检测HIV对逆转录酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒

摘要

本发明涉及一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒。其中该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段；利用设计的引物将待检测样品的cDNA进行PCR扩增，将扩增产物进行纯化标记并与上述基因芯片进行杂交，用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定耐药性位点突变情况完成耐药性检测。本发明将基因芯片技术引入中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测领域，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的全新检测方法，可据此及时了解HIV治疗效果并可为治疗方案提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种基因芯片(或称DNA微阵列)及其使用方法和检测试剂盒，特别涉及基于人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus Type 1HIV-1)逆转录酶(reverse transcriptase，RT)基因内点突变的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒。

背景技术

艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired ImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，是由攻击并破坏对人体免疫系统中十分重要的某些白细胞的人类免疫缺陷病毒，即HIV引起的一组破坏性感染。1985年，中国报告第一例艾滋病病人。目前，中国艾滋病处在全国低流行和局部地区及特定人群高流行并存的态势。截至2004年9月底，累计报告的艾滋病病毒感染者89,067例，其中艾滋病病例20,786例。如果不采取有效措施，预计到2010年中国的艾滋病感染者将达到1000万。中国目前艾滋病感染人数正高速增长，并且疫情从高危人群向一般人群传播，形式非常严峻。

HIV是艾滋病的病原体。HIV是单链RNA病毒，分类上属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒属(lentivirus)。全球流行的HIV根据血清学反应和病毒核酸序列测定可分为二型：HIV-1型和HIV-2型。HIV基因组长约9.2-9.7kb，含gag，pol，env3个结构基因，及至少6个调控基因(tat，rev，nef，vif，vpu，vpr)，并在基因组的5’端和3’端各含有长末端重复序列(longterminal repeats)。其pol基因编码Gag-pol前体蛋白中的聚合酶部分，为病毒增殖所必需。目前已有3类超过17种抗逆转录病毒药物进入临床治疗，多数药物针对HIV复制过程的关键酶-逆转录酶。这些药物又可分为核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)。逆转录酶抑制剂药物是非常重要的抗艾滋病药物，也是目前中国艾滋病患者使用最多的药物。

抗HIV药物能有效地抑制HIV敏感株的复制，使血浆中的病毒载量迅速下降，改善患者体征。但HIV的逆转录酶缺乏校正功能，使HIV复制过程中可随机产生各种突变，其中某些突变会造成病毒对药物的敏感性降低。当药物选择压力存在后，这些能够在药物存在情况下继续复制增殖的病毒株会迅速成为患者体内主要病毒株。所以在使用抗HIV药物后经过一段时间，通常都会产生HIV耐药株。其中有些耐药株出现交叉耐药性，即对一种药物有抗药性，对其它药物也有抗药性。

如上所述，对体内分离或体外培养的耐药性病毒株的遗传学分析揭示出病毒的耐药性都是由于病毒基因组一些特异性的遗传突变所致。目前，临床使用的多数抗HIV-1/AIDS药物的耐药性与病毒基因相关位点突变的关系都已阐述得比较清楚(详见http://hiv.lanl.gov)。这样，HIV病毒耐药性分析就可以转化为检测碱基突变的问题。

HIV的耐药性是HIV治疗中很难解决的问题，一旦发生耐药，特别是交叉耐药的出现，就会使得可供选择的药物大大减少。对单一病人来说，是对其个体治疗的不利，对整个社会来说，耐药菌株在人群中的广泛流行，对人类健康的破坏是不可估量的。及时了解HIV的耐药性，不仅对病人准确用药和有效治疗有很大帮助，而且对于防止耐药株的广泛流行以及对整个艾滋病疫情的控制都有重大意义。

目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，可在样品收集后1～2周得到结果，表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。在基因型耐药检测方法中，DNA序列分析是最精确的方法，但工作量较大，昂贵且费时。基因芯片的产生，将逐步取代用测序研究耐药性位点的方法，能够高通量、快速、灵敏的检测出耐药位点。

基因芯片(genechip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核苷酸阵列(oligonucleotide array)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，采用原位合成或显微打印手段，将DNA探针有规律地排列固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品(样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子)按碱基配对原理进行杂交，通过荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术可实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。

