法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-01-21
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K45/00 授权公告日:20120509 终止日期:20131208 申请日:20061208
专利权的终止
2012-05-09
授权
授权
2007-08-01
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-06-06
公开
公开
所属技术领域
一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法,属于本发明为纳米材料和生物技术领域。
背景技术
肿瘤是危害全人类的头号疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗和靶向治疗是人们一直关注和研究的内容。用于细胞生物学研究的传统荧光染料存在很多无法客服的局限性,如激发波长要求严格,荧光效率低,发射波长和激发波长容易交叠,光稳定性差,等等,给生物学研究带来了很多不便。
随着技术的发展,纳米技术的研发重心已经逐渐从单一的纳米材料的合成向功能、应用、器件化转移。其中,在纳米技术和生物技术的接口领域,量子点已经得到了良好的应用。文献中报道的量子点的制备方法多为反相微胶束法,人们多用含有Cd2+离子和S2-离子的溶液来制备CdS量子点,例如,Heesun Yang,paul HHolloway,app.phy.lett.2003,82,1965.等等。虽然是可行的,但是在反应时间以及产物的均匀度上欠佳,存在着效率和所得量子点的单分散性以及反应条件苛刻,反应物毒性等问题。由于量子点多在油相中制备,而生物环境是水相的,所以在功能化之前要对所得的量子点进行表面改性。水溶性的量子点在文献中已有报道,如Daniel R.Larson et al.Science,2003,300,1434-1436.等等。用作生物学研究的量子点要对不同种类的细胞有特异性识别功能,现有的量子点在表面功能化修饰方面不能满足这一要求,在染色过程中存在非特异性染色问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法,以提高量子点的特异性靶向功能,尽可能地降低非特异性染色的强度,适应了细胞生物学研究的需要。
一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法,应用于制备检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞,其特征在于由以下步骤组成:
(1)、CdS量子点的制备;
(2)、选择带有巯基的小分子化合物对量子点进行表面改性;
(3)、量子点表面功能化修饰:经过(2)对量子点的表面进行改性之后,用丙酮洗涤3-5遍,洗涤,离心,烘干交替进行;然后,将5mg量子点粉末分散在5-10mLPBS中,分别加入20-30μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液,搅拌30-60分钟,加入20-30μL 0.05M的叶酸的DMSO溶液,搅拌,反应12-24个小时;最后用去离子水将反应物透析5-8个小时,将未反应的小分子去除;加入20-30μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液的目的在于使体系中形成一种活性比较高的中间体,可以和随后加入的叶酸上的氨基反应。
上述CdS量子点的制备,可以采用水热法等常规方法,可以采用S的盐溶液作为S源。但如果采用H2S做为S源,即在室温下将H2S气体通入微乳液体系中,以制备量子点,可改善制备过程,使制备条件变的简单,提高产物均匀性和可控性。
如果在通入H2S气体之前,先向体系中通5-10分钟的氮气,可以排掉体系中的氧气,防止H2S气体被氧化。
如果在CdS量子点的制备过程中,控制微胶束体系中Cd盐和表面活性剂的浓度可以控制量子点的粒径。
上述方法制备的功能化量子点应用于检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞。
