支链PEG－GCSF和PEG－GMCSF结合物及其制备方法

摘要

新型支链PEG－GCSF和PEG－GMCSF结合物，其特征是：它们分别是分子量为10000－60000道尔顿的聚乙二醇(PEG)修饰的GCSF和GMCSF，具有如下结构式，式中，mPEG是聚乙二醇链，W是一种粒细胞集落刺激因子(GCSF)或粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。本发明的PEG－GCSF和PEG－GMCSF结合物的抗病毒活性高，在体内保留时间长，血浆半衰期达到40～100小时。

说明书

发明领域

本发明涉及用支链聚乙二醇(简称支链PEG)对W(GCSF和GMCSF)进行化学修饰得到的PEG-W(即PEG-GCSF和PEG-GMCSF)结合物及其制备方法。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(GCSF)和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)是一种药学上的活性蛋白，所述蛋白能调节嗜中性粒细胞的增殖、分化和机能的激活(Metcalf，Blood 67：257(1986)；Yan等，Blood84(3)：795-799(1994))。GCSF可用于各种白细胞减少症，它可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移(mobilization)，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少患者，或用作骨髓移植的前序。

蛋白治疗药物(如GCSF)的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。市售GCSF和GMCSF有短期的药理学作用，且在白细胞减少状态的持续期间通常必须一天给药一次以上，这给病人带来很大痛苦。

对于增加蛋白循环半衰期的一个途径就是降低蛋白的清除率，尤其是降低肾脏的清除率和受体介导的清除率。这可以通过将蛋白与能增加表观分子量的化学组分结合，从而降低肾脏的清除作用，增加蛋白药物分子在体内半衰期来实现。此外，蛋白药物结合一个化学组分可以有效地阻断蛋白裂解性酶与蛋白的物理接触，由此可以使蛋白免遭非特异性蛋白水解作用的降解。临床研究表明，聚乙二醇是对人体安全的高分子聚合物，通过将PEG与蛋白药物结合可以降低免疫原性并延长半衰期(参见：Enzon，国际专利申请PCT/US990/02133)；Nitecki等，美国专利4,902,502；国际专利申请PCT/US85/02572)。

具有与本发明结合物结构不同的PEG-GCSF结合物有国际申请专利PCT/US00/01264。

本发明的支链PEG-GCSF和PEG-GMCSF活性高，在体内保留时间长，延长了血浆半衰期。

发明内容

本发明的支链PEG-W是与支链PEG分子连接的W。本发明中的支链聚乙二醇是两条mPEG链与一分子赖氨酸以酰胺键连接，体内不易水解。由于支链PEG是以带有链长分布的混合物的形式制备的，因此，PEG的分子量一般是指其平均分子量。

本发明技术方案如下：

支链PEG-W结合物，其特征是：它是分子量为10000-60000道尔顿的支链聚乙二醇修饰的W，具有如下结构式：

式中，mPEG是单甲氧基聚乙二醇链，W是一种粒细胞集落刺激因子(GCSF)或一种粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，  R₀是R是或(其中R₁是氢原子，或者是一种烷烃，其碳原子数为1～16的整数)。

上述的支链PEG-W结合物的制备方法由下列步骤组成：

步骤1，配制W溶液。将W以50mM，pH4.0～6.0的缓冲溶液溶解，配制成浓度为0.2～10mg/ml的溶液；

步骤2，修饰反应。按W∶PEG为1∶0.5～40物质的量之比加入mPEG2-NHS，以氢氧化钠调节pH到7.0～10.0之间，在0～37℃条件下反应0.5～24小时，mPEG2-NHS有如下结构：

步骤3，终止反应。加入甘氨酸终止反应；

步骤4，利用离子交换色谱分离产物。将步骤3所得反应液以5倍体积的50mM pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液稀释，然后将反应混合物上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)柱；然后用0.2～0.8M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，用波长280nm和214nm同时检测，收集PEG-W的洗脱液。

