一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法，包括将用于确定昆虫分类地位的通用探针和特异探针制备成基因芯片，再将昆虫DNA与该基因芯片杂交，根据杂交结果查对预先编制的分子检索表从而确定昆虫的分类地位。本发明的方法能够快速、准确地对昆虫进行分类鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫分类鉴定方法，特别是涉及一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法。

背景技术

昆虫是世界上已知种类最多的生物类群，数量达到100多万种。种类繁多的昆虫与其它人类认识的生物类群一样都是通过生物分类系统来认知的。目前，公认的生物分类系统主要包括7个分类阶元：界Kingdom、门Phylum、纲Class、目Order、科Family、属Genus、种Species。从界到种，分类阶元依次变小，种是分类的基本单元。当然在各个基本分类阶元之间还会细分一些其它分类位如总纲Superclass、总科Superfamily、亚科Subfamily、亚属Subgenus、亚种Subspecies等。如桔小实蝇Bactrocera(Bactrocera)dorslais属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae、寡鬃实蝇亚科Dacinae、寡鬃实蝇族Dacini、果实蝇属Bactrocera、果实蝇亚属Bactrocera。昆虫物种的学名主要由属名和种名两部分组成，如下所示：

昆虫(狭义六足动物)属动物界Animal、节肢动物门Arthropoda、六足总纲Hexapoda、昆虫纲Insecta。昆虫的识别和鉴定通常是通过一种称为检索表Key来实现的，检索表编制原理简单，就是严格的二分法：即A类和非A类。传统的检索表一般利用昆虫形态上的特征来分类，将昆虫分成两类时，所选用的形态特征绝不能存在着“似是而非”和中间状态。编制检索表是反复使用二分法的过程。

根据使用目的的不同，昆虫检索表会分至不同的分类阶元。检索表将某一类群昆虫依照某些稳定且易于观察和鉴别的形态特征进行一系列的二分，最终指向目、科、属、种...，由于检索表以稳定而显著的特征进行分类，因此，使用检索表鉴定生物物种一般能够得到比较准确的结果。

但是，采用这种传统形态学鉴定方法需要扎实的昆虫分类学基础知识和丰富的分类鉴定经验，而且大部分昆虫类群的分类鉴定主要以成虫的形态特征为依据，而对卵、幼虫和蛹通常无法进行种类鉴定，存在很大的局限性。

发明内容

本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种能够从分子水平利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法，所述方法包括将用于确定昆虫分类地位的通用探针和特异探针固定在固相载体上制备成生物芯片，再将昆虫DNA与该生物芯片杂交，根据杂交结果查对预先设定的分子检索表从而确定昆虫的分类地位；

所述通用探针包括科通用探针、属通用探针、亚属通用探针中的至少一种；

所述特异探针包括复合种/近缘种特异探针、种特异探针、亚种特异探针中的至少一种；

所述分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法将杂交结果进行分类，并列出了杂交结果与昆虫种类的对应关系。

由于采用了以上的方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明从分子水平实现了对昆虫的分类鉴定，解决了传统形态学鉴定必须具备扎实的昆虫分类学基础知识和丰富的分类鉴定经验的问题，也结局了传统昆虫种类鉴定必须以成虫形态特征为主要鉴定依据，对卵、幼虫和蛹无法进行种类鉴定的问题；实现了非昆虫分类科技工作者可以准确完成昆虫种类鉴定的突破，同时实现了对卵、幼虫和蛹也可以进行准确种类鉴定。同时，由于采用分子鉴定表，避免了鉴定过程中似是而非的判断，可以实现鉴定结果的计算机自动输出，从而大大降低了人为鉴定的主观性并提高了自动化的程度，为昆虫分类鉴定的标准化奠定了基础，该项技术的推广应用前景将十分广阔。

具体实施方式

近年来，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上公开发表的昆虫基因序列迅猛增长。昆虫分子信息学的兴起，为昆虫分子检索表提供了大量基因信息数据，借助这些公共数据和有关生物技术软件，可将某一类群的昆虫序列全部收集起来，并按基因类别或物种进行比较分析，找出一个或多个合适的昆虫分子标记基因或基因片段，用于设计科、属的通用探针和种(亚种)的特异探针，最终以常规PCR、实时荧光PCR或基因芯片技术来实现昆虫物种的鉴定及近似种类的区分。

基因芯片技术是近10多年来新兴的一门技术，主要应用到生物科学众多的领域之中，包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。基因芯片技术以其可高通量、高灵敏度和高特异性地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。但基因芯片应用于昆虫物种分类，特别是应用于昆虫卵、幼虫、蛹和成虫的快速种类鉴定目前尚未见报道。

