一种混合床凝胶过滤层析技术用于病毒性疫苗纯化的方法

摘要

本发明一种混合床凝胶过滤层析技术用于病毒性疫苗纯化的方法，属于生物技术领域，其步骤为，将Sepharose 4FF凝胶与Sepharose 6 FF凝胶充分混匀后装填于柱中，将超滤浓缩后的病毒抗原上样于混合床柱进行凝胶过滤层析，获得纯化的病毒抗原。本发明提供了一种纯化效果好、抗原回收率高的病毒抗原纯化新方法，纯化的病毒抗原适合于制备疫苗。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及病毒抗原的纯化方法。

背景技术：

病毒抗原的纯化是研究及生产中的一个关键问题。为了去除培养过程中的杂质，一个好的病毒抗原纯化工艺应该有效去除各种培养过程中带来的杂蛋白、DNA、内毒素及其它杂质，并且具有很好的抗原回收率。

传统的病毒类疫苗纯化采用密度梯度超速离心工艺，该工艺需要价格昂贵的超速离心机，而且一次处理的样品量受到限制，为疫苗的产业化带来困难。

凝胶过滤层析因其条件温和、重复性好、便于产业化，因此在蛋白工程、疫苗生产中得到推广。但是由于不同的病毒颗粒直径差异较大，因而采用现有的凝胶过滤层析技术不能满足多种病毒抗原纯化的需要。

密度梯度超速离心和凝胶过滤层析技术联合使用用于病毒抗原的纯化，由于抗原回收率较低、工艺复杂使得在实际应用中受到限制。

混合柱技术在离子交换法制备纯化水的工艺中被采用，但是混合床凝胶过滤层析用于病毒抗原纯化目前尚无文献报道。

发明内容：

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种纯化效果好、抗原回收率高的病毒抗原纯化新方法，且工艺条件温和、重复性好、便于产业化。

本发明的技术方案及步骤：

(1)采用组织培养技术或重组DNA技术收获病毒抗原；

(2)取Sepharose 4FF和Sepharose 6FF凝胶，Sepharose 4FF凝胶与Sepharose 6FF凝胶混合的体积比为0.05∶1～20∶1，充分混匀后装填于柱中；

(3)用0.1～0.5mol/LNaOH，以线流速10-100cm/h去除内毒素，维持时间2-10小时；

(4)用含0.02～0.50mol/L氯化钠或氯化钾的平衡溶液平衡柱子；

(5)对需要纯化病毒抗原，用截留分子量10～300kD的超滤膜进行超滤浓缩；

(6)将浓缩后溶液上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱，上样量为1～15％柱体积，洗脱液与平衡溶液相同；

(7)分部收集，进行相应指标测定。

其中所述的病毒抗原可以包括：甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒、重组乙型肝炎病毒表面抗原、重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白抗原、重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白抗原；以上所提及的病毒，如甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、甲1型流感病毒、甲3流感病毒、乙型流感病毒、狂犬病毒，可以在灭活之前或灭活之后进行纯化，优选在病毒灭活后进行纯化；病毒抗原液在纯化前可以用100-300kD超滤膜进行浓缩；Sepharose 4FF凝胶与Sepharose 6FF凝胶混合的体积比可以为0.2∶1～20∶1，充分混匀后装填混合床柱；上样体积可以为柱体积的10～15％，以含有0.02～0.50mol/L的氯化钠或氯化钾的洗脱液进行洗脱，其中洗脱液中可含适宜浓度的缓冲组分，如0.01～0.20mol/L的Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH6.5～8.0或0.01～0.20mol/L Tris-HCl，pH7.0～8.0。

本发明的有益效果是：利用混合床凝胶层析技术，即将Sepharose 4FF凝胶与Sepharose 6FF凝胶充分混匀后装填于柱中(可简称混合床柱)，通过控制Sepharose 4FF与Sepharose 6FF的不同比例，使得混合床柱具有与Sepharose 4FF与Sepharose 6FF不同的分离特性，从而获得一种纯化效果好、抗原回收率高的病毒抗原纯化新方法，且本方法条件温和、重复性好、便于产业化。本发明纯化的病毒抗原，适宜于制备疫苗。

