骆驼初乳免疫球蛋白IgA、IgG的提取工艺

摘要

本发明为骆驼初乳免疫球蛋白IgA、IgG的提取工艺，涉及生化产品领域，骆驼初乳是免疫球蛋白最丰富的天然来源，是自然界免疫因子最富集的生物资源之一，目前初乳资源的开发刚开始，产品中活性物质的有效浓度不够高，在加工过程中损失较大，因此开发高纯度天然活性免疫球蛋白的提取工艺是当务之急，本发明提供了用梯度洗脱法提取IgA和用超滤法、金属螯合色谱法提取IgG的工艺，经测试证明本发明分离纯化效率高，在IgA中基本不存在其它杂质，IgG纯度可达97％以上，还具有条件温和，操作简单，处理能力高，有利于骆驼奶的综合开发利用的有益效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生化产品领域，尤其是骆驼乳的深加工。

背景技术

初乳通常是指母畜分娩后7天特别是3天内所分泌的乳汁，其主要特点是：色泽黄而浓稠，有特殊的乳腥味和苦味；干物质含量明显高于常乳，其中球蛋白、白蛋白和无机盐类含量特别高，但乳糖含量较常乳低；富含维生素；酸度高；热稳定性差，加热至60℃即开始出现凝块等。因此，世界各国乳制品质量标准一般规定严禁使用初乳作原料乳，生产实践中的大量初乳除用于喂养新生幼仔外，富余部分多被废弃。

科学研究证实，初乳是自然界免疫因子最为富集的生物资源之一，其中较为重要的免疫因子就是免疫球蛋白。初乳中存在IgG、IgA、IgM、IgE和IgD等5类免疫球蛋白(Ig)，含量比常乳高10-100倍。IgG是含量最高的Ig，占Ig总量的55％以上。在初乳中IgG含量为50～90mg/mL，是常乳中含量的100倍以上。另外据研究，骆驼幼仔只能通过摄入初乳来获得母源抗体，因为骆驼的胎盘结构决定了母源抗体不能通过胎盘转移到幼驼，骆驼初乳是免疫球蛋白最丰富的天然来源。目前初乳资源的开发才开始，主要是一些健康食品，产品中活性物质的有效浓度不够高，其免疫活性在加工过程中损失较大，而且在资源综合利用方面也较欠缺，初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度高活性的天然活性蛋白质，特别是从中开发天然的生物药原料将具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的为提供骆驼初乳免疫球蛋白IgA和IgG的提取工艺。

实现本发明目的的技术方案如下：

提取骆驼奶初乳免疫球蛋白IgA的工艺方案：

1、初乳预处理

①取100mol初乳10000r/min离心10min，收集中层清液。

②取中层清液在0.2mol/l PB(pH6.0)中透析，换液3次以5000r/min，离心10min，收集上清液。

③取上清液，加入饱和0.06mol/l ZnSO₄ 200ml，用1mol/l Na₂CO₃调节pH到6.8--6.9，以5000r/min离心15min，收集上清液。

④取上清液加入饱和(NH₄)₂SO₄ 300mol，室温放置30min，以5000r/min离心30min，收集沉淀。

⑤取沉淀溶于60mol H₂O中，在0.02mol/l PB(pH8.0)中透析至无NH₄⁺。

2、IgA分离纯化

⑥将透析液上DEAE梯度洗脱柱，用0.02mol/l PB至0.3mol/l PB(pH8.0)进行梯度洗脱，收集洗脱峰位洗脱液。

⑦将洗脱峰位洗脱液用PEG浓缩至3mol，收集浓缩液。

⑧将浓缩液上分离纯化器，用0.01mol/l PBS(pH7.4)缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰位液，即获得较纯的球蛋白IgA。

提取骆驼初乳免疫球蛋白IgG的工艺方案有超滤法提取工艺和金属螯合色谱法提取工艺两种。

一、超滤法提取工艺：

①将初乳离心分离，得到去脂初乳；

②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理盐水＝1∶3的比例将去脂初乳稀释，调pH4.6，离心去除酪蛋白，得到乳清。

③超滤在超滤仪上用10KD、30KD膜进行过滤，得到浓缩了的乳清。

④梯度洗脱浓缩将超滤得到的浓缩乳清加入PBS缓冲液进行梯度洗脱浓缩，取12-17管之间洗脱液峰位的目的蛋白洗脱液。

⑤凝胶层析将目的蛋白洗脱液进行凝胶层析，用层析分析仪进行分析，得到较纯的球蛋白IgG。

二、金属螯合色谱法提取工艺

①将初乳离心分离，得到去脂初乳；

②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理盐水＝1∶3的比例将去脂初乳稀释，调pH4.6，离心去除酪蛋白，得到乳清。

③超滤在超滤仪上用10KD、30KD膜进行过滤，得到浓缩了的乳清。

④梯度洗脱浓缩将超滤得到的浓缩乳清在pH8.0-2.8，0.05ml/l Tris HAc和0.5ml/l NaCl连续梯度洗脱，得到得到UB、P₁、P₂、P₃四种峰位洗脱液，其中P₂、P₃峰位洗脱液的主要成分为免疫球蛋白G，纯度为90％。