综上所述，可以将基因芯片技术引入HIV的耐药性检测领域，将RT区作为靶位点区设计探针，通过样品靶核酸与含突变位点的探针之间的杂交来确定病毒基因组中是否存在耐药性相关位点的突变，从而快速判断病毒是否具有耐药性以及耐药性程度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于RT基因的含有单碱基突变序列的中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测芯片，为国内现有的以测序为基础的耐药性检测技术提供一种更为简单和经济的替代方法。

本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片简便、快捷、高效的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法。

本发明的再一目的是提供一种至少包括上述基因芯片的用于检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中该基因芯片上的寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。

在本发明的较佳实施例中，上述HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段为具有SEQ ID NO：1-NO：96所示核苷酸序列的DNA片段。

本发明还提供了一种检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其根据HIV逆转录酶基因区内突变位点的数量确定其耐药性程度，包括以下步骤：

(1)制备待测样品的cDNA；

(2)设计并制备出用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物；

(3)使用上述步骤(2)所述的引物对上述步骤(1)所述的cDNA进行PCR扩增；

(4)纯化上述扩增产物；

(5)标记纯化片段；

(6)将标记产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；

(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定耐药性位点突变情况完成耐药性检测。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(2)中的用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(3)中所用的PCR扩增为NestedPCR。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(5)中标记纯化片段为利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP进行标记。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(6)中的杂交的杂交温度例如为36℃，杂交时间例如为16h。

本发明还提出一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的试剂盒，其至少包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。

在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括PCR扩增引物，这些引物为含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。

在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件GenePix Pro 6.0。

综上所述，本发明可以检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂药物(核苷类逆转录酶抑制剂以及非核苷类逆转录酶抑制剂)的耐药性，逆转录酶抑制剂药物是非常重要的抗艾滋病药物，也是目前中国艾滋病患者使用最多的药物。另外采用只针对中国境内分离的HIV毒株耐药性，可以减少用于检测特异性探针，降低成本。

本发明将基因芯片技术引入中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测领域，填补了芯片对中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的空白，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的全新检测方法，可据此及时了解HIV治疗效果并可为治疗方案提供参考。这种芯片与国内现有的以测序为基础的耐药性检测技术相比，具有高通量、快速检测和简单经济的优势。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明一较佳实施例的基因芯片的外形和探针分布的示意图。

图2为发生耐药性突变的毒株与本发明一较佳实施例的基因芯片杂交后的扫描结果图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例加以说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式限制本发明。

实施例一寡核苷酸探针的制备

1.探针设计：根据163株(其中3株分别为HXB2，U71182和AY531116，为HIV在中国的代表株；另外160条序列由中国疾病预防控制中心性艾中心提供，为2004年中国境内分离到的HIV耐药株)HIV RT基因的生物信息学的比对结果，利用Primer Premier 5.0生物信息学软件设计并筛选出针对14个位点的96条探针(如表1所示)，筛选时主要依据以下两点：一是将检测位点置于探针的中央位置，二是使所有探针的Tm值保持一致。