具体实施方式：

实施例1

将甲型肝炎病毒接种于Vero细胞，37℃培养28天后，收获细胞，细胞经超声-冻融三次后，以体积比1∶1用氯仿进行抽提，8℃，4000rpm离心30分钟，吸取上清，再对氯仿层用0.01mol/L PBS pH7.4抽提4次，8℃，4000rpm离心30分钟，合并上清液即为甲型肝炎病毒液。甲型肝炎病毒液中加入甲醛至终浓度0.2％，37℃灭活14天，用10kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的甲型肝炎病毒抗原。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按0.05∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1850ml。

用0.1mol/L NaOH以3.3ml/min的流速(线性流速10cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间6小时；用含0.02mol/L氯化钠，0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH6.5的平衡缓冲液平衡柱子。待纯化甲型肝炎病毒抗原18.5ml(柱体积的1％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为含0.02mol/L氯化钠，0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH6.5。分部收集，分别测定甲型肝炎表面抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                 

甲型肝炎病毒抗原回收率  88.4％

蛋白去除率  96.2％

纯化后的甲型肝炎病毒抗原内毒素含量  1EU/ml

实施例2

将乙型脑炎病毒接种于Vero细胞，37℃培养28天后，收获培养上清液，8℃，4000rpm离心30分钟，取上清，即为乙型脑炎病毒液。乙型脑炎病毒液中加入甲醛至终浓度0.2％，37℃灭活14天，用300kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的乙型脑炎病毒抗原。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按20∶1的体积比充分混匀，将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1700ml。

用0.5mol/L NaOH以33ml/min的流速(线性流速100cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间4小时；用含0.50mol/L氯化钠，0.20mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0的平衡缓冲液平衡柱子。待纯化乙型脑炎病毒抗原255ml(柱体积的15％)上样于充分平衡的Sepharose 4 FF-Sepharose 6FF混合床柱。脱液为0.50mol/L氯化钠，0.20mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0。分部收集，分别测定乙型脑炎病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                 

乙型脑炎病毒抗原回收率  87.5％

蛋白去除率  94.6％

纯化后的乙型脑炎病毒抗原内毒素含量  1EU/ml

实施例3

将脊髓灰质炎病毒接种于Vero细胞，37℃培养28天后，收获培养上清液，8℃，4000rpm离心30分钟，吸取上清，即为脊髓灰质炎病毒液。脊髓灰质炎病毒液中加入甲醛至终浓度0.2％，37℃灭活14天，用100kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的脊髓灰质炎病毒抗原。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按0.2∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1820ml。

用0.5mol/L NaOH以20ml/min的流速(线性流速60cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间2小时；用含0.02mol/L氯化钾，0.01mol/L Tris-HCl，pH7.0的平衡缓冲液平衡柱子。待纯化脊髓灰质炎病毒抗原182ml(柱体积的10％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.02mol/L氯化钾，0.01mol/LTris-HCl，pH7.0。分部收集，分别测定脊髓灰质炎病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                

脊髓灰质炎病毒抗原回收率  86.2％

蛋白去除率  96.4％

纯化后的脊髓灰质炎病毒抗原内毒素含量  1EU/ml

实施例4

将狂犬病毒接种于地鼠肾细胞，37℃培养30天后，收获培养上清液，8℃，4000rpm离心30分钟，取上清，即为狂犬病毒液。狂犬病毒液中加入甲醛至终浓度0.15％，37℃灭活21天，用300kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的狂犬病毒抗原。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按5∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1800ml。

0.5mol/L NaOH以5ml/min的流速(线性流速15cm/h)处理混合床柱去除柱中内毒素，维持时间10小时；用含0.50mol/L氯化钾，0.20mol/L Tris-HCl，pH8.0平衡洗脱液平衡柱子。待纯化狂犬病毒培养液90ml(柱体积的5％)，上样于充分平衡的Sepharose 4 FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.50mol/L氯化钾，0.20mol/LTris-HCl，pH8.0。分部收集，分别测定狂犬病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                 

