用于快速筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的细胞模型

摘要

本发明公开了属于新药研发中从组合化合物库中快速筛选抗肿瘤药物－组蛋白去乙酰化酶抑制剂类先导化合物时使用的一种细胞筛选模型。该模型利用组蛋白去乙酰化抑制剂可以特异性活化某些启动子序列的特点，构建了含有特定启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的2种表达载体，并建立了稳定表达上述载体的cos－7细胞系。由于细胞中分别含有对荧光素酶活化强度不等的启动子序列，这些启动子可以被组蛋白去乙酰化酶抑制剂特异性活化，从而增强荧光素酶报告基因的表达，因而可以通过检测荧光素酶活性变化而快速完成待检样品是否具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂活性的测定。这种细胞筛选模型可用于快速、高通量地筛选组合化合物库中新型抗肿瘤药物－组蛋白去乙酰化酶抑制剂的先导化合物，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于新型化合药物研发中所使用的一种可以对化合物库进行快速、高通量筛选，以获得组蛋白去乙酰化酶抑制剂先导化合物的细胞模型。

背景技术

组蛋白是构成人体染色质基本成分组小体的重要组成部分，由DNA双链缠绕组蛋白异八聚体构成组小体。研究表明在组蛋白的赖氨酸尾部存在着多种修饰，包括磷酸化、甲基化、乙酰化及泛素化等，这些修饰对于基因的转录和表达具有重要的调控作用。已知细胞内存在两种酶类参与了组蛋白乙酰化的调节，即可以增强乙酰化的组蛋白乙酰转移酶，及可以抑制乙酰化的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)。在正常情况下，这两种酶活性之间的动态平衡维持了组蛋白的乙酰化和去乙酰化状态的调节。当组蛋白呈高乙酰化状态时，组小体的空间构象较为开放，利于各种转录因子接近DNA，促进基因转录。而组蛋白的去乙酰化则使DNA与组蛋白之间呈紧密结合状态，不利于基因转录，导致一些基因的表达关闭。目前的研究表明在肿瘤组织中组蛋白呈去乙酰化状态，这种状态介导基因转录抑制，促进肿瘤的发生。而采用HDAC抑制剂增强组蛋白的乙酰化，则可以活化相应基因的表达，抑制肿瘤增殖，阻断细胞周期，促进细胞分化或凋亡。已经证实HDAC抑制剂在多种肿瘤细胞系及动物移植瘤模型中均具有良好的肿瘤杀伤和抑制肿瘤转移的活性，且对正常细胞毒性较低，这种高效低毒的作用特点使其成为颇为理想的抗肿瘤新药，目前数种HDAC抑制剂，如FK228、SAHA、MS275等已经在美国进入II期临床。鉴于该类化合物种类较多，且大多由植物及微生物代谢物中提取，而我们国家拥有丰富的中草药资源，通过建立稳定可靠快速的筛选体系，可以有望从已有的单体化合物库或已知中草药有效成分中寻找新型HDAC抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供2种可以用于抗肿瘤新药组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂快速筛选的细胞模型。其特征在于：细胞中含有可以特异性被HDAC抑制剂活化的外源启动子序列：