表1筛选出的寡核苷酸探针

   SEQ ID   probe ID    定位号          序列   NO：1   S001    65_w_se          5-CATAAAGAAAAAAGACA-3   NO：2   S002    65_r_se          5-CATAAAGAGAAAAGACA-3   NO：3   S003    65_w_an          5-TGTCTTTTTTCTTTATG-3   NO：4   S004    65_r_an          5-TGTCTTTTCTCTTTATG-3   NO：5   S005    67_w_se          5-AAGAAAAAAGACAGTACTA-3   NO：6   S006    67_r1_se          5-AAGAAAAAAAACAGTACTA-3   NO：7   S007    67_w_an          5-TAGTACTGTCTTTTTTCTT-3   NO：8   S008    67_r1_an          5-TAGTACTGTTTTTTTTCTT-3   NO：9   S009    67_r2_se          5-AGAAAAAAGGCAGTACTA-3   NO：10   S010    67_r2_an          5-TAGTACTGCCTTTTTTCT-3   NO：11   S011    74_w_se          5-GGAGAAAATTAGTAGAT-3   NO：12   S012    74_r_se          5-GGAGAAAAGTAGTAGAT-3   NO：13   S013    74_w_an          5-ATCTACTAATTTTCTCCA-3   NO：14   S014    74_r_an          5-ATCTACTACTTTTCTCCA-3   NO：15   S015    75_w_se          5-GAAAATTAGTAGATTTCAG-3   NO：16   S016    75_r1_se          5-AAAATTAACAGATTTCAG-3   NO：17   S017    75_w_an          5-CTGAAATCTACTAATTTTC-3   NO：18   S018    75_r1_an          5-CTGAAATCTGTTAATTTT-3   NO：19   S019    75_r2_se          5-AGAAAATTATTAGATTTCA-3′   NO：20   S020    75_r2_an          5-TGAAATCTAATAATTTTCT-3′   NO：21   S021    101_w_se          5-GCAGAGTTAAAAAAGAAA-3′   NO：22   S022    101_r1_se          5-CAGAGTTAGAAAAGAAAAA-3′   NO：23   S023    101_w_an          5-TTTCTTTTTTAACTCTGC-3′   NO：24   S024    101_r1_an          5-TTTTTCTTTTCTAACTCTG-3′

   NO：25   S025    101_r2_se      5-CAGAGTTAAGAAAGAAAAA-3   NO：26   S026    101_r2_an      5-TTTTTCTTTCTTAACTCTG-3   NO：27   S027    101_r3_se      5-GCAGGGTTACAAAAGAA-3   NO：28   S028    101_r3_an      5-TTCTTTTGTAACCCTGC-3   NO：29   S029    103_w(1)_se      5-AAAAAAGAAAAAATCAG-3   NO：30   S030    103_r1(1)_se      5-AAAAAAGAACAAATCAG-3   NO：31   S031    103_w(1)_an      5-CTGATTTTTTCTTTTTT-3   NO：32   S032    103_r1(1)_an      5-CTGATTTGTTCTTTTTT-3   NO：33   S033    103_r2_se      5-AAAAAAGAGAAAATCTGT-3   NO：34   S034    103_r2_an      5-ACAGATTTTCTCTTTTTT-3   NO：35   S035    103_w(1)_se      5-AAAAAGAAAAAATCCGT-3   NO：36   S036    103_w(1)_an      5-ACGGATTTTTTCTTTTT-3   NO：37   S037    103_r1(2)_se      5-AAAAAAGAATAAATCTGTA-3   NO：38   S038    103_r1(2)_an      5-TACAGATTTATTCTTTTTTAA-3   NO：39   S039    103_w(1)_se      5-AAAAATCAGTAACAGTACTG-3   NO：40   S040    103_r1_se      5-AAAATCAGCAACAGTACT-3   NO：41   S041    103_w(1)_an      5-CAGTACTGTTACTGATTTTT-3   NO：42   S042    103_r1_an      5-AGTACTGTTGCTGATTTT-3   NO：43   S043    106_w(2)_se      5-AAAAATCCGTAACAGTC-3′   NO：44   S044    106_w(2)_an      5-GACTGTTACGGATTTTT-3′   NO：45   S045    106_r2(1)_se      5-AAAAATCCATAACAGTC-3′   NO：46   S046    106_r2(1)_an      5-GACTGTTATGGATTTTT-3′   NO：47   S047    106_r2(2)_se      5-AAAAATCAATAACAGTCC-3′   NO：48   S048    106_r2(2)_an      5-GGACTGTTATTGATTTTT-3′   NO：49   S049    106_r2(3)_se      5-AAAAAATCTATAACAGTCC-3′   NO：50   S050    106_r2(3)_an      5-GGACTGTTATAGATTTTTT-3′   NO：51   S051    108_w_se      5-CAGTAACAGTCCTGGATG-3   NO：52   S052    108_r_se      5-CAGTAACAATTCTGGATG-3   NO：53   S053    108_w_an      5-CATCCAGGACTGTTACTG-3   NO：54   S054    108_r_an      5-CATCCAGAATTGTTACTG-3   NO：55   S055    118_w_se      5-ATTTCTCAGTCCCTTTA-3   NO：56   S056    118_w_an      5-TAAAGGGACTGAGAAAT-3   NO：57   S057    118_r_se      5-ATTTTTCATTCCCTTTA-3   NO：58   S058    118_r_an      5-TAAAGGGAATGAAAAAT-3   NO：59   S059    179_w_se      5-CCAGACATAGTTATCTATCA-3   NO：60   S060    179_w_an      5-GATAGATAACTATGTCTGG-3   NO：61   S061    179_r1_se      5-AGACATAGATATCTGCCA-3   NO：62   S062    179_r1_an      5-GATAGATATCTATGTCTGG-3   NO：63   S063    179_r2_se      5-CCAGACATAGAAATCTATCA-3   NO：64   S064    179_r2_an      5-GATAGATTTCTATGTCTGG-3   NO：65   S065    181_w(1)_se      5-GTTATCTATCAATACATGG-3   NO：66   S066    181_r1(1)_se      5-TAGTTATCTGTCAATACATG-3   NO：67   S067    181_w(1)_an      5-CCATGTATTGATAGATAAC-3   NO：68   S068    181_r1(1)_an      5-CCATGTATTGACAGATAA-3