狂犬病毒抗原回收率  90.5％

蛋白去除率  94.2％

纯化后的狂犬病毒抗原内毒素含量  0.5EU/ml

实施例5

将甲1型流感病毒接种于7日龄健康鸡胚，37℃培养72小时，收获尿囊液，即为流感病毒液，加入甲醛至终浓度0.4％灭活病毒，4000rpm离心30分钟，收集上清，用300kD超滤膜超滤至原体积的百分之一，即为待纯化的甲1型流感病毒抗原液。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按1.5∶1的体积比充分混匀；将混合后的凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1820ml；

用0.5mol/L NaOH以15ml/min的流速(线性流速45cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间5小时；用含0.20mol/L氯化钠，0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2的洗脱液平衡柱子。待纯化甲1型流感病毒抗原液127ml(柱体积的7％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.20mol/L氯化钠，0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2。分部收集，分别测定流感病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                        

流感病毒抗原回收率  88.6％

蛋白去除率  97.6％

纯化后的流感病毒抗原内毒素含量  2EU/ml

实施例6

将甲3型流感病毒接种于7日龄健康鸡胚，37℃培养72小时，收获尿囊液，即为流感病毒液，加入甲醛至终浓度0.4％灭活病毒，4000rpm离心30分钟，收集上清，用100kD超滤膜超滤至原体积的百分之一，即为待纯化的甲3型流感病毒抗原液。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按1.5∶1的体积比充分混匀；将混合后的凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1820ml；

用0.5mol/L NaOH以15ml/min的流速(线性流速45cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间5小时；用含0.20mol/L氯化钠，0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2的洗脱液平衡柱子。待纯化甲3型流感病毒抗原液91ml(柱体积的5％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.20mol/L氯化钠，0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2。分部收集，分别测定流感病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                        

流感病毒抗原回收率  89.4％

蛋白去除率  98.2％

纯化后的流感病毒抗原内毒素含量  1EU/ml

实施例7

将乙型流感病毒接种于7日龄健康鸡胚，37℃培养72小时，收获尿囊液，即为流感病毒液，加入甲醛至终浓度0.4％灭活病毒，4000rpm离心30分钟，收集上清，用300kD超滤膜超滤至原体积的百分之一，即为待纯化的乙型流感病毒抗原液。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按1.5∶1的体积比充分混匀；将混合后的凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1820ml；

用0.5mol/L NaOH以15ml/min的流速(线性流速45cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间5小时；用含0.20mol/L氯化钠，0.01mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2的洗脱液平衡柱子。待纯化乙型流感病毒抗原液127ml(柱体积的7％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.20mol/L氯化钠，0.01mol/LNa₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.2。分部收集，分别测定流感病毒抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                                

流感病毒抗原回收率  87.8％

蛋白去除率  97.4％

纯化后的流感病毒抗原内毒素含量  2EU/ml

实施例8

将表达重组乙型肝炎病毒表面抗原的汉逊酵母接种于生物反应器，发酵72小时，8℃，4000rpm离心30分钟收获菌体，按照每1000克菌体加入3000ml破碎缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.005mol/L PMSF，0.02mol/L EDTA，pH7.5)，混匀后用球磨机破碎细胞，8℃，10000rpm离心1小时，收集上清，上清液按体积每1000ml加入50克硅胶进行吸附，离心收集硅胶沉淀，按照硅胶沉淀量每1000克加入3000ml 0.05mol/LTris-HCl，1％脱氧胆酸钠，pH7.5，60℃脱吸附3小时，8℃，10000rpm离心1小时，收集上清，即为含重组乙型肝炎病毒表面抗原的抗原液。用100kD超滤膜浓缩至原体积的十分之一，即为待纯化的重组乙型肝炎病毒表面抗原。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按0.5∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1750ml；

