多环芳烃污染土壤中原位降解菌及生物修复能力鉴定方法

摘要

本发明涉及多环芳烃(PAHs)污染土壤微生物修复技术领域，是利用磷脂脂肪酸分析(PLFA)技术和稳定同位素比率质谱技术(IRMs)结合鉴定PAHs污染土壤中原位高效降解菌的新方法。本发明利用磷脂脂肪酸为生物标记物，结合稳定同位素示踪技术，根据土壤中提取磷脂脂肪酸的δ值的差异鉴定原位土壤中PAHs的降解菌或菌群，也可分析出已知菌株是否为污染土壤中的土著降解菌。该方法可有效的将微生物的群落结构和功能结合起来。本发明目的是提供一种可真实反映PAHs污染土壤中原位降解菌或菌群的方法，从而可以分析出所选菌株是否为污染土壤中的土著降解菌及其降解能力。本发明方法精确度高，非常适用于PAHs污染土壤原位微生物修复研究和验证。

说明书

技术领域

本发明涉及环境微生物修复技术领域，具体的说是利用磷脂脂肪酸分析(PLFA)技术和稳定同位素比率质谱技术(IRMs)结合，鉴定多环芳烃(PAHs)污染土壤中原位高效降解菌及其生物修复能力的新方法。

背景技术

PAHs是一大类常见的有机污染物，主要存在于石油污染的土壤和河流中，已有16种PAHs被美国环保署(Environmental Protection Agency，EPA)列为优先污染物。目前对污染治理方法有物理法、化学法和生物法。普遍认为微生物降解是去除污染物的最有效手段之一。过去依靠传统筛菌的治理方法工作量大，成果甚微，筛选出的菌种投入到环境中，其降解功能不稳定，实际应用价值不高。随着分子生物学的发展，对原位土壤中的降解菌的了解越来越多，但仍很难将原位土壤微生物的群落结构与其功能有机的联系起来。

磷脂是细胞膜的重要组成成分之一，特殊的磷脂脂肪酸可以指示特定的微生物，可作为生物标记物指示环境中微生物的种群结构和变化规律。稳定同位素方法(IRMs)是一种无放射性、高灵敏度的分析方法，与磷脂脂肪酸分析(PLFA)方法结合可以高精度的检测出PAHs污染物的原位降解菌或菌群，把原位微生物的群落结构和功能联系起来，为污染物的原位微生物治理提供可靠依据。

发明内容

本发明目的是提供一种可真实反映PAHs污染土壤中原位降解菌或菌群的方法，是一种鉴定原位土壤中PAHs土著降解菌及其修复能力考查的新方法。

本发明的技术方案是：

1、污染土壤样品的采取和处理

采取0-20cm土层土壤样品，及时过1cm筛，4℃保存。

2、土壤样品的培养

1)土壤样品(鲜重)1g置于培养瓶内，添加¹³C标记的PAHs污染物，同时以添加相同量的非标记的普通的PAHs污染物作为对照，混匀；

2)在各培养瓶中补加3g土壤样品，充分混匀；

3)在各培养瓶的土壤中插入一小管，内置吸有10％(质量浓度)NaOH的脱脂棉，以吸收¹³CO₂，用封口膜封口；

4)准备一容器，将其内铺满滤纸，将培养瓶置于容器内，25℃避光培养。培养过程中用0.1mol·L^-1NaH₂PO₄溶液保持滤纸浸湿，以保持土壤水分。培养时间与PAHs污染物的种类有关，大约10-30天。

3、磷脂脂肪酸(PLFA)的提取

1)将培养后的土壤样品全部取出，置玻璃离心管中，加入浸提液(柠檬酸缓冲液(0.15mol·L^-1，pH4.0)/氯仿/甲醇为0.8/1/2，体积比)15ml，铝箔包被避光，室温，150rpm(转/分钟)摇床震荡2-3小时；

2)2500rpm离心10min，收集上清液至新离心管中，避光；

3)原离心管(PLFA提取的步骤1)中再加入8ml浸提液，震荡2小时，离心，提取上清液，与原上清液(PLFA提取的步骤2)混合；

4)在收集的上清液中加入5.5ml柠檬酸缓冲液和5.5ml氯仿，使柠檬酸缓冲液/氯仿/甲醇为0.9/1/1(体积比)，-20℃静置过夜，时间10-24小时；

5)取出样品放至恢复室温，吸上层弃去，保留氯仿层，37℃下氮气吹干，-20℃避光保存；

6)样品恢复至室温，用4×150μl氯仿(即四次处理，每次用150μl氯仿)转移至处理好的硅胶柱或SPE柱(固相萃取柱)中，用5ml氯仿洗脱得到中性脂，用10ml丙酮洗脱得到糖脂，用5ml甲醇洗脱得到磷脂，收集至新管，37℃下用氮气吹干，-20℃避光保存；

