食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法

摘要

一种食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明的优点在于：可同时检测食品中的创伤弧菌和溶藻弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法。

背景技术

目前，国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌，而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此，几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面，FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列，而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例，拟态弧菌、溶藻弧菌和河弧菌至今仍未见到过。

除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已开始关注其它致病性弧菌在食物中的存在。例如，欧共体委员会于1997年6月11日通过的368决议(97/368/EC)中明确规定：“各成员国必须使用适宜的抽样计划和检测方法对原产于中国的每批冷冻或加工的水产品进行微生物检验，以确保有关产品不存在对人类健康的危害。这种检测必须进行，特别是检测沙门氏菌属和弧菌属是否存在。”1998年和2000年我国出口到法国的鳕鱼片和出口到瑞典的水产品被检出创伤弧菌和拟态弧菌而遭取消代号处理。

目前，由于在水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌，因此，有必要研究一种方法，可同时检测多个致病性弧菌。这样，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本，以适应加入WTO后的新的形势需求，与国际方法接轨。

发明内容

本发明提供了一种食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其优点在于：可同时检测以上两种致病性弧菌，在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。

本发明所提供的食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。

本发明所提供的食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，采用溶藻弧菌的胶原酶基因(vac，DQ097161)及创伤弧菌的溶细胞素基因(vvh，AB124802)为一组检测溶藻弧菌和创伤弧菌。其优点在于：可同时检测以上两种致病性弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为本发明的引物序列表图。

图3为本发明的V.a.和V.v.的二重PCR检测结果示意图。

图4为本发明实施例一的V.a.和V.v.的二重PCR检测结果图。

图5为本发明实施例二的V.a.和V.v.的二重PCR检测结果图。

其中，图3中，1：阴性对照；2：创伤弧菌产生的582bp的条带；3：溶藻弧菌产生的210bp的条带；4：从上到下依次为创伤弧菌产生的582bp的条带和溶藻弧菌产生的210bp的条带；5：Marker(200bp-600bp)。

图4中，1：第一份面包虾，2：第二份面包虾，3：第三份面包虾，4：第四份面包虾，5：第五份面包虾，6：第六份面包虾，7：第七份面包虾，8：溶藻弧菌和创伤弧菌，9：阴性对照，10：100bp Marker

图5中，1：第一份文蛤，2：第二份文蛤，3：溶藻弧菌和创伤弧菌，4：阴性对照，5：100bp Marker。

具体实施方式

本发明所提供的食品中食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。

所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。

所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为：取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。

所述的PCR反应为二重PCR反应，其反应体系为：H₂O：13.1μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，P：(0.4*4)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl。其反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。

所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。

所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。

所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有创伤弧菌和溶藻弧菌的存在。

以下结合具体实施例子说明：

实施例一：面包虾的检测

1.无菌操作，取25g面包虾样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。

2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。

3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。

4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。

5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。

6.加样，做PCR

7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。

8.EB染色20min，漂洗，拍照。

9.分析谱图：图4中可见，在7份面包虾增菌后提取的DNA中，均出现210bp的特征条带，但也都没有出现582bp的特征条带，由此可见可见其全部含有溶藻弧菌，但没有一份含创伤弧菌。

实施例二：文蛤的检测

1.无菌操作，取25g文蛤样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。

2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。

3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。

4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。

5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。

6.加样，做PCR

7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。

8.EB染色20min，漂洗，拍照。

分析谱图：根据图5可见，在两份文蛤中，只有第二份产生了210bp的条带，说明只有第二份文蛤中含有溶藻弧菌，而且两份都不含创伤弧菌。