与现有的量子点相比,使用H2S做为S源,通入氮气排掉反应体系中的氧气,制备方便,快捷,反应装置和反应条件要求不苛刻。要想使得量子点对目标细胞进行特异性染色,本发明克服了现有技术的不足,制备的整个过程不需要苛刻的设备条件,操作安全简便,原料安全,成本低。在量子点的表面功能化修饰时,选择叶酸作为量子点表面靶向功能分子。叶酸是肿瘤细胞中代谢旺盛的主要原料之一,它与肿瘤细胞膜表面的叶酸受体特异性地结合而进入细胞参与细胞代谢,肿瘤细胞的细胞膜表面的叶酸受体水平远远高于正常细胞。故叶酸受体已作为许多治疗肿瘤的药物的靶向功能受体分子。本发明把叶酸成功地修饰到了所制备的CdS量子点的表面,使得量子点其具有特异性识别叶酸受体的功能。
附图说明
图1:细胞识别中所用的CdS量子点的透射电子显微镜的照片,粒径约5nm。
图2:量子点的紫外可见光吸收光谱。
图3:量子点在380nm的紫外激发下的荧光光谱,其519nm附近的荧光发射峰明显,正是我们探测肿瘤细胞的荧光基础。
图4:未经巯基乙酸修饰的CdS量子点的红外图谱。
图5:经过巯基乙酸修饰后的CdS量子点的红外吸收图谱(从图4和图5的吸收峰可以确定巯基乙酸成功地修饰到了量子点上)。
图6:用未经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养1个小时后的荧光照片。
图7:用未经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养3个小时后的荧光照片。
图8:用未经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养6个小时后的荧光照片。
图9:用经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养1个小时后的荧光照片。
图10:用经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养3个小时后的荧光照片。
图11:用经过叶酸修饰的量子点和HepG2共培养6个小时后的荧光照片。
具体实施方式
实施例1:
一、量子点的制备
(1)配制AOT和正庚烷的溶液
配制0.1M的AOT的正庚烷溶液30mL。
(2)反胶束体系的配置
向上述溶液中加入CdCl2的水溶液,使得水相在体系中的浓度为0.1M。加入CdCl2的水溶液之后,用超声波分散30分钟,直到体系澄清透明,这样便得到了反相微胶束体系。
(3)反应生成CdS量子点
室温下,向上述反相微胶束体系通入5分钟氮气,排除体系内的氧气,然后在磁力搅拌的情况下,向上述微胶束体系中统入充足的H2S气体。当体系颜色不再变化就说明反应完成,量子点已经成功制备。
2.巯基乙酸表面改性
将上述反应物加入丙酮进行破乳,把量子点表面的表面活性剂洗掉。用丙酮清洗、离心,反复5次。然后烘干得到量子点粉末。
向5mg半导体量子点中加入5mL的巯基乙酸,室温下磁力搅拌12小时。
3.量子点表面功能化修饰:即量子点和叶酸连接。
在上述过程中搅拌12小时后,用丙酮洗涤3遍(洗涤,离心,烘干交替进行),然后将其分散在5mLPBS中,分别加入25μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液,搅拌半个小时后,加入25μL 0.05M的叶酸的DMSO溶液,搅拌,反应12个小时。最后用去离子水将反应物透析5个小时,将未反应的小分子去除。
如图1-图5为本实施例制备的功能化量子点的粒径和表面修饰效果图,表明该方法成功地制备了高质量的量子点。
二、细胞染色实施过程及其观测
利用常规的细胞培养方法,选择HeLa、HepG2、KB细胞等表达有高水平叶酸受体(FR)的肿瘤细胞和正常的上皮细胞与上述量子点共同培养,然后用激光共聚焦显微镜观测,经过比较不同细胞种类、不同培养时间下细胞的荧光强度,确证了肿瘤细胞对量子点的特异性吸附和内化呈时间依赖性(6小时达到饱和状态)。
如图6-11为HepG2的试验结果,证实了该技术的有效性和可靠性。
实施例2:
本发明的方法最大的创造性在于,量子点表面功能化修饰(即量子点和叶酸连接)这一步骤。这一步骤为:
经过含有巯基的小分子化合物对制备的量子点进行表面之后,用丙酮洗涤3-5遍,洗涤,离心,烘干交替进行;然后,将5mg量子点粉末分散在5-10mLPBS中,分别加入20-30μL 0.05M的NHS的DMSO溶液以及同样体积的0.05M的EDC的DMSO溶液,搅拌30-60分钟,加入20-30μL 0.05M的叶酸的DMSO溶液,搅拌,反应12-24个小时。最后用去离子水将反应物透析5-8个小时,将未反应的小分子去除。
机译: 功能化量子点及其制备方法
机译: 用于制备包含过渡金属的ⅢⅤ族量子点的活化纳米团簇,使用该纳米簇的量子点及其制备方法
机译: 用离子特异性识别元件功能化的聚合物