7)样品恢复至室温后，加入1ml 1∶1的甲苯∶甲醇(体积比)，1ml 0.6mol·L^-1KOH(新鲜配置)的甲醇溶液，37℃水浴保持15min，甲酯化；

8)甲酯化后待恢复至室温，加2ml去离子水+1ml 1mol·L^-1醋酸(新鲜配置)+2ml正己烷漩涡混匀30s，2500rpm离心10min，取正己烷相(上层)到KD-浓缩瓶；

9)重复上一步，将两次的提取物混合，37℃下用氮气吹干，加50ul正己烷溶解，转移至备好的气相色谱样品瓶内，该样品即为脂肪酸甲酯混合物，含有20-40种不同脂肪酸。

4、GC-c-IRMs(气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法)分析

将样品上同位素比率质谱仪测定，气相色谱条件：石英毛细管色谱柱HP-5或DB-5，仪器条件为：起始温度140℃，保持3min；以4℃·min^-1的速度升温至230℃，保持2min；以2℃·min^-1的速度升温至250℃，保持2min；以10℃·min^-1的速度升温至300℃，保持10min；通过下面公式计算同位素富集的脂肪酸的碳同位素比率δ¹³C_PLFA值。

δ¹³C_样品＝[(R_样品/R_标准品)-1]×10³‰，R＝¹³C原子数/¹²C原子数      (1)

δ¹³C_PLFA＝[(Cn+1)×δ¹³C_样品-δ¹³C_甲醇]/Cn                        (2)

其中R_样品和R_标准品分别代表样品和国际标准品的¹³C/¹²C比，R_标准品为国际通用标准，碳的同位素标准品为Vienna PeeDeeBelemnite(VPDB)，R_VPDB＝0.00112372±0.0000090；δ¹³C_甲醇为甲酯化(PLFA提取的步骤7)所用甲醇的δ值；Cn为PAHs的碳原子数。将添加同位素标记物的样品的δ¹³C_PLFA(由公式2计算得到)值与对照(添加非同位素标记的普通PAHs污染物)相比，其中δ¹³C_PLFA值显著大(P＜0.05)的脂肪酸所代表的菌或菌群即为参与PAHs代谢的降解菌。

5、原位降解菌的鉴定及修复能力考查

以原位土壤培养实验(GC-c-IRMs分析)结果为依据，将从土壤中筛选得到的PAHs降解菌接入灭菌和不灭菌的原位土壤中，按照上述步骤2、3、4(即：土壤样品的培养、磷脂脂肪酸的提取、GC-c-IRMs分析)操作，计算得到各种磷脂脂肪酸的δ¹³C_PLFA值。灭菌土壤中的δ¹³C_PLFA值和对照(添加非同位素标记的普通PAHs污染物)相比显著大(P＜0.05)，而且和添加同位素标记物的样品相比，¹³C富集的脂肪酸种类相同，则可认为该菌为土壤中的原位降解菌；如果不灭菌的土壤中的δ¹³C_PLFA值和对照(添加非同位素标记的普通PAHs污染物)相比也显著大(P＜0.05)，和添加同位素标记物的样品相比，¹³C富集脂肪酸不仅相同，而且δ¹³C_PLFA值有增大的趋势，则可认为该菌具有该PAHs降解的潜力。反之亦然。

本发明的有益效果是：

1、本发明利用PLFA与IRMs结合技术，根据与对照相比δ值显著大的脂肪酸所代表的菌(菌群)即为参与代谢的降解菌。也可分析出所选菌株是否为污染土壤中的降解菌及其降解潜力。

2、本发明将土壤细菌的群落结构和功能结合起来，真实反映原位土壤降解菌，精确度高，非常适用于PAHs污染土壤原位微生物修复研究和验证。

附图说明

图1为土壤培养实验中所用装置。

图2为PLFA提取的流程图。

具体实施方式

如图1所示，土壤培养实验中所用装置包括：培养瓶1、培养容器2、CO₂吸收装置3、保持土壤水份的滤纸4等，滤纸4置于培养容器2底部，培养瓶1置于培养容器2中，土壤样品5和CO₂吸收装置3置于培养瓶1中。

本发明首先选取沈抚灌区石油污染土壤和多环芳烃——菲为研究对象，具体操作步骤如下：

1、选取沈抚灌区石油污染地区，采集0-20cm土层土壤样品，及时过1cm筛，4℃保存。

2、土壤样品培养实验

1)准确称量土壤样品(鲜重)1.00g置于培养瓶内，在通风橱内，添加0.04mg/ml¹³C标记的菲的丙酮溶液100ul，同时做添加相同量的非同位素标记菲的丙酮溶液、只添加丙酮和只有土壤3组对照；

2)将培养敞口放置2小时，待丙酮溶液挥发完全，混匀。再在各培养瓶中补加3.00g土壤样品，充分混匀；

3)在各管的土壤中插入一小管，内置吸有10％(质量浓度)NaOH的脱脂棉，以吸收¹³CO₂，封口膜封口；

4)将备好的塑料方盒内铺满滤纸，将培养瓶置于方盒内，25℃避光培养。培养过程中用0.1mol·L^-1NaH₂PO₄溶液保持滤纸浸湿，以保持土壤水分，培养30天。

