胸腺嘧啶DNA糖基化酶对信号转导途径的调控作用

摘要

本发明公开了一种胸腺嘧啶DNA糖苷酶或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节经典Wnt信号转导途径的药物。本发明还公开了一种筛选调节Wnt信号转导途径异常活化的物质的方法。本发明首次揭示胸腺嘧啶DNA糖苷酶参与经典Wnt信号转导途径，为筛选调节Wnt信号转导途径的药物、或预防和/或治疗肿瘤的药物提供了极好的靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)参与调节经典Wnt信号转导途径的新功能。

背景技术

信号转导是生物学研究的前沿领域之一，近年来发现在不同种族个体间，存在一个非常保守的信号通路，它的信号分子是一类糖蛋白超家族-Wnt蛋白，故称其为Wnt信号转导途径。Wnt信号分子家族包括十几个成员，目前发现不同的Wnt分子引起的信号反应有所差异，分为经典的Wnt信号转导途径(Wnt/β-连环蛋白)，例如Wnt3和Wnt8，及非经典Wnt信号转导途径(Wnt/Ca²⁺和Wnt/JNK途径，其中Wnt/JNK途径目前尚未找到确定的Wnt配体)，例如Wnt11和Wnt5a。其中对经典Wnt信号途径研究较多，对其的信号转导分子机制也相对而言更清晰。

Wnt信号转导途径调节控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。Wnt信号转导途径具有如此重要的生物学意义，因此对其的研究也是近十几年来的一个研究热点。Wnt信号转导途径在不同物种之间具有高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立了经典Wnt信号转导途径的分子框架。

发育过程中，特定的时间和特定的环境诱导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体卷曲蛋白(Frizzled)家族成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6，将信号传递至细胞内。在没有Wnt信号刺激时，这条信号转导途径的关键分子β-连环蛋白(β-catenin)参与由支架蛋白Axin，结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3β(GSK3β)，酪蛋白激酶1(CK1)，以及β-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3β和CK1作用下受到磷酸化标记，进而在β-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激下，胞内的蓬乱蛋白(Dishevelled，Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子打散Axin、APC和GSK3等形成的降解复合物，Axin被LRP带上膜进而降解。β-连环蛋白磷酸化水平降低，进而可以在细胞质中大量积累。部分β-连环蛋白进入细胞核，与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/T细胞转录因子(LEF1/TCF)家族的相互作用，启动下游靶基因的开放。经典Wnt信号的最终效应是通过β-连环蛋白在核内与TCF/LEF1结合后激活下游靶基因的转录。一般认为这种激活机制是通过β-连环蛋白结合TCF/LEF1，使TCF的转录抑制作用变为转录激活。TCF在没有与Arm/β-连环蛋白结合时能与转录抑制因子Groucho家族成员形成复合物，通过HMG结构域结合DNA，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，TCF与入核的β-连环蛋白结合，从而与Groucho的结合下降，解除抑制作用(Gumbiner BM.1998.van Noort M.&Clevers H.2002.Wodarz A.&Nusse R.1998.)。

Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发现，大约90％的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH，van Es JH，Clevers H.2003)中均发现了Wnt信号异常或者是转导途径中信号分子的突变。

经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游靶基因的表达而得以实现。而很多靶基因比如c-myc、细胞周期蛋白D1，在细胞增殖中起到重要作用。研究表明，在很多癌症细胞里可以检测到β-连环蛋白在细胞核中的大量积累以及c-myc、细胞周期蛋白D1的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的转录复合物处于高转录活性状态，使下游的靶基因大量表达。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt信号效应，那么对转录复合物的分子调控机制的研究，也就具有十分重要的意义。近几年许多研究工作揭示了越来越多的调节分子参与Wnt信号转导途径下游的β-连环蛋白-TCF/LEF1转录复合物极其分子机制。例如PHD指结构蛋白pygopus(pygo)，通过泛素识别酶BCL9结合到β-连环蛋白，促进了β-连环蛋白的细胞核定位和它的转录活性。β-连环蛋白还结合一些转录酶复合物分子，如TATA结合蛋白(TBP)，DNA螺旋酶桥蛋白(pontin)52，此外β-连环蛋白还与染色体异构变形相关复合物Swi/Snf的中心分子Brg-1相互作用。一个重要的多功能的转录调节子-乙酰基转移酶CBP/p300也被发现是β-连环蛋白的转录激活子。(Kramps T，Basler K.2002.Townsley FM，Bienz M.2004.Hecht A，KemlerR.1999，2000.Wood MA，Clevers H.2001)这些发现，一方面表明这个转录复合物召集多种调节分子，另一方面也提示了这个转录复合物受到了复杂的调控。

胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)，其最初是作为一种DNA错配碱基对的修复酶被克隆发现，主要参与识别和修复错配的G·T/G·U碱基对的过程。在DNA双链发生G·T或者G·U错配的位点，TDG发挥糖苷酶的功能，水解T或者U的糖苷键，使之从DNA双链上解离，形成无嘧啶位点，招募无嘧啶位点内切酶到此位点发挥作用，进而发生一系列的DNA修复过程。因此TDG在DNA错配碱基修复中起到重要作用。近几年的研究发现TDG也参与了基因转录的调节。已有报道TDG可以与一些核受体发生蛋白质相互作用，参与这些信号途径下游转录复合物并且影响其转录活性。还有研究表明TDG和乙酰化酶CBP有蛋白质相互作用，并且调节CBP的转录活性。这些发现为联系DNA修复和转录调控提供了新的线索。(Neddermann P，Lettieri T.1996.Harbers US，Chambon P.1998.Tini M，Chambon P.2002.Chen D，Ali S.2003)。

但是，目前还没有发现TDG参与Wnt信号转导途径的报导。找到一种新的参与调节Wnt信号转导途径的分子并对其发挥作用的分子调节机制加以影响，可为Wnt信号转导途径相关的疾病提供新的预防或治疗手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与调节Wnt信号转导途径的分子。

本发明的目的还在于提供一种筛选调节TDG与LEF1相互作用的物质的方法。

在本发明的第一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)或其拮抗剂或抑制剂的用途，用于制备抑制经典Wnt信号转导途径的药物。

在本发明的一个优选例中，提供胸腺嘧啶DNA糖苷酶或其拮抗剂或抑制剂用于制备药物的用途，所述药物抑制经典Wnt信号转导途径异常活化，或治疗经典Wnt信号转导途径异常活化所导致的疾病。

在本发明的另一优选例中，所述的经典Wnt信号转导途径异常活化所导致的疾病选自：肿瘤、一些家族性遗传病如Alzheimer’s疾病、或多囊肾病。

在本发明的第二方面，提供一种筛选抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1(LEF1)相互作用的抑制剂的方法，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的相互作用情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的反应体系中，检测胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的相互作用情况；

(b)将步骤(a)测试组中胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的相互作用情况与对照组中胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的相互作用情况进行比较，

如果测试组中胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的抑制剂。

在本发明的一个优选例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的反应体系选自：含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的溶液；或含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的细胞。

在本发明的另一优选例中，所述的含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1的细胞为酵母细胞。

在本发明的第三方面，提供一种用前面所述的方法所获得的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的抑制剂。

在本发明的第四方面，提供一种前面所述的抑制剂的用途，用于制备药物，所述药物用于抑制经典Wnt信号转导途径异常活化，或者治疗经典Wnt信号转导途径异常活化所导致的疾病。

在本发明的一个优选例中，所述的经典Wnt信号转导途径异常活化所导致的疾病选自：肿瘤、一些家族性遗传病如Alzheimer’s疾病、或多囊肾病。

在本发明的第五方面，提供一种胸腺嘧啶DNA糖苷酶的用途，用于筛选抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1(LEF1)相互作用的抑制剂。

在本发明的第六方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物中含有有效量(所述的有效量为0.001-99.9wt％；更优选的为0.01-90wt％；最优选的，为0.1-50wt％)的所述的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与LEF1相互作用的抑制剂，以及余量的药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了在免疫共沉淀实验中胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和淋巴细胞增强因子1(LEF1)发生相互作用。