⑤将P₂、P₃峰位洗脱液进行金属螯合色谱法提取，得到纯高达97％的IgG。

本发明用以上技术方案成功提取了骆驼初乳免疫球蛋白IgA和IgG，其特点和有益效果如下：

①IgA在体内的存在形式有2种。一种存在于血液中，称为血清型；另一种存在于分泌的乳汁或体液中，称为分泌型。分泌型IgA多以二聚体形式存在，其含量比血清中IgA高6～8倍。同时，在外分泌液中，IgA的含量比IgG高20倍以上，甚至高达100倍。因此，本发明在DEAE柱上用适当的梯度洗脱，即可得到较纯的IgA；进一步用分子筛提纯可得到高纯度的IgA。其后梯度PAGE电泳结果也证实了这一点。

②通过对骆驼初乳免疫球蛋白IgG乳清液进行超滤法浓缩实验，研究梯度洗脱法对其纯度的影响。结果表明，梯度洗脱法可以大大提高洗脱液中IgG的含量。说明超滤浓缩中的梯度洗脱法是进一步提高骆驼初乳中IgG分离纯度的有效手段。

③金属螯合色谱是一种利用金属离子与蛋白质中的某些氨基酸具有独特亲和力而分离纯化蛋白质的新技术。条件温和，蛋白活性回收率高，同时具有操作简单、处理能力较高、寿命长等优点。适宜于生物活性蛋白质的提取分离和纯化。本发明应用金属螯合色谱有效的分离纯化了骆驼初乳中的免疫球蛋白IgG，纯度达到97％。

④骆驼初乳是免疫球蛋白的优良资源，其分离纯化条件成熟、处理能力较强。可以以骆驼初乳作为原料得到纯度较高的免疫球蛋白，是一种极具开发利用价值的食品资源。

附图说明

图1为本发明骆驼初乳免疫球蛋白IgA在乳清DEAD洗脱时测得DEAE洗脱结果图

图2为IgA在乳清DEAD洗脱后再经分子筛洗脱的结果图

图3为骆驼初乳免疫球蛋白IgG乳清超滤浓缩时工作压力下的流量图

图4为不同浓缩倍数的乳清梯度洗脱后IgG含量

图5为梯度洗脱后经紫外检测得到的IgG洗脱曲线

图6IgG的初乳清金属螯合色谱分离结果图

上样量：20mol

洗脱方法：pH8.0-2.8 0.05mol/l Tris HAc，0.5mol/l NaCl梯度洗脱

          P₂、P₃峰主要成分为免疫球蛋白IgG

具体实施方式

通过下述实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

一、骆驼初乳免疫球蛋白IgA的提取

1、实验材料

骆驼初乳来自甘肃安西锁阳镇张沟村农户。

分离纯化用DEAE SepHarose(Fast Flow)及Superdex-200购自PHarmacia公司。

室验用0.06mol/l ZnSO₄，1mol/l Na₂CO₃，饱和(NH₄⁺)₂SO₄，0.2mol/L PB(pH值为8.0)，0.02mol/L PB(pH值为8.0)，0.3mol/L PB(pH值为8.0)，0.01mol/LPBS(pH值为7.4)，梯度PAGE所需试剂为自行配制。

垂直电泳仪为Hofer公司产品，紫外分光光度计为PHarmacia公司产品，凝胶成像系统为Kodak公司产品。

2实验方法

2.1骆驼初乳的预处理

取100ml骆驼初乳，在10000r/min下，离心10min，取中层乳清，于0.2mol/L PB(pH值为6.0)中透析，换液3次，以5000r/min、离心10min。取上清液，加入200ml、0.06mol/L ZnSO₄，用1mol/L Na₂CO₃调pH值为6.8～6.9，以5000r/min、离心15min。取上清，加入300ml饱和(NH₄)₂SO₄，室温放置30min后，以5000r/min、离心30min。取沉淀，溶于60ml H₂O中，于0.02mol/L PB(pH值为8.0)中透析至无NH₄⁺。

2.2骆驼初乳中IgA的分离纯化

样品上DEAE SepHarose(Fast Flow)柱，用0.02mol/LPB(pH值为8.0)至0.3mol/L PB(pH值为8.0)梯度洗脱。收集洗脱峰位液，用PEG 20000浓缩至3ml。上Superdex-200柱，用0.01mol/L PBS(pH值为7.4)洗脱，收集洗脱峰位液。经PEG 20000浓缩后测280nm和260nm处的OD值，计算蛋白浓度。