本发明提出一种昆虫分子鉴定的方法。通过现代分子生物学技术(如昆虫基因组DNA提取方法、PCR技术、分子杂交、DNA(探针、引物)合成、氨基修饰和荧光标记技术等)为手段，借助芯片点样仪、杂交仪等先进仪器设备，运用基因芯片技术，首先将能区分昆虫某一类群的一组DNA探针以点阵的形式固化在一张固相芯片载体上，再将来自待分类昆虫的带有荧光标记物的PCR目标产物加在芯片上，使PCR产物与芯片上的通用和特异探针杂交，通过检测杂交信号，根据固定在芯片上的各探针，一次性准确地确定昆虫所属的分类地位(科、属、种甚至是亚种)。从而实现昆虫分子快速种类鉴定，其杂交扫描结果可通过人工检查来判定昆虫的分类地位，甚至可以通过电脑程序直接输出鉴定结果，从而实现昆虫种类自动化鉴定。

本发明的方法具体包括：

昆虫基因组DNA提取

昆虫的卵、幼虫(若虫)、蛹和成虫(或部分个体)作为实验材料，采用动物/昆虫基因组DNA提取方法获得昆虫基因组DNA，作为下游实验的模板。

昆虫分子标记基因和目标片段的筛选

收集昆虫某一类群相近种类的基因序列信息，选择合适的分子标记基因和基因片段，设计通用引物，获得芯片杂交所必需的目标片段。

通用探针和特异探针的筛选

借助生物计算机软件，设计和筛选用于确定昆虫分类地位的通用探针(科、属、亚属、复合种/近缘种)和特异探针(种或亚种)。

基因芯片的制备

利用点样仪将各类探针固化在固相的芯片载体表面上(如醛基化玻璃片)，经过水合、固定和洗片，获得带探针矩阵的芯片。探针除通用探针以及特异探针外，通常包括定位探针、阳性对照探针、阴性对照探针及空白对照。除定位探针外，其他各类探针在探针矩阵上通常有3个重复，以确保实验结果的重复性和稳定性。

PCR产物与探针杂交

将通用引物PCR扩增所得到的一种或多种带荧光标记物的PCR产物，加上适量的杂交缓冲液，混合，95℃变性加入有探针的固相芯片载体，在一定的温度下(40℃～60℃)杂交1～3h或以上，洗片洗去多余的杂交液。

杂交信号检测和结果确认

将经过杂交反应的固相芯片载体用芯片扫描仪进行信号检测，通过检测一条或一组通用探针或特异探针的杂交信号或信号强弱来确定昆虫的分类地位及其种类。

所述的通用引物，为一段寡核苷酸序列，引物可以是用Cy3或Cy5荧光标记，也可以是不作任何标记。其作用是在PCR扩增中能扩增昆虫某一类群(如同科和同属)所有种类同一分子标记基因(即通用探针或特异探针所在位置)的全部或部分片段，获得芯片杂交所需的带荧光标记物的目标DNA模板。如通用引物不作荧光标记，则在PCR反应体系中掺入带Cy3或Cy5标记的荧光的dCTP。

所述的通用探针为一段带有基因修饰的探针，其5′端或3′端氨基修饰；其作用是能适用于昆虫某一类群同科、同属和复合种/近缘种的检测。

所述特异探针为一段带有基因修饰的探针，其5′端或3′端氨基修饰；其作用是能特异性鉴定昆虫物种种类或地理种的区分。

所述阳性对照探针是植物核糖体18S rDNA一段核苷酸序列，5′端氨基修饰；阳性对照的作用为监控基因芯片杂交是否成功；

所述阴性对照探针是与所有昆虫序列无同源性的一段核苷酸序列，5′端氨基修饰；阴性对照的作用为监控基因芯片反应系统的污染情况。

所述空白对照，为点样缓冲液，用于监控点样针清洗及探针有无交叉污染。

所述的杂交缓冲液是含有一种或多种盐离子(如SDS、SSPE、SSC等)的溶液，用于与带荧光标记物的DNA溶液杂交。

本发明方法中，根据不同种类昆虫是否能与芯片上的通用探针及特异探针杂交，预先编制分子检索表，该分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法对不同杂交结果进行分类，并列出了不同杂交结果与昆虫种类的对应关系。这样，使用者将待分类昆虫与芯片进行杂交后，可直接将杂交结果与分子检索表进行比对，按照分子检索表的指引判断待分类昆虫的分类地位。

下面通过具体的实施例并对本发明作进一步详细的描述。

实例1 昆虫种类生物芯片分子鉴定

根据昆虫分子鉴定的原理，使用一组不同的探针，可以将一种未知的昆虫分类到较小的分类阶元。表1列出了一种昆虫物种基因芯片分子鉴定探针排布列表，列表上探针包括科通用探针、属通用探针、亚属通用探针、复合种/近缘种特异探针和种/亚种特异探针以及定位点探针、阳性对照探针、阴性对照探针和空白对照探针。即除定位点探针外，其余探针均重复点三次。