   NO：69   S069    181_r2_se      5-ATAGTTATCATTCAATACAT-3   NO：70   S070    181_r2_an      5-ATGTATTGAATGATAACTAT-3   NO：71   S071    181_w(2)_se      5-ATAGTTATCTATCAATACATG-3   NO：72   S072    181_r1(2)_se      5-CATGTATTGATAGATAACTAT-3   NO：73   S073    181_w(2)_an      5-ATAGTTATCTGTCAATACATG-3   NO：74   S074    181_r1(2)_an      5-CATGTATTGACAGATAACTAT-3   NO：75   S075    188_w_se      5-ATGATTTGTATGTAGGAT-3   NO：76   S076    188_w_an      5-ATCCTACATACAAATCAT-3   NO：77   S077    188_r1_se      5-TGATTTGTGTGTAGGAT-3   NO：78   S078    188_r1_an      5-ATCCTACACACAAATCA-3   NO：79   S079    188_r2_se      5-ATGATTTGTTAGTAGGATC-3   NO：80   S080    188_r2_an      5-TGATCCTACTAACAAATCAT-3   NO：81   S081    190_w_se      5-GTATGTAGGATCTGACTT-3   NO：82   S082    190_r1_se      5-GTATGTAGCATCTGACTT-3   NO：83   S083    190_w_an      5-AAGTCAGATCCTACATAC-3   NO：84   S084    190_r1_an      5-AAGTCAGATGCTACATAC-3   NO：85   S085    190_r2_se      5-TGTATGTAAGCTCTGACTT-3   NO：86   S086    190_r2_an      5-AAGTCAGAGCTCTACATACA-3   NO：87   S087    215_w(1)_se      5-GGGATTTACCACACCAG-3   NO：88   S088    215_w(1)_an      5-CTGGTGTGGTAAATCCC-3   NO：89   S089    215_r1(1)_se      5-GGGATTTTTCACACCAG-3   NO：90   S090    215_r1(1)_an      5-CTGGTGTGAAAAATCCC-3   NO：91   S091    215_r2_se      5-GGGATTTGCCACACC-3   NO：92   S092    215_r2_an      5-GGTGTGGCAAATCCC-3   NO：93   S093    215_w(2)_se      5-GGGATTTACCACACCA-3   NO：94   S094    215_w(2)_an      5-TGGTGTGGTAAATCCC-3   NO：95   S095    215_r1(2)_se      5-GGGATTTTTCACACCA-3   NO：96   S096    215_r1(2)_an      5-TGGTGTGAAAAATCCC-3

2.探针合成：合成表1中设计好的探针序列并进行5’端氨基和poly(T)修饰。

实施例二用于扩增HIV RT基因的引物序列的制备

利用Premier 5.0生物信息学软件，以HXB2为模板设计出表2所示的PCR扩增引物，并进行合成。

表2用于扩增HIV RT基因的引物序列

  SEQ ID   引物     序列(5’-3’)         备注  NO：97   MAW26     TTGGAAATGTGGAAAGGAAG     GAC         Nested PCR第一轮，正向