图1B显示了体外pull-down实验说明TDG可以直接结合LEF1。

图1C显示了荧光共聚焦中TDG和LEF1共定位结果。

图2A显示了表达TDG可以明显增加LEF1报告基因活性。

图2B显示了RNA干扰技术降低内源TDG水平，对LEF1报告基因活性有抑制作用。

图3显示了TDG在LEF1报告基因上表现出的活性与其DNA修复酶活性无关。

图4显示了TDG和CBP在LEF1报告基因活性上有协同激活作用。

图5A显示了CBP在LEF1报告基因上的活性依赖TDG。

图5B显示了TDG在LEF1报告基因上的活性依赖CBP，而CBP同源物p300没有效应。

图6显示了TDG下调可以抑制肿瘤发生。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)参与经典Wnt信号途径的分子机制，并且TDG还与肿瘤发生相关。依据TDG参与Wnt下游转录复合物活性调节的分子机制，可为抑制肿瘤的发生发展提供新的药物靶点。基于此完成了本发明。

更具体地，本发明人发现TDG能够与Wnt信号转导途径中的淋巴细胞增强因子(LEF1)发生相互作用。并且TDG在经典Wnt信号转导途径中起到正向调节作用。进一步的研究还发现，TDG能够促进肿瘤的发生。因此，开发抑制TDG的物质，能够抑制肿瘤的发生。

淋巴细胞增强因子1(LEF1)和胸腺嘧啶DNA糖苷酶基因(TDG)相互作用的研究有着多方面的用途，这些用途包括(但不限于)：筛选调节(促进或抑制)LEF1和TDG相互作用的调节剂(促进剂或抑制剂)、从而达到调节经典Wnt信号途径的目的。

这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节经典Wnt信号途径有用的药物。

所述的TDG与LEF1相互作用的促进剂或抑制剂，可以施用于个体，调节Wnt信号转导途径。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-50wt％)的(a)TDG与LEF1相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以用于调节经典Wnt信号途径。

通常，这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。

目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术，一般人员只要根据本发明的提示，都可以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用Mg Cl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来筛选与LEF1相互作用的蛋白。更具体的，在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用，所述猎物蛋白可以是已知的，也可以是从cDNA文库中选出来的。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报告基因的转录。

在本发明的一个优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。

在本发明的另外一个优选方式中，采用酵母双杂交的技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。酵母双杂交技术是一种检测两个蛋白(X和Y)是否相互作用的常用方法。其原理为：在酵母细胞中表达两种融合蛋白DB-X和AD-Y，DB为转录因子的DNA结合区，AD为转录因子的转录激活区，只有同时具有DNA结合和激活活性，才能形成有活性的转录复合物。当X与Y相互作用时，DB与AD可以在空间上靠近，形成活性转录复合物，使报告基因表达。

此外，在本发明的另外一个优选方式中，也可用酵母双杂交的技术来检测或筛选调节胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的物质。将候选物质加入到上述构建的蛋白与蛋白相互作用的系统中，观察所述候选物质对蛋白之间相互作用的影响关系；当两种蛋白的相互作用发生减弱时，说明所述候选物质是一种抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的拮抗剂或抑制剂；防止，则说明所述候选物质是一种促进胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的激动剂或促进剂。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提出并证明TDG参与经典Wnt信号转导途径，通过调节TDG和LEF1的相互作用，可调节经典Wnt信号转导途径。

(2)本发明提供了很好的药物筛选方案，可用于筛选抑制TDG和LEF1的相互作用的药物，进而抑制经典Wnt信号转导途径异常活化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1 TDG的克隆

TDG是以LEF1(GenBank登录号：NM_010703)作为“诱饵”，通过酵母双杂交筛选小鼠10.5天胚胎库(购自GIBCO)得到的含完整读码框的克隆(GenBank登录号：NM_011561.1)，具体序列如下(SEQ ID NO：1)：