步骤5，利用凝胶色谱进一步纯化PEG-W。以Sephacryl S-200凝胶色谱对步骤4所得PEG-W进一步纯化，洗脱液为pH＝7.0的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，用波长280nm和214nm同时检测，收集含PEG-W的洗脱液。

本发明的支链PEG-W结合物活性高，在体内保留时间长，血浆半衰期达到40～100小时，可以用于制备治疗白细胞减少症的药物中。

从反应混合物中分离PEG-W结合物是本发明的重要内容之一。由于反应混合物中不同的产物具有不同的等电点及分子量，这些产物可用传统的色谱方法进行分离。在W上同一个自由氨基上连接单个PEG分子是本发明优选方案。W有几个自由氨基可以与PEG反应，但由于支链PEG空间位阻大，比较容易通过控制PEG与W的配比、反应温度、反应时间、反应液pH及其离子强度等反应条件来主要获得单修饰支链PEG-W结合物(即一个W分子与单个分子支链PEG连接的产物)。然后通过分离制备高纯度单修饰支链PEG-W结合物。

附图说明

图1为实施例5的SDS-PAGE电泳检测谱图，其中第1条带：未修饰GCSF；第2条带：反应混合物；第3条带：单修饰支链PEG-GCSF结合物(支链聚乙二醇Mw＝20000)第4条带：标准分子量蛋白。

具体实施方式

实施例1.单修饰支链PEG-GCSF结合物的制备

将GCSF以5mM pH4.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为8mg/ml的溶液；按GCSF∶PEG为1∶5的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝20000)，以氢氧化钠调节pH到9.0，在25℃下反应3小时，加入0.5M甘氨酸1.0ml终止反应；4分钟后，用5倍体积的20mM pH4.5的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)柱，以6倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.3M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含单修饰支链PEG-GCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Sephacryl S-200对PEG-GCSF结合物进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15MNaCl)，收集含单修饰支链PEG-GCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。结果见图1。

实施例2.单修饰PEG-GMCSF结合物的制备

将GMCSF以5mM pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为1mg/ml的溶液；按GMCSF∶PEG为1∶10的物质的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝40000)，以氢氧化钠调节pH到8.5，在25℃下反应0.5小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用10倍体积的20mM pH5.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waters CM-52)，以5倍体积pH5.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.35M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含单修饰支链PEG-GMCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Sephacryl S-200对PEG-GMCSF结合物进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15MNaCl)，收集含单修饰支链PEG-GMCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。

实施例3.单修饰支链PEG-GCSF结合物的制备

将GCSF以5mM pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为1mg/ml的溶液；按GCSF∶PEG为1∶30的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝10000)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在25℃下反应2小时，加入0.5M甘氨酸0.8ml终止反应；5分钟后，用5倍体积的20mM pH5.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waters CM-52)，以5倍体积pH5.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.45M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含单修饰支链PEG-GCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Sephacryl S-200对PEG-GCSF结合物进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15MNaCl)，收集含单修饰支链PEG-GCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。

实施例4.单修饰支链PEG-GMCSF结合物的制备

将GMCSF以5mM pH 4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为4mg/ml的溶液；按GMCSF∶PEG为1∶25的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝20000)，以氢氧化钠调节pH到9.5，在25℃下反应12小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用8倍体积的20mM pH5.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waters CM-52)，以4倍体积pH5.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.3M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含单修饰支链PEG-GMCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Sephacryl S-200对PEG-GMCSF结合物进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含单修饰支链PEG-GMCSF结合物的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。

实施例5 SDS-PAGE电泳法对产物的检测

将收集的各洗脱峰浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶10％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体浸入装有固定液(30％甲醇、5％乙酸)的培养皿中，在摇动下室温浸泡5分钟；取出胶体，浸入染色液中室温摇动浸泡45分钟(染色液是0.05％考马斯亮蓝G-250，30％甲醇，5％乙酸水溶液)；最后，将胶体移入脱色液中室温摇动浸泡直至样品条带清晰为止(结果见图1)。这里脱色液为：1％戊二醛、30％甲醇、5％乙酸。