  NO：98   RT21     CTGTATTTCTGCTATTAAGTCT     TTTGATGGG   Nested PCR第一轮，反向  NO：99   pro-1     CAGAGCCAACAGCCCCACCA   Nested PCR第二轮，正向  NO：100   RT20     CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC   Nested PCR第二轮，反向  NO：101   RT-A     GTTGACTCAGATTGGTTGCAC   克隆扩增，正向  NO：102   IBR2     CAAAGGAATGGAGGTTCTTTC     TGATG   克隆扩增，反向

实施例三基因芯片的制备

利用自动生物芯片点样仪(Spotarray 72)将探针按图1所示的排布方式(A、B、C、D四个阵区探针排布完全相同)点在经过醛基化的规格为25mm×75mm×1mm(宽×长×高)的玻片上，从而制成基因芯片。

实施例四中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的操作方法

基本的方法描述如下：

在检测之前，首先得到待检样品的cDNA，然后利用针对RT基因设计的引物(如表2所示)进行PCR扩增。得到的扩增产物经纯化后利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP对纯化片段进行标记。标记产物烘干后与杂交液混匀，变性之后加在基因芯片的探针阵列上，36℃杂交16h。杂交完毕后，按照离子强度由高到低的顺序对芯片进行清洗。待芯片烘干后，利用生物芯片专用的扫描仪读取芯片上的荧光信号并利用相应的生物芯片数据分析软件分析得到的扫描结果，根据对每一个位点设计的不同探针的荧光数据的比值来确定不同位点核苷酸的种类。通过对14个位点核苷酸的判断，就可以达到对HIV进行耐药性位点突变情况检测，从而完成其耐药性检测。

以下为利用上述制备好的基因芯片检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的较佳实施例的详细说明。

1.目标片段的扩增

取1μl的质粒DNA(质粒获得方法如下：由病毒mRNA反转录，然后将以获得的cDNA为模板进行nested-PCR，将PCR产物转入T-easy，转入大肠杆菌DH5α，从中提取出质粒作为模板)加入到PCR反应体系中，PCR反应体系见表3。

表3 PCR混合体系配方

     成分      浓度     加样量(μl)     ddH₂O     10×PCR buffer     Mg²⁺     dNTP Mixture     引物1     引物2     Taq      10×      25mM      10mM      10μM      10μM      5U/μl     34.5     5     5     2     1     1     0.5

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃ 5min

72℃ 5mm

4℃  恒温

2.纯化扩增产物

将PCR扩增产物转移至纯化柱内(Amicon Microcon -PCRCentrifugal Filter devices)，加水补足体积至400μl。

室温离心6000rpm×15min，丢弃收集管。

将纯化柱转移至新的1.5ml离心管上，加15μl超纯水(MQ)，37℃温育5min。

将纯化柱倒置1.5ml离心管上，6000rpm离心2min，收集DNA。

重复步骤③、④一次。

3.标记

体系A：20μl

98℃变性10min。

立即冰浴10min。

体系B：5μl

混合体系A和B，37℃反应1小时。

65℃烘干2小时至反应液体全部蒸发。

4.预杂交

①将芯片在超纯水(MQ)中清洗2min，然后在空气中风干。

②在芯片的探针点阵旁边加35μl的预杂交液(42℃预热)，轻轻地盖上盖玻片，水平置于杂交盒中(杂交盒的底部放置一块润湿纱布)。

③将杂交盒水平放置于杂交箱中，42℃反应1小时。

④取出芯片，轻轻移去盖玻片，在超纯水(MQ)中清洗2次，每次2min。

⑤在95％乙醇中清洗1min，风干备用。

5.杂交

①向杂交仓底部加50μl超纯水(MQ)保湿，放入芯片，并将盖片置于芯片上备用。

②取12μl杂交液(36℃预热)回溶烘干的标记物，98℃加热变性10min。

③立即将加热的回溶物，通过加样孔，迅速加到芯片有探针的区域，封闭杂交仓，水平至36℃水浴锅中。

④将杂交盒水平放置于杂交箱中，36℃避光水浴16小时。

⑤杂交结束后，取出杂交盒，轻轻去除盖片，依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤1.5min，并用吹风机风干。