表1 昆虫基因芯片分子鉴定探针排布示意列表

                                   定位点探针定位点探针  科探针  属1探针  属2探针  属3探针  。。。^*  属1亚属1探针  属1亚属2探针  属1亚属3探针  属1亚属4探针  。。。  属2亚属1探针  属2亚属2探针  属1亚属3探针  属1亚属4探针  。。。  。。。  。。。  。。。  。。。  。。。  复合/近缘种1探针  复合/近缘种2探针  复合/近缘种3探针  复合/近缘种4探针  复合/近缘种5探针  复合/近缘种6探针  复合/近缘种7探针  复合/近缘种8探针  复合/近缘种9探针  复合/近缘种10探针  。。。  。。。  。。。  。。。  。。。  种/亚种1探针  种/亚种2探针  种/亚种3探针  种/亚种4探针  种/亚种5探针  种/亚种6探针  种/亚种7探针  种/亚种8探针  种/亚种9探针  种/亚种10探针  。。。  。。。  。。。  。。。  。。。  阳性对照探针  阴性对照探针  空白对照探针

^*表示更多的亚属、复合种/近缘种探针或种/亚种探针

从待鉴定的昆虫体内提取DNA，用通用引物进行PCR扩增后与上述芯片杂交。昆虫物种的鉴定可以通过杂交结果的芯片点阵上探针的信号位置和数量来确定，能鉴定到的最小分类阶元结果判定原则如表2所示。即当科探针、属探针、亚属探针、复合种/近缘种探针和种/亚种探针同时出现信号，可鉴定到种或亚种。

表2 昆虫生物芯片分子鉴定判定原则

  科探针  属探针  亚属探针   复合种/近缘种探针 种/亚种探针  鉴定的最小分类阶元  +  科  +  +  属  +  +  +  亚属  +  +  +  +  复合种/近缘种  +  +  +  +  +  种/亚种

实例2生物芯片快速区分桔小实蝇复合种和分子检索表

桔小实蝇是一种一种双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、果实蝇属(Bactrocera)、果实蝇亚属(Bactrocera)昆虫。桔小实蝇复合种达75种之多，种类之间形态较难区分。生物芯片快速区分桔小实蝇五个复合种是在芯片基片上设置1条实蝇科通用探针、1条属通用探针、1条亚属通用探针和6条复合种特异探针，按照实例1的昆虫分子鉴定原理，生物芯片鉴定桔小实蝇复合种探针排布如表3，经过芯片杂交以后再通过一种分子检索表将复合种互相区分开。表3中各探针的序列参见表4、表5及序列表中所示。其中，芒果实蝇种探针可以选用Seq ID No.10或Seq ID No.11中的任意一种或两种。

表3 生物芯片鉴定桔小实蝇复合种探针排布表

定位点探针                                   定位点探针  实蝇科探针果实蝇属探针果实蝇亚属探针复合种探针1复合种探针2  复合种探针3复合种探针4  复合种探针5复合种探针6芒果实蝇种探针  阳性对照探针阴性对照探针  空白对照探针

表4 桔小实蝇五个复合种生物芯片检测探针一览表

探针名称             序列   SeqID No.           探针说明实蝇科探针AGCAAAGACTGCTCCTATTGATAAT   1实蝇科Tephritidae通用探针果实蝇属探   针CACAATATGGCTGGTGAATAGTTT   2果实蝇属Bactrocera通用探针果实蝇亚属   探针GGGTATCAGTGAACGAATCCT   3果实蝇亚属Bactrocera通用探针复合种探针1ATAATAGCAAAGATTGCTCCTATTGA   4桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇复合种探针复合种探针2CTACGTAATATGTGTCATGAAGAA   5桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇和芒果实蝇复合种探针复合种探针3TTACTCCGATAGACATGATAATAAATTG   6桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇复合种探针复合种探针4AAACCCTAGGGCTTACAATATGG   7桔小实蝇、木瓜实蝇、菲律宾实蝇和杨桃实蝇复合种探针复合种探针5CCGATAAATATGATAATGAACTGACTT   8木瓜实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇复合种探针复合种探针6ATCATTTAGGATTCAATACTAGCCC   9桔小实蝇、木瓜实蝇复合种探针芒果实蝇 种探针TATGATAATGAACTGACTTTTTAATC   10芒果实蝇特异探针CTCCGATAAATATGATAATGAACTGAC   11

表5 质控探针序列

探针类型  Seq ID No.               探针序列        说明定位点探针  12 TGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC  --阳性对照探针  13 TGAGACCAACCAACTGAAACG  --阴性对照探针  14 GACTATAGTATAAGCGCGGTCCA  --空白对照  - --  50％DMSO缓冲液