用0.5mol/L NaOH以10ml/min的流速(线性流速30cm/h)处理混合床柱去除内毒素，维持时间4小时；用含0.05mol/L氯化钾，0.02mol/L Tris-HCl，pH7.5的洗脱液平衡柱子。待纯化的重组乙型肝炎病毒表面抗原上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱，上样体积35ml(柱体积的2％)，洗脱液含0.05mol/L氯化钾，0.02mol/L Tris-HCl，pH7.5。分部收集，分别测定乙肝病毒表面抗原、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                            

重组乙型肝炎病毒表面抗原回收率  89.5％

蛋白去除率  95.6％

纯化后的重组乙型肝炎病毒表面抗原内毒素含量  0.5EU/ml

实施例9

将表达重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白的汉逊酵母接种于生物反应器，发酵96小时，8℃，4000rpm离心30分钟收获菌体，按照每1000克菌体加入3000ml破碎缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L PMSF，0.02mol/L EDTA，pH7.5)，混匀后用球磨机破碎细胞，8℃，10000rpm离心1小时，收集上清，即为含重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白的抗原液。用50kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白抗原液。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按0.5∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1850ml。

0.5mol/L NaOH以15ml/min的流速(线性流速45厘米/小时)处理混合床柱去除柱中内毒素，维持时间5小时；用含0.35mol/L氯化钠，0.05mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.4的洗脱液平衡柱子。待纯化的重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白抗原液93ml(柱体积的5％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.35mol/L氯化钠，0.05mol/L Na₂HPO₄-NaH2PO₄，pH7.4。分部收集，分别测定人乳头瘤病毒16型L1蛋白、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                            

重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白回收率  91.5％

蛋白去除率  96.6％

纯化后的重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白内毒素含量  1EU/ml

实施例10

将表达重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的汉逊酵母接种于生物反应器，发酵96小时，8℃，4000rpm离心30分钟收获菌体，按照每1000克菌体加入3000ml破碎缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L PMSF，0.02mol/L EDTA，pH7.5)，混匀后用球磨机破碎细胞，8℃，10000rpm离心1小时，收集上清，即为含重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的抗原液。用50kD超滤膜浓缩至原体积的百分之一，即为待纯化的重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白抗原液。

取Sepharose 4FF、Sepharose 6FF凝胶，按0.4∶1的体积比充分混匀；将混合后凝胶装填于XK50/100柱中，柱体积1850ml。

0.5mol/L NaOH以20ml/min的流速(线性流速60厘米/小时)处理混合床柱去除柱中内毒素，维持时间5小时；用含0.35mol/L氯化钠，0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5的洗脱液平衡柱子。待纯化的重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白抗原液111ml(柱体积的6％)上样于充分平衡的Sepharose 4FF-Sepharose 6FF混合床柱。洗脱液为0.35mol/L氯化钠，0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5。分部收集，分别测定人乳头瘤病毒18型L1蛋白、蛋白浓度和内毒素含量。

纯化结果：                                      

重组人乳头瘤病毒18 L1蛋白回收率  88.5％

蛋白去除率  95.6％

纯化后的重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白内毒素含量  0.5EU/ml

本发明与现有技术的纯化效果比较：

 抗原回收率 蛋白去除率    内毒素含量    (EU/ml)现有技术1(密度梯度超速离心)    75％    80％    4现有技术2(密度梯度超速离心+凝胶过滤层析)    60％    90％    4实施例1    88.4％    96.2％    1实施例2    87.5％    94.6％    1实施例3    86.2％    96.4％    1实施例4    90.5％    94.2％    0.5实施例5    88.6％    97.6％    2实施例6    89.4％    98.2％    1实施例7    87.8％    97.4％    2实施例8    89.5％    95.6％    0.5实施例9    91.5％    96.6％    1实施例10    88.5％    95.6％    0.5

从上表可以看出，本发明在抗原回收率、蛋白去除率以及内毒素含量上均优于现有技术，说明本发明是一种纯化效果好、抗原回收率高的病毒抗原纯化新方法。