杂交液配方：0.5％SDS；6×SSC；5×Denhardts’s

1μg/ml poly(A)；100μg/ml鲑鱼精；50％甲酰胺；

洗液A：1×SSC；0.1％SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95％乙醇

6.扫描

用Genepix Personal4100A型生物芯片扫描仪(Axon公司)的绿色激光(532nm)和红色激光(653nm)扫描(PMT Gain为650，扫描分辨率为10μm)。扫描结果存为JPG，TIF格式的文件。

7.结果分析

利用GenePix Pro 6.0软件对扫描生成的文件进行分析，计算出每一个杂交位点的荧光强度，根据同一位点不同探针荧光强度的比值，就可以判断对应检测位点的核苷酸种类，从而确定病毒基因组中是否存在耐药性相关位点的突变，进而快速判断检测毒株是否具有耐药性以及耐药性程度。

在一较佳实施例中，一株发生耐药突变的HIV毒株的检测扫描结果如图2所示，由图2中显示的荧光探针出现的位置对照图1中标示的对应说明，可以发现该毒株在逆转录酶基因发生了突变导致其氨基酸序列发生了G190S，K101E，L74V，T215 F位点的突变，将该结果提交到http://hiv.lanl.gov，即可了解该毒株对逆转录酶抑制剂的耐药性情况，从而实现本发明的检测中国境内HIV对逆转录酶抑制剂耐药性的效果。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

           序列表

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法和检测

试剂盒

<130>5P13004-CN

<160>102

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>1

cataaagaaa aaagaca                                                   17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>2

cataaagaga aaagaca                                                   17

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>3

tgtctttttt ctttatg                                                   17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>4

tgtcttttct ctttatg                                                   17

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>5

aagaaaaaag acagtacta                                                 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>6

aagaaaaaaa acagtac ta                                                     19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>7

tagtactgtc ttttt tctt                                                     19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>8

tagtactgtt ttttttctt                                                      19

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>9

agaaaaaagg cagtacta                                                       18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>10

tagtactgcc ttttttct                                                       18

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>11

ggagaaaatt agtagat                                                        17

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>12

ggagaaaagt agtagat                                                   17

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>13

atctataat tttct cca                                                  18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>14