ATGATGGCAG AAGTTCCTAA CATGGCAGTC ACGACTGGAC AGCAGGTGCC AGCAGTAGCT    60

CCTAACATGG CAACCGTGAC AGAACAGCAG GTGCCCGCAG ACGCTCCTGT CCAGGAACCT     120

GCACCAGAAG CTCCAAAGAG AAGGAAAAGG AAACCCAGAG CAGCAGAGCC CCAGGAACCA     180

GTGGAGCCCA AAAAACCTGC TACGTCGAAG AAATCCGGCA AGTCTACAAA ATCAAAGGAA     240

AAGCAGGAGA AAATCACAGA CGCGTTTAAA GTGAAAAGGA AAGTGGACCG CTTCAACGGC     300

GTCTCTGAAG CTGAGCTTCT GACCAAGACT CTTCCTGACA TTTTGACCTT CAATCTGGAT     360

ATTGTGATCA TTGGCATTAA CCCGGGATTA ATGGCTGCTT ACAAAGGACA TCACTACCCT     420

GGGCCTGGAA ATCACTTCTG GAAGTGTCTG TTCATGTCGG GGCTGAGTGA GGTGCAGCTG     480

AATCACATGG ATGACCACAC CTTACCCGGC AAGTACGGCA TCGGATTCAC CAACATGGTG     540

GAACGGACGA CGCCGGGCAG CAAGGATCTG TCTAGTAAAG AGTTCCGGGA AGGAGGGCGC     600

ATCCTGGTGC AGAAACTGCA GAAATATCAG CCACGAATAG CGGTGTTTAA TGGAAAATGT     660

ATTTATGAAA TTTTCAGTAA AGAAGTTTTT GGAGTAAAGG TTAAGAACTT GGAATTTGGG     720

CTTCAACCCC ACAAGATCCC AGACACAGAA ACTCTGTGCT ACGTCATGCC GTCGTCCAGC     780

GCCAGATGTG CTCAGTTTCC CCGGGCCCAG GACAAAGTTC ATTACTACAT TAAGCTGAAG     840

GACTTGAGAG ACCAGCTGAA AGGCATTGAA CGCAACACCG ACGTTCAGGA AGTGCAGTAT     900

ACATTTGACC TGCAGCTTGC GCAAGAGGAC GCAAAGAAGA TGGCTGTTAA GGAAGAAAAG     960

TATGATCCAG GCTATGAGGC AGCTTACGGC GGCGCCTATG GGGAAAACCC ATGTAATGGG    1020

GAACCTTGTG GCATTGCTTC AAATGGGCTA ACAGCCCACA GTGCGGAGCC GAGAGGAGAA    1080

GCGACCCCCG GCGATGTTCC AAATGGGCAG TGGATGGCAC AGTCGTTTGC AGAGCAGATC    1140

CCTTCTTTTA ATAATTGTGG GACCCGAGAG CAGGAAGAAG AGAGCCACGC TTAG          1194

然后通过SalI/NotI双酶切得到TDG插入物(insert)。

将上述插入物分别和pCMV(XhoI/NotI)及pET28c(SalI/NotI)载体(Novagen)连接(其中XhoI和SalI是同尾酶)，构建出在真核细胞和原核细胞的表达质粒，分别通过转染常规的人的胚胎肾细胞HEK293T细胞，子宫颈癌HeLa细胞(各细胞株购自中科院上海生化细胞所、或可购自ATCC)和转化常规的大肠杆菌DH5α细胞和BL21细胞，导入细胞，用于后续进行功能分析。

实施例2.TDG和LEF1蛋白质相互作用

1.TDG和LEF1之间的相互作用

TDG是以LEF1为“诱饵”通过酵母双杂交筛选得到，提示TDG和LEF1之间可能存在蛋白质相互作用。

为了证实TDG和LEF1之间这一相互作用，首先本发明人在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞中瞬时转染外源的带有GG小肽标记的TDG(带有GG的载体(pGG)改造自STRATAGENE的pCMV质粒：合成两端带有XbaI/XhoI酶切位点的GG小肽序列(atgtctctagaagaagaagaatacatgccgatggaagcc(SEQ ID NO：2))，连接入XbaI/XhoI酶切好的购自STRATAGENE的pCMV载体；然后将前述重组载体用SalI/NotI酶切，将用相同酶切的TDG插入物克隆入所述载体，获得带有GG小肽标记和TDG的重组载体)和HA标记的LEF1(带有HA的载体(pHA)改造自STRATAGENE的pCMV质粒：合成两端带有XbaI/XhoI酶切位点的GG小肽序列(atgtctctagaatacccttatgatgtcccagactatgcc(SEQID NO：3)，连接入XbaI/XhoI酶切好的购自STRATAGENE的pCMV载体；然后将前述重组载体用XhoI/NotI酶切，将用相同酶切的LEF1克隆入所述载体，获得带有HA小肽标记和TDG的重组载体)。转染24小时后，收细胞，用1×裂解缓冲液(lysis Buf)(NP401％，甘油10％，NaCl 0.135M，Tis-Cl PH8.0，PMSF0.5M，PPi 1mM，NaF 10mM，Na3VO4 2mM)裂解细胞，离心(14,000rpm/10min)后取上清，加入GG抗体(购自Babco)和蛋白A/G Plus琼脂糖珠子(购自Santa CruzBiotechnology)，低温旋转3小时，TDG被GG抗体吸附到珠子上。离心(5000rpm/1min)收集珠子，通过western检测珠子上所带的蛋白。