模型1含有的序列是：GCCGCCCCG ACTGCATCTG CGTGTTCGAA

TTCGCCAATG  ACAAGACGCT  GGGCGGGGTT  TGTGTCATCA

TAGAACTAAA  GACATGCAAA  TATATTTCTT  CCGGGGACAC

CGCCAGCAAA  CGCGAGCAAC  GGGCCACGGG  GATGAAGCAG；

模型2含有的序列是：TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT

AGCCCATATA   TGGAGTTCCG   CGTTACATAA   CTTACGGTAA   ATGGCCCGCC

TGGCTGACCG   CCCAACGACC   CCCGCCCATT   GACGTCAATA   ATGACGTATG

TTCCCATAGT   AACGCCAATA   GGGACTTTCC   ATTGACGTCA   ATGGGTGGAG

TATTTACGGT   AAACTGCCCA   CTTGGCAGTA   CATCAAGTGT   ATCATATGCC

AAGTACGCCC   CCTATTGACG   TCAATGACGG   TAAATGGCCC   GCCTGGCATT

ATGCCCAGTA   CATGACCTTA   TGGGACTTTC   CTACTTGGCA   GTACATCTAC

GTATTAGTCA   TCGCTATTAC   CATGGTGATG   CGGTTTTGGC   AGTACATCAA

TGGGCGTGGA   TAGCGGTTTG   ACTCACGGGG   ATTTCCAAGT   CTCCACCCCA

TTGACGTCAA   TGGGAGTTTG   TTTTGGCACC   AAAATCAACG   GGACTTTCCA

AAATGTCGTA   ACAACTCCG；

上述细胞模型的建立方法是将上述启动子序列插入萤火虫荧光素酶报告基因的上游构建真核表达载体，经质脂体介导的方法将上述载体分别导入COS7细胞，经G418药物筛选后获得稳定表达外源基因的模型细胞。当采用HDAC抑制剂处理模型细胞时，细胞模型中的外源启动子会得到活化而增强荧光素酶的表达，通过荧光素和荧光素酶生物发光体系测定，可以极其灵敏、高效地检测出细胞在药物处理前后荧光素酶活性的变化，借此判断启动子的活化状态。其中模型1的特点是检测背景低、特异性强，可以有效排除假阳性的筛选标本。模型2的作用特点是灵敏度高，可以有效避免因样品活性低而出现漏检。通过上述2种细胞模型的联合筛选，可以识别具有HDAC抑制剂活性的化合物。该细胞模型为发现新型HDAC抑制剂的先导化合物及后续药物研发提供了重要的技术平台，具有一定的应用价值。

具体实施方式

下面结合采用不同种类的HDAC抑制剂Depsipeptide(FK228)、suberoylanilidehydroxamic acid(SAHA)、Trichostatin A(TSA)及其他具有抗肿瘤活性的不同种属的4种药物5-aza-2’-deoxycytidine(DAC)、维甲酸、紫杉醇及17-AAG分别处理细胞模型的实验对本发明做进一步的说明。

1.实验方法

1.1采用分子克隆的方法在含有荧光素酶报告基因的商用载体中分别插入上述启动子序列片段，经质粒扩增纯化后，采用质脂体介导的方法转染COS7细胞，G418(1mg/ml)加压筛选21天后，获得稳定表达外源基因的细胞抗性克隆，该抗性细胞作为模型可以用于后续药物筛选。

1.2HDAC抑制剂FK228及TSA由美国国立卫生研究院肿瘤研究所David Schrump博士提供，HDAC抑制剂SAHA由英国阿斯利康(AstrZeneca)公司提供。其他抗肿瘤制剂分别购自Sigma公司。FK228的使用浓度分别是12.5、25及50ng/ml，SAHA的使用浓度分别是2.5、5及10μM，TSA的使用浓度分别是300、600及900nM。

1.3模型细胞以时宜的比例接种24孔板，次日采用不同浓度的药物处理，药物处理后24小时，采用Promaga公司提供的荧光素检测试剂盒，按试剂盒说明书进行细胞裂解，并在美国Turner Designs公司生产的TD20/20光度计上采用单管法进行酶活性测定。也可以接种96孔板采用读板光度仪进行酶活性测定。

2.实验结果

2.1三种HDAC抑制剂和4种其他抗肿瘤药物对模型1细胞荧光素酶活性的影响由图1所示，3种HDAC抑制剂均可以呈剂量依赖性增强细胞荧光素酶的活性，用药后活性增强2.3-5.8倍，其最低有效浓度分别是FK22812.5ng/ml，SAHA2.5μM及TSA300nM，低于药物对细胞进行杀伤的有效浓度，显示系统对药物的反应具有高敏感性，而其他抗肿瘤药物在有效细胞杀伤浓度范围内均未显示有荧光素酶活性的增加。

2.2三种HDAC抑制剂和4种其他抗肿瘤药物对模型2细胞荧光素酶活性的影响如图2所示，3种HDAC抑制剂均可以呈剂量依赖性增强细胞荧光素酶的活性，用药后活性增强2.1-8.5倍，其他抗肿瘤药物处理后荧光素酶活性也略有增强，但增强幅度不超过2倍，且不呈剂量依赖性增加。

附图说明：

图1是3种HDAC抑制剂及4种抗肿瘤药物在模型1细胞的活性检测结果；图中显示3种HDAC抑制剂呈剂量依赖性增强细胞荧光素酶活性，而其他抗肿瘤药物未显示有荧光素酶活性增加。

图2是3种HDAC抑制剂及4种抗肿瘤药物在模型2细胞的活性检测结果；图中显示3种HDAC抑制剂均可以呈剂量依赖性增强细胞荧光素酶的活性，最大值可增强8.5倍。其他抗肿瘤药物处理后细胞内荧光素酶活性也略有增加，但增强幅度不超过2倍，且不呈剂量依赖性增加。