所述显微镜成像系统设置在样品反应槽的下方，可以与样品相对平移以寻找符合条件的磁球进行观察。所述显微镜成像系统将捕获的图像通过CCD传输到中央处理器进行图像数据处理。

其中，所述磁镊为两块相对的端部斜坡状的矩形磁性材料，并由磁镊控制装置进行控制，使磁镊间有一定的间距，并可控制磁镊中间的磁场强度和梯度。所述磁性材料为永磁铁或者电磁铁。

本发明的有益效果是：

(1)可对生物单分子进行研究，包括DNA以及可以与其相互作用的酶、蛋白、盐类等。

(2)该发明所研究的单分子尺度在纳米量级。

(3)可以保持比较高的测量精确度(纳米量级)。

(4)能够控制施加到单分子上面的力的大小。

(5)能够提供一种非常细致的研究单分子生物的方法。更有助于了解生物反应的本质过程。

附图说明

图1为现有技术的示意图。

图2为本发明的整体结构示意图。

其中，1、显微镜成像系统；2、微量加样器；3、中央处理系统；4、磁镊样品控制台；5、样品反应槽；6、棱镜；7、物镜；8、CCD；9、主机；10、显示器；11、激光光源；12、进样管；13、出样口；14、普通光源。

图3显示了所述磁镊控制样品台的示意图。

其中，3-1、主样品台；3-2、滑块；3-3、磁镊；3-4、滑块控制柄；3-5、滑轴；3-6、中间凹槽。

图4为样品反应槽示意图，(a)(b)分别为正面和侧面结构。

图5为磁镊结构示意图，(a)(b)分别为侧面和正面结构。

图6为初步用此装置得到的DNA解旋曲线。

具体实施方式

本发明的观测生物大分子的全反射近场显微镜的示意图如图2所示：其中本发明的全反射近场显微镜包括显微镜成像系统1、微量加样器2、中央处理系统3、磁镊样品控制台4和样品反应槽5。磁镊样品控制台4的结构示意图如图3所示，其主要包括主样品台3-1、滑块3-2、磁镊3-3、滑块控制柄3-4、滑轴3-5、中间凹槽3-6。其中磁镊3-3固定于滑块3-2之上，可以沿着滑轴3-5的x轴轴向移动，其间的距离可以通过滑块控制柄3-4进行控制，主样品台3-1上安装有磁镊3-3及磁镊控制装置，并且中间凹槽3-6用来固定样品反应槽5，所述样品反应糙设置在磁镊的上方。图4(a)给出了样品反应槽的正面示意图，其中样品反应槽由盖玻片和载波片夹成，中间用双面胶隔开，然后两侧用环氧树脂胶密封，制成7条封闭的样品槽，槽的两侧设置有两个小孔，该孔可通过微量加样器将样品加入或排出，如图4(b)所示。该样品反应槽可以置于磁镊样品控制台4的中间凹槽3-6之中。样品反应槽内的单个生物大分子一端倒悬于样品反应槽的上表面，即载波片的一侧，另一端连接有一顺磁性小球，该磁球可以通过磁镊3-3对其上下位置进行控制。将显微镜成像系统1设置在该样磁镊样品控制台的下方，显微镜成像系统1和磁镊样品控制台4可以水平方向地相对移动，以便寻找最佳的磁球观测位置。显微成像装置1将获取的图像信息传输给中央处理系统3进行数据处理，该中央处理系统器3包括主机9和显示器10，主机9对图像进行处理后，由显示器10加以显示，从而可以进一步调整磁镊样品控制器4。显微成像系统1包括光源11、14，物镜7和CCD 8。该系统的光源部分包括激光光源11和普通光源14，普通光源14提供明场光，用来寻找上表面的焦平面，并且初步确定所需观测磁球，而激光光源11通过几次反射经过棱镜6后，在样品反应槽的载玻片和内部溶液之间产生全反射，以提供观察磁球所需要的衰逝场。棱镜6为具有与盖玻片相同折射率的玻璃材料，棱镜与载玻片之间存在一层与二者折射率相差很小的油性溶液，激光通过棱镜进入载玻片，并入射到内部溶液上产生全反射，在界面很小的一层空间内产生一个激光的衰逝场。处于衰逝场中的磁球所散射的图像信息通过物镜7和CCD 8在中央处理系统3处理并显示。微量加样器2主要由注射泵泵控制通过硅胶管向样品反应槽加入或更换样品，注射泵也可以用步进电机或者微流泵等代替。磁镊3-3是端部为斜坡状的矩形磁性材料，并可以用来控制磁球，纵向拉伸单分子的生物大分子。其结构示意图如图5所示。磁镊端部设计成斜坡形是为了更好地提供一个梯形磁场，并可以向下拉伸单分子。改进后也可以实现旋转单分子的功能，能够更有效地控制磁球。磁球所受到的力跟磁场强度以及磁场梯度有关，为了使磁球受到更大的力，应该尽量增大磁球处的磁场梯度，并且尽量使磁场近似沿着一个方向，保证磁球受到一个方向的力作用。所以将磁镊端部设计成斜坡形。

其中磁球受力由以下公式给出：

$>>F>\approx >m>>>dB>x>>dx>ver>>x>^>>>s>$

             式中，m为磁矩，

                   B为磁场强度。

但是上述测量方式的可操作性和准确性比较差，一般来说单分子的生物大分子受力的测量是由磁球的布朗运动给出，公式如下：

             式中，k_B为波尔兹曼常数，

                   T为绝对温度，

                   <z>为单分子的平均长度，

                   <(δx)²>为磁球x方向的方差。

在我们的设备中，<(δx)²>可以通过图像直接测量，<z>可以通过其它方法估算得出。

磁球散射全反射光的光强跟磁球与表面的距离的关系由下面的公式给出。

                  I＝I₀*e^-βh

                  式中β为穿透深度可用公式 $>>\beta >=>>>2>k>>i>\sqrt{>>>sin>\theta >>2>>-sup>>n>21>2sup>}>>s>给出$

                  I₀为磁球接触表面时光强

                  θ为入射光进入液面前的入射角度

                  n₂₁为溶液相对于入射光介质的折射率

                  k_i为入射光波矢

该装置能够实现将磁镊跟近场全反射显微镜结合，可以比较精确的控制施加于单分子的力，并且能够高精度的检测单分子长度变化，进一步推测其构象变化。同时这套系统还可以同时对多个分子进行同时观测，进一步提高实验效率。图6示出了在加了磁场之后，利用全反射光初步测量的DNA的解旋曲线。可以看出它能够比较好的观测到DNA解旋反应。值得注意的是，上文结合实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，但是本领域的技术人员容易想到，在本发明技术方案基础上，可以对本发明的技术方案进行各种变化和修改，但都不脱离本发明所要求保护的权利要求书概括的范围。