由图1A所示，用GG免疫沉淀的样品，只有共转染TDG和LEF1时LEF1可以被检测到，说明LEF1通过和TDG相互作用，一起被GG抗体吸附到珠子上而得以免疫沉淀。单独转染LEF1无法在免疫沉淀样品中检测到LEF1。这提示了TDG和LEF1在细胞内可以发生蛋白质相互作用。

2.TDG和LEF1之间为直接作用的相互作用

进一步的，为了确定TDG和LEF1之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人分别从大肠杆菌中纯化了重组表达质粒GST-LEF1和TDG-His，具体方法如下：

重组表达质粒GST-LEF：pGEX4T2(带有GST标记的pGEX4T2，购自Stratagen)用SalI/NotI酶切，克隆入用XhoI/NotI酶切好的LEF插入物。转化大肠杆菌DH5α，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养过夜；取上述过夜菌1∶100接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养1小时，22℃培养至A₆₀₀为0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)达终浓度10μM，37℃培养4h。离心收集菌体，将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的GST破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO₄至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物。取破菌抽提液上GSH-Sepharose 4B柱，用GST纯化缓冲液(20hM Tris-Cl PH 8.0，50mM NaCl，2mM EDTA，5％甘油，0.01％Triton)洗涤至本底，待用。

重组表达质粒TDG-His：pET28c(带有6His标记的pET28c，购自Novagen)用SalI/NotI酶切，克隆入用SalI/NotI酶切好的TDG插入物。转化大肠杆菌BL21，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养过夜；取上述过夜菌1∶100接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养1小时，22℃培养至A600为0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)达终浓度10μM，37℃培养4h。离心收集菌体，将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的NTA缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNaseI至终浓度为25mg/ml以及MgSO4至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物。取破菌抽提液上NTA-Ni柱，用含有5mM、20mM咪唑的NTA缓冲液洗涤至本底，用含有100mM、250mM咪唑的NTA缓冲液洗脱，用GST纯化缓冲液透析去除咪唑，待用。

pull down实验方法：取一定量透析后TDG-His蛋白与结合了GST-LEF的GSH树脂在4C混合3hr，用GST纯化缓冲液洗三次，树脂加SDS样品缓冲液100℃煮沸5min。样品进行SDS-PAGE电泳后进行Western检测。

由图1B所示，在体外pull down实验中用GST-LEF1可以沉淀到His-TDG，而GST不能。这说明TDG和LEF1之间的蛋白质相互作用是直接的。

3.TDG和LEF1的细胞定位

此外，本发明人还通过荧光共聚焦的方法，观察TDG和LEF1在子宫颈癌HeLa细胞中的细胞定位。在子宫颈癌细胞中瞬时转染外源的HA标记的LEF1和绿色荧光蛋白GFP融合表达的TDG(GFP载体质粒购自BD.Inc，同样用XhoI/NotI酶切好的载体连接入前述SalI/NotI的插入物)。转染24小时后，收带有细胞的国产玻璃片，用冷PBS清洗后加入4％PFA固定15分钟，冷PBS清洗后再加70％乙醇，冰上放置15分钟。GFP融合TDG的蛋白质可以通过荧光共聚焦显微镜(LEICA)直接观察绿色荧光蛋白的位置确定目标蛋白的细胞定位，而带有HA标记的LEF1的定位则通过免疫染色的方法检测，即用加HA抗体(1∶300，购自Babco)反应1小时，然后加入带有红色荧光集团的二抗(Jackson Immuno Research)反应1小时。用DAPI(Sigma)染细胞核，反应1分钟。用封片剂(polysciences，Inc.)封闭后，即可进行观察。