3、PLFA的提取，提取流程如图2所示：

1)取培养后的土壤样品置30ml玻璃离心管中，加入15ml浸提液液(柠檬酸缓冲液(0.15mol·L^-1，pH4.0)/氯仿/甲醇为0.8/1/2，体积比)，铝箔包被避光，室温，摇床震荡3小时；

2)2500rpm离心10min，收集上清液至30ml离心管中，铝箔包被避光，内外标记；

3)原离心管(PLFA提取的步骤1)中再加入8ml浸提液，震荡2小时，提取上清液，与原上清液(PLFA提取的步骤2)混合；

4)在混合的上清液中依次加入5.5ml柠檬酸缓冲液和5.5ml氯仿，使柠檬酸缓冲液/氯仿/甲醇为0.9/1/1(体积比)，-20℃静置12小时；

5)取出样品放至室温，用滴管吸上层弃去，保留氯仿层，37℃下氮气吹干；-20℃避光保存；

6)取出样品，恢复至室温，用4×150μl氯仿(即四次处理，每次用150μl氯仿)转移至处理好的硅胶柱中，用5ml氯仿洗脱得到中性脂，用10ml丙酮洗脱得到糖脂，用5ml甲醇洗脱得到磷脂，收集至新管，37℃下用氮气吹干，-20℃避光保存；

7)样品取出恢复至室温后，加入1ml 1∶1(体积比)的甲苯∶甲醇，1ml新鲜配置的0.6mol·L^-1KOH的甲醇溶液；37℃水浴保持15min，甲酯化，取出恢复至室温；

8)依次加2ml去离子水、1ml 1mol·L^-1醋酸(新鲜配置)、2ml正己烷漩涡混匀30s，2500rpm离心10min，取正己烷相(上层)到KD-浓缩瓶；

9)重复上一步，将两次的提取物混合，37℃下用氮气吹干，加50ul正己烷溶解，转移至备好的气相色谱样品瓶内，该样品即为脂肪酸甲酯混合物；

10)样品定性采用GC/MS(气相色谱与质谱联用)分析。

4、同位素比率质谱仪分析

样品δ¹³C_PLFA值采用稳定同位素比率质谱仪Thermo Finnigan DELTA^plusXP(色谱柱：DB-5，30m)测定。仪器条件为：进样口温度250℃，进样量2ul，无分流比；起始柱温140℃，保持3min；以4℃·min^-1的速度升温至230℃，保持2min；再以2℃·min^-1的速度升温至250℃，保持2min；最后以10℃·min^-1的速度升温至300℃，保持1min。

同位素标准品为Vienna PeeDeeBelemnite(VPDB)，R_VPDB＝0.00112372±0.0000090，计算公式为δ¹³C_PLFA＝[(Cn+1)×δ¹³C_样品-δ¹³C_甲醇]/Cn，δ¹³C_甲醇＝-37.57‰。其中δ¹³C_甲醇为甲酯化(PLFA提取的步骤7)所用甲醇的δ值，Cn为菲的碳原子数14。可计算各种脂肪酸的δ¹³C_PLFA值。

5、原位降解菌的鉴定及修复能力考查

以沈抚灌区石油污染土壤为对象，筛选多环芳烃——菲的高效降解菌，并获得三株降解性能较高的菲降解菌。将三株菌分别接入灭菌(灭菌：121℃，20-30分钟)和不灭菌的土壤中，25℃，培养30天，并按照上述方法提取磷脂脂肪酸，测定其δ¹³C_PLFA值，分析同位素富集的脂肪酸种类即可鉴定已获菌株是否为原位土壤中的降解菌及其修复能力。

实施例：

通过上述实验检测到所培养的土壤中有8种¹³C同位素富集的磷脂脂肪酸，分别是10Me18:0，16:1ω7c，16:1ω7t，16:1ω9，18:1ω9c，18:1ω9t，a15:0和16:0(“:”前的数字代表碳原子数；“:”后的数字代表双键数；“10Me”表示一个甲基基团在距分子末端第10个C上；“ω”表示在分子末端第七个C有双键；“c”表示顺式；“t”表示反式；“a”表示支链反异构)。不同脂肪酸可指示不同的微生物类群，如分支的脂肪酸代表革兰氏阳性细菌，单不饱和的脂肪酸代表革兰氏阴性细菌，脂肪酸10Me18:0代表放线菌，脂肪酸18:2ω6，9代表真菌。实验所得结果表明G⁺细菌、G^-细菌和放线菌参与了菲的代谢，为检测到真菌的参与。

将从原位土壤中筛选得到的3株降解菌，进行稳定同位素标记培养并测定其δ¹³C_PLFA值，其中有2株菌为沈抚灌区污染土壤中菲的土著降解菌，且具有降解潜力，经鉴定分别为Burkholderia和Pseudomonas。