3实验结果

3.1骆驼初乳中IgA的分离纯化

将预处理后的骆驼初乳清上DEAE SepHarose(Fast Flow)柱，得到的洗脱峰如图1所示。

由图1可以看出，骆驼IgA洗脱峰分布在25～38号管。收集上述各管内样品浓缩后上Superdex-200柱，得到的洗脱峰如图2所示。

分子筛洗脱只有一个洗脱峰，可见DEAE梯度洗脱已能将IgA从样品中分离出来。为进一步鉴定提纯的IgA纯度，收集19～23号试管内样品浓缩后采用4％～20％梯度PAGE。结果表明IgA分子量大小为17ku左右，基本不存在其他杂带。可以断定该骆驼初乳经提纯后，已从中得到纯的骆驼IgA。测280nm和260nm处的OD值，计算其浓度为4.25mg/ml。

二、骆驼初乳免疫球蛋白IgG的提取

1材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜骆驼初乳甘肃定西锁阳镇新沟村农户提供；葡聚糖SepHadex-G200，标准IgG，SDS-PAGE电泳试剂购自Sigma公司；Chelating SepHarose fast flow购自Pharmacia公司；洗脱液0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液自制；其他试剂均为国产分析纯。

超滤仪(法国Millipore公司)；层析柱(1cm×9cm)，DHL-A电脑恒流泵，梯度混合仪，蠕动泵，HD-3紫外检测仪，DBS电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)；垂直电泳系统，低温冷冻离心机(日本日立公司)。

1.2实验方法

1.2.1初乳清的制备

新鲜初乳经过滤后，低温离心3000r/min 30min。弃去上层油脂和下层沉淀，得到去脂初乳。以去脂初乳∶生理盐水1∶3的比例稀释，调pH至4.6，34℃恒温培养30min，4000r/min 20min离心。弃去上层残余油脂和下层的酪蛋白沉淀，即得到初乳清。

1.2.2乳清的超滤浓缩

超滤仪进口压力207Kpa，出口压力69Kpa，压力差134Kpa。分别以10KD、30KD膜过滤状态下工作。

1.2.3凝胶的处理

Sephadex G-200干粉蒸馏水室温充分溶胀24小时，然后用倾泌法将悬浮的较细颗粒除去。

1.2.4金属螯合色谱柱的制备

取Chelating SepHarose fast flow 16ml装柱(1.6cm×20cm)，用0.05mol/L的CuCl₂上柱，使柱子的上部1/2至2/3成为载Cu²⁺树脂。用5倍体积的去离子水洗柱，使未吸附的Cu²⁺洗脱。最后用0.05mol/LTrisHAc、0.5mol/LNaCl起始缓冲液平衡色谱柱。

1.2.5免疫球蛋白的测定

单向免疫法测定

1.2.6洗脱液的分析

自上样起用自动收集器收集洗脱液，每管5ml，在280nm下测定吸光度值(OD₂₈₀)，并绘制洗脱曲线。相关组分用SDS-PAGE电泳分析其成分。

1.2.7SDS-PAGE电泳

浓缩胶浓度4％，分离胶浓度10％。

2结果与讨论

2.1超滤法结果讨论

2.1.1初乳清的制备

初乳由于含有较多的蛋白与脂肪，所以其黏度远大于常乳。离心分离后的脂肪残留率高达5％。针对初乳不稳定的特性，采取去脂初乳∶生理盐水1∶3的比例稀释并调pH至4.6，然后离心去除酪蛋白。这样既最大限度的去除了酪蛋白，又减少了因免疫球蛋白与酪蛋白在离心时共沉淀而造成的损失，同时也进一步降低了脂肪的残余含量。

2.1.2乳清的超滤浓缩

乳清的超滤浓缩结果见图3。在10KD、30KD膜过滤状态下工作时流速都较为稳定。此种情况下，超滤效率较高，适于实际情况应用。

2.1.3梯度洗脱法浓缩乳清中的IgG

当乳清超滤浓缩后，乳清中蛋白浓度越来越高，影响超滤速度。且如果继续浓缩会加大膜的压力，对膜产生破坏。为了进一步提高IgG纯度，用PBS缓冲液进行梯度洗脱。结果见图4

2.1.4凝胶层析结果

用部分收集仪收集洗脱液，每管5ml，紫外检测仪在280nm下测定吸光度值，记录仪绘制。结果见图5

由图5可见，初乳乳清经洗脱后只有一个洗脱峰位于12-17管之间，经紫外检测证明是目的蛋白。经SepHadex G-200层析以后得到较纯的目的蛋白。

2.2金属螯合色谱分离结果讨论

2.2.1洗脱结果

在应用pH8.0-2.8 0.05mol/LTrisHAc、0.5mol/LNaCl连续梯度洗脱时，共得到四种组分，即UB、P₁、P₂、P₃.

2.2.2电泳结果

由图6可见，洗脱分离组分中P₂、P₃峰主要成分为免疫球蛋白IgG，纯度为90％。免疫球蛋白对金属螯合色谱的亲合能力最大，因此可以采用增加上样量使其突破饱和点再用强洗脱液洗下吸附的免疫球蛋白的方法得到纯度较高的免疫球蛋白。此法得到的免疫球蛋白纯度可达到97％，活力几乎无损失。

从上述实施例得出：提取IgG的超滤法工艺和金属螯合色谱法工艺都能对骆驼初乳进行纯化，获得高纯度的IgG。