由图1C所示，TDG和LEF1单独表达时，在细胞核中呈现弥散分布，当两者共表达时，有明显的共定位，特别是以一种点状分布方式。这些实验一致证明了TDG和LEF1之间的确存在蛋白质相互作用。

实施例3.TDG在经典Wnt信号转导途径的功能

1.TDG在经典Wnt信号转导途径中起到正向调节作用

在本实施例中，TDG在经典Wnt信号转导途径的功能主要利用LEF1报告基因活性系统来检测。

在常规的人的胚胎肾细胞293细胞和子宫颈癌HeLa细胞中转染荧光素酶启动子区带有LEF1结合位点的报告基因如TOPflash/FOPflash(购自upstate公司)和LEF-luc(购自Panomics公司)，绿色荧光蛋白GFP(购自BD公司)，TDG及ΔN-β-catenin(缺失N端45个氨基酸，不受Wnt信号调节，具有组成性活性的β-catenin)。转染约18小时，换液为带有Wnt3a糖蛋白(常见Willert K，Nature，2003，423：448-452)的培养基进行刺激约6小时。收细胞，24孔盘中每孔加200ul1×lysis buf(Roche)裂解细胞5分钟，在测活的96孔板中每点加40ul细胞裂解液，在加入20ul荧光酶底物(Roche)，在酶标仪中计荧光量。以荧光值反映转录复合物的转录活性。

结果如图2A所示，在报告基因系统中，外源转染的TDG可以明显上调报告基因活性，也就是对Wnt信号效应起到正向调节。

2.Wnt信号转导途径受到TDG表达降低的影响

RNA干扰技术沉默TDG的基因表达，将pAPT载体(pAPT载体改造自STRATAGENE的pCMV：合成两端带有ClaI/XhoI酶切位点的AP序列(GenBank登录号：BC068501)，连接入ClaI/XhoI酶切好的购自STRATAGENE的pCMV载体)用XhoI/NotI酶切好，连接入SalI/NotI的插入物。质粒转染细胞表达设计好的21bp长度的DNA双链片断，可以和内源的TDG基因互补结合，抑制内源TDG的基因转录。当细胞中内源的TDG蛋白质水平下降后，图2B所示，报告基因反映出的Wnt活性也在一定程度上受到抑制，这些数据一致表明了TDG在Wnt信号转导途径对下游的β-连环蛋白-LEF-1转录复合物的转录激活具有正向调节功能。

3.TDG在LEF1报告基因上的转录激活能力不依赖于其DNA修复酶活性

因为TDG是一个DNA修复酶，本发明人欲进一步证实TDG的DNA修复酶活力对于它在LEF1报告基因上表现出的转录激活能力的影响。采用人TDG的一个突变体N140A(GenBank登录号：NM 003211.3)，这是位于TDG修复酶活中心的一个天冬酰胺突变成丙氨酸，从而使TDG丧失了DNA修复酶活力。如图3所示，N140A突变和野生型TDG(TDG-wt)对LEF1报告基因的激活能力没什么差别，说明TDG在LEF1报告基因上的转录激活能力不依赖于它的DNA修复酶活力。

4.TDG和CBP/p300的协同效应

已有报导，TDG和CBP/p300有相互作用，而CBP/p300则是已知的β-连环蛋白的转录共激活子。在本发明人的实验系统中，转染人的胚胎肾细胞293细胞，导入荧光素酶启动子区带有LEF1结合位点的报告基因TOPflash(购自upstate)，绿色荧光蛋白GFP，TDG和CBP(购自Tokyo MetropoLItan Instituteof Medical Science，Japan)。转染约18小时，换液为含有Wnt3a糖蛋白的培养基进行刺激约6小时。收细胞，24孔盘中每孔加200ul 1×lysis buf(购自Roche)裂解细胞5分钟，在测活的96孔板中每点加40ul细胞裂解液，在加入20ul荧光酶底物(购自Roche)，在酶标仪中计荧光量。以荧光值反映转录复合物的转录活性。

