从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法

摘要

本发明提供了一种从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法。从生物体或病毒中提取的核酸(DNA或RNA)应用酶进行扩增。然后核酸的初始浓度通过计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间，或者扩增效率为最大或最小值时的特征扩增循环数或特征扩增时间，或者扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度的方法获得。因此，核酸的初始浓度可不用微分或积分进行计算。

说明书

本发明申请是基于申请日为2005年9月1日，申请号为200510098030.1，发明名称为：“从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及定量初始核酸浓度的方法，更具体的，涉及从通过聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，链置换扩增(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，转录介导的扩增(TMA)，滚环扩增(RCA)等等得到的实时核酸扩增数据中定量初始核酸浓度的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)在多种用于检测和定量核酸的分析方法中是应用最为广泛的。PCR的原理在美国专利4,683,195和4,683,202中公开。

常规PCR只能给出在端点扩增的DNA通过琼脂糖凝胶的定性结果。然而，这样的常规PCR有一个问题即它不能用于定量分析。为了解决这个问题，开发了实时PCR(real-timePCR)。实时PCR应用光学检测系统实时检测与扩增的DNA的浓度成比例的荧光强度，于是进行DNA的定量分析成为可能。

从核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的常规方法在美国专利6,303,305和6,503,720中公开。在这些常规方法中，扩增了核酸而且得到了在每个扩增循环中表示核酸量的函数。然后，计算函数的第n阶导数(n-th orderderivative of the function)并由结果计算核酸的初始浓度。而且，应用导数的最大值作为阈值循环(threshold cycle)(Ct)的定量分析方法在美国专利6,303,305中公开，而应用导数的最大、最小和零值作为Ct的定量分析方法在美国专利6,503,720中公开。

而且，从核酸扩增数据中定量核酸的初始浓度的另一种方法在出版编号为2002-0031768的美国专利申请中公开。由此，应用导数的特定值定量核酸的浓度。

发明内容

本发明提供了由实时核酸扩增数据不用微分或积分定量核酸初始浓度的方法。

根据本发明的一个方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度和扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为其最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

根据本发明的另一方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示与核酸量成比例的荧光强度和核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度；和由算得的扩增前的荧光强度减去背景荧光强度计算核酸的初始浓度。

根据本发明的又一方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示核酸的扩增效率和核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算扩增效率为最大值或最小值时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

根据本发明，核酸的初始浓度可以不用微分或积分进行定量。

1.定量核酸初始浓度的方法，包含：

扩增核酸；

产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度与核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；

利用所述函数计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为荧光强度最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和

由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

2.1的方法，其中核酸是用酶扩增的。

3.1的方法，其中核酸是利用需要热循环的核酸扩增方法扩增的。

4.1的方法，其中核酸是利用等温的核酸扩增方法扩增的。

5.1的方法，其中表示相关性的函数是利用S型模型产生的。

6.5的方法，其中当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为荧光强度最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间是采用关于利用S型模型的函数的非线性最小二乘拟合法计算的。

7.1的方法，其中核酸的初始浓度是由特征扩增循环数或特征扩增时间通过使用标准校正曲线计算的，该标准校正曲线表示核酸的初始浓度和核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为其最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间之间的关系。

8.定量核酸初始浓度的方法，包含：

扩增核酸；

产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度与核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；

利用所述函数计算扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度；和

由算得的扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度计算核酸的初始浓度。

9.8的方法，其中核酸是用酶扩增的。

10.8的方法，其中核酸是利用需要热循环的核酸扩增方法扩增的。

11.8的方法，其中核酸是利用等温的核酸扩增方法扩增的。

12.8的方法，其中表示相关性的函数是利用S型模型产生的。

13.12的方法，其中扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度采用关于利用S型模型的函数的非线性最小二乘拟合法计算。

14.8的方法，其中核酸的初始浓度是由扩增前核酸样品的荧光强度通过使用标准校正曲线计算的，该标准校正曲线表示核酸的初始浓度与扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度之间的关系。

15.定量核酸初始浓度的方法，包含：

扩增核酸；

产生表示核酸的扩增效率和核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；

利用所述函数计算扩增效率为最大值或最小值时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和

由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

16.15的方法，其中核酸是用酶扩增的。

17.15的方法，其中核酸是利用需要热循环的核酸扩增方法扩增的。

18.15的方法，其中核酸是利用等温的核酸扩增方法扩增的。

19.15的方法，其中表示扩增效率的函数表达为