从待鉴定实蝇标本(卵、幼虫、蛹或成虫均可)提取基因组DNA，用实蝇科mtDNA COI基因通用引物COI3/COI5(表6)，利用荧光掺入法进行荧光标记PCR扩增。

表6 荧光标记PCR引物序列

  类型 名称  Seq ID No.                     序列正向引物COI3     15 5′-TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGG-3′反向引物COI5     16 5′-CTGGAGGGGTATTTTGAAGTCATT-3′

将PCR产物与芯片进行杂交反应，杂交结果与以下预设的分子检索表进行比对，从而能够快速准确地直接判断待鉴定实蝇的分类地位。

桔小实蝇5个复合种分子鉴定检索表

1 实蝇科探针阳性(Tephritidae科)，果实蝇属探针阳性(Bactrocera属)，果实蝇亚属探针阳性(Bactrocera亚属)，复合种探针1探针阳性(桔小实蝇5个复合种)，复合种探针2阳性.........................2复合种探针3阴性；复合种探针5阴性，复合种探针2、复合种探针4和复合种探针6、芒果实蝇种探针阳性...........芒果实蝇B.occipitalis

2 复合种探针3、复合种探针4阳性，复合种探针5和/或复合种探针6阴性............................................................3复合种探针3、复合种探针4、复合种探针5和复合种探针6均为阳性...............................................木瓜实蝇B.papayae

3 复合种探针5或复合种探针6阳性.............................4复合种探针5和复合种探针6阴性...................杨桃实蝇B.carambolae

4 复合种探针5阳性.....................菲律宾实蝇B.philippinensis复合种探针6阳性................................桔小实蝇B.dorsalis

该分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法将杂交结果进行分类，并列出了杂交结果与昆虫种类的对应关系。每个序列号下，都按照二分法将杂交结果进行分类，并且每个分类都对应一个鉴定结果，或者直接鉴定出何种昆虫，或者指引到下一个分类。由此，将芯片杂交结果与分子检索表进行比对，就能够快速准确地判断出待鉴定实蝇的种类。

实验例

进口龙眼实蝇检疫鉴定。从进口泰国龙眼检疫中发现一个虫果有实蝇卵27粒，收集5-8粒卵，用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品，其余卵粒接种在龙眼果实上，26-28℃培养2-3天，卵孵化成幼虫，期间补充幼虫所需的寄主(新鲜龙眼)，待幼虫长成2-3龄，取幼虫2-3头(用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品)，其余幼虫继续饲养一周左右后老熟幼虫化蛹，取蛹1-2头(用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品)；其余继续饲养，10-15天蛹羽化成虫并确保形态特征成熟稳定，成虫置体视显微镜鉴定为桔小实蝇Bactrocera dorsalis。

期间，将从泰国龙眼上收集的实蝇的卵、幼虫和蛹样品分别按照实施例2中所描述的方法进行分类检测，生物芯片检测结果为：

实蝇科探针阳性，果实蝇属探针阳性，果实蝇亚属探针阳性，复合种探针1阳性，复合种探针2阳性；复合种探针3、复合种探针4阳性；复合种探针6阳性。

与实施例2中的分子检索表进行比对，可直接判定为桔小实蝇，与传统形态学鉴定结果一致。

采用相同方法验证其余种实蝇(木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇)，结果均证明采用本发明的方法结合分子检索表进行分类的结果与传统形态学鉴定结果一致，但比传统方法更加快速、准确且易于推广应用。

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120>一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法

<130>0610866

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>实蝇科Tephritidae通用探针

<220>

<221>misc_feature

<223>实蝇科通用探针

<400>1

agcaaagact gctcctattg ataat    25

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>果实蝇属通用探针

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cacaatatgg ctggtgaata gttt         24

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feture

<223>果实蝇亚属通用探针

<400>3

gggtatcagt gaacgaatcc t            21

<210>4

<211>26

<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<223>桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇复合种探针

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ataatagcaa agattgctcc tattga       26

<210>5

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<212>DNA

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<223>桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇和芒果实蝇复合种探针

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ctacgtaata tgtgtcatga agaa        24

<210>6

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<212>DNA

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<221>misc_feature

<223>桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇复合种探针

<400>6

ttactccgat agacatgata ataaattg    28

<210>7

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<212>DNA

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<223>桔小实蝇、木瓜实蝇、菲律宾实蝇和杨桃实蝇复合种探针

<400>7

aaaccctagg gcttacaata tgg         23

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<212>DNA

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<223>木瓜实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇复合种探针

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<223>桔小实蝇、木瓜实蝇复合种探针

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atcatttagg attcaatact agccc       25

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<223>芒果实蝇特异探针

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<223>芒果实蝇特异探针

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<212>DNA

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<223>定位点探针

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<223>阳性对照探针

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<223>阴性对照探针

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>COI3引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>COI5引物

<400>16

ctggaggggt attttgaagt catt       24