实验结果发现TDG和CBP对Wnt调控的报告基因活性具有明显的协同激活效应，如图4所示。

用构建好的pAPT-TDG质粒和化学合成的CBP的21bp的RNA片断(Emami，K.H.，PNAS，2004，101：12682-12687)，转染细胞后，利用RNA干扰的原理，降低细胞内的TDG或者CBP的蛋白水平。

同样用报告基因的荧光值换算转录复合物的转录活性的方法，发现TDG和CBP的转录激活能力是互相依赖的，即TDG或CBP要发挥β-连环蛋白-LEF-1转录复合物的激活子作用，需要彼此的存在。当缺失其中一个时，另一个分子的转录激活子活性也受到抑制，如图5A和5B所示。

实施例4.TDG促进肿瘤发生

为了研究TDG是否和肿瘤发生相关，本发明人构建了HeLa中TDG的RNAi稳定细胞株，建立了内源TDG蛋白水平被降低的细胞系统。

方法：带有Neomycin抗性的载体pPERL(购自美国康州大学健康中心，或可用常规的方法改造自Oligoengine的pSUPER载体)，用XhoI/NotI酶切好，连接入SalI/NotI的TDG插入物。转染HeLa细胞后，用含G418的培液培养细胞，此过程中可以观察到细胞的大量死亡，而存活下来的细胞很有可能在染色体组中整合了外源质粒而带有Neo抗性，可以在G418培养中生长。两周左右后，可以观察到细胞单克隆的形成。吸除培养液，在单克隆细胞团位置放入接种环，加入20ul胰酶，消化约4分钟，镜下观察到细胞变圆，加入100ul培养液，用去尖枪头吹打3-4次，转移至24孔盘。细胞长满后扩盘，用于检测和保存。检测后，取Hela细胞中TDG被无效降低和有效降低的两组稳定细胞株，扩增培养，收集量约6×10⁶细胞，注射到3～4周的裸鼠背部两侧，每两天观察一次。

结果如下：无效降低TDG的HeLa细胞株注射后10天后可观察到有肿瘤块生成，10个注射部位长出6个肿瘤块，相比而言，有效降低TDG的HeLa细胞株注射后12天才观察到肿瘤块，而且10个注射部位仅长出1个肿瘤块。如图6所示。

实施例5.

筛选抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的物质

为了筛选抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶与淋巴细胞增强因子1相互作用的物质，本发明人主要使用了酵母双杂交的技术，它是一种检测两个蛋白(X和Y)是否相互作用的常用方法。

酵母双杂交技术的原理为：在酵母细胞中表达两种融合蛋白DB-X和AD-Y，DB为转录因子的DNA结合区，AD为转录因子的转录激活区，只有同时具有DNA结合和激活活性，才能形成有活性的转录复合物。当X与Y相互作用时，DB与AD可以在空间上靠近，形成活性转录复合物，从而使报告基因发生表达。

在本实施例中，将pDB-LEF和pPC86-TDG两种质粒(pDB和pPC86购自GIBCO，都是用SalI/NotI酶切构建载体)，共转化酵母MAV203a细胞(GIBCO)，涂于营养缺陷型培养基(缺失亮氨酸和色氨酸)的平板，30度培养48小时。因为以上两种质粒分别编码亮氨酸和色氨酸，只有同时转入两种质粒的细胞才可能在营养缺失的培养基上存活。挑选长出的酵母单克隆，进行X-gal测活。因为有相互作用时，开放酵母菌中带有的报告基因，表达LacZ(半乳糖苷酶)，和X-gal反应，使菌斑变蓝。

本发明人在此过程中，将备选的药物库和酵母混和培养，如果有药物可以打断LEF1和TDG的相互作用，则本来在对照组中X-gal测活中显蓝的菌斑在加药组无法再变蓝。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                  序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>胸腺嘧啶DNA糖基化酶对信号转导途径的调控作用

<130>060604

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1194

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>1

atgatggcag aagttcctaa catggcagtc acgactggac agcaggtgcc agcagtagct      60

cctaacatgg caaccgtgac agaacagcag gtgcccgcag acgctcctgt ccaggaacct     120

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<210>2

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>2

atgtctctag aagaagaaga atacatgccg atggaagcc                         39

<210>3

<211>39

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<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>3

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