atctactact tttctcca                                                  18

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>15

gaaaattagt agatttcag                                                 19

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>16

aaaattaaca gatttcag                                                  18

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>17

ctgaaatcta ctaattttc                                                 19

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>18

ctgaaatctg ttaatttt                                                  18

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>19

agaaaattat tagatttca                                                 19

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>20

tgaaatctaa taattttct                                                 19

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>21

gcagagttaa aaaagaaa                                                  18

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>22

cagagttaga aaagaaaaa                                                 19

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>23

tttctttttt aactctgc                                                  18

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>24

tttttctttt ctaactctg                                                 19

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>25

cagagttaag aaagaaaaa                                                  19

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>26

tttttctttc ttaactctg                                                  19

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>27

gcagggttac aaaagaa                                                    17

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>28

ttcttttgta accctgc                                                    17

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>29

aaaaaagaaa aaatcag                                                    17

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>30

aaaaaagaac aaatcag                                                    17

<210>31

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>31

ctgatttttt ctttttt                                                    17

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>32

ctgatttgtt ctttttt                                                    17

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>33

aaaaaagaga aaatctgt                                                   18

<210>34

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>34

acagattttc tctttttt                                                   18

<210>35

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>35

aaaaagaaaa aatccgt                                                    17

<210>36

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>36

acggattttt tcttttt                                                    17

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>37

aaaaaagaat aaatctgta                                                  19

<210>38

<211>21

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>38

tacagattta ttctttttta a                                              21

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>39

aaaaatcagt aacagtactg                                                20

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>40

aaaatcagca acagtact                                                  18

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>41

cagtactgtt actgattttt                                                20

<210>42

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>42

agtactgttg ctgatttt                                                  18

<210>43

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>43

aaaaatccgt aacagtc                                                   17

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>44

gactgttacg gattttt                                                    17

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>45

aaaaatccat aacagtc                                                    17

<210>46

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>46

gactgttatg gattttt                                                    17

<210>47

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>47

aaaaatcaat aacagtcc                                                   18

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>48

ggactgttat tgattttt                                                  18

<210>49

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>49

aaaaaatcta taacagtcc                                                 19

<210>50

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>50

ggactgttat agatttttt                                                 19

<210>51

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>51

cagtaacagt cctggatg                                                   18

<210>52

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>52

cagtaacaat tctggatg                                                   18

<210>53

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>53

catccaggac tgttactg                                                   18

<210>54

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>54

catccagaat tgttactg                                                   18

<210>55

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>55

atttctcagt cccttta                                                    17

<210>56

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>56

taaagggact gagaaat                                                    17

<210>57

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>57

atttttcatt cccttta                                                   17

<210>58

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>58

taaagggaat gaaaaat                                                   17

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>59

ccagacatag ttatctatca                                                20

<210>60

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>60

gatagataac tatgtctgg                                                 19

<210>61

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>61

agacatagat atctgcca                                                  18

<210>62

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>62

gatagatatc tatgtctgg                                                 19

<210>63

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>63

ccagacatag aaatctatca                                                20

<210>64

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>64

gatagatttc tatgtctgg                                                  19

<210>65

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>65

gttatctatc aatacatgg                                                  19

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>66

tagttatctg tcaatacatg                                                 20

<210>67

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>67

ccatgtattg atagataac                                                  19

<210>68

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>68

ccatgtattg acagataa                                                   18

<210>69

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>69

atagttatca ttcaatacat                                                 20

<210>70

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>70

atgtattgaa tgataactat                                                 20

<210>71

<211>21

<212>DNA

<213> HIV病毒

<400>71

atagttatct atcaatacat g                                               21

<210>72

<211>21

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>72

catgtattga tagataacta t                                               21

<210>73

<211>21

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>73

atagttatct gtcaatacat g                                               21

<210>74

<211>21

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>74

catgtattga cagataacta t                                               21

<210>75

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>75

atgatttgta tgtaggat                                                   18

<210>76

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>76

atcctacata caaatcat                                                   18

<210>77

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>77

tgatttgtgt gtaggat                                                    17

<210>78

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>78

atcctacaca caaatca                                                    17

<210>79

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>79

atgatttgtt agtaggatc                                                  19

<210>80

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>80

tgatcctact aacaaatcat                                                 20

<210>81

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>81

gtatgtagga tctgactt                                                   18

<210>82

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>82

gtatgtagca tctgactt                                                   18

<210>83

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>83

aagtcagatc ctacatac                                                  18

<210>84

<211>18

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>84

aagtcagatg ctacatac                                                  18

<210>85

<211>19

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>85

tgtatgtaag ctctgactt                                                 19

<210>86

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>86

aagtcagagc tctacataca                                                20

<210>87

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>87

gggatttacc acaccag                                                   17

<210>88

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>88

ctggtgtggt aaatccc                                                   17

<210>89

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>89

gggatttttc acaccag                                                    17

<210>90

<211>17

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>90

ctggtgtgaa aaatccc                                                    17

<210>91

<211>15

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>91

gggatttgcc acacc                                                      15

<210>92

<211>15

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>92

ggtgtggcaa atccc                                                      15

<210>93

<211>16

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>93

gggatttacc acacca                                                     16

<210>94

<211>16

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>94

tggtgtggta aatccc                                                     16

<210>95

<211>16

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>95

gggatttttc acacca                                                     16

<210>96

<211>16

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>96

tggtgtgaaa aatccc                                                     16

<210>97

<211>23

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>97

ttggaaatgt ggaaaggaag gac                                             23

<210>98

<211>31

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>98

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g                                    31

<210>99

<211>20

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>99

cagagccaac agccccacca                                                 20

<210>100

<211>22

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>100

ctgccagttc tagctctgct tc                                              22

<210>101

<211>21

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>101

gttgactcag attggttgca c                                               21

<210>102

<211>26

<212>DNA

<213>HIV病毒

<400>102

caaaggaatg gaggttcttt ctgatg                                         26