肠溶性多层包被益生菌微胶囊及其制备方法

摘要

一种肠溶性多层包被益生菌微胶囊及其制备方法，属于生物制剂技术领域。以海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖为微胶囊包被材料，以乳酸菌或双歧杆菌为囊芯物，利用海藻酸钠与氯化钙发生离子交换形成海藻酸钙包被，再利用海藻酸钙与壳聚糖等电点不同使壳聚糖在海藻酸钙表面形成二次包被，低温冷冻干燥后制成多层包被益生菌微胶囊。本发明利用海藻酸钙耐酸性及壳聚糖肠道吸附性原理使微胶囊多层包被益生菌达到长期保存并能在肠道定位释放的效果。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种微生物制剂，具体涉及一种肠溶性多层包被益生菌微胶囊及其制备方法。

二、背景技术

微生物制剂作为一种天然的生物活性制剂无毒、无抗药性、无残留，并具有增强免疫、促进生长、提高饲料利用率的功效，已被广泛应用于人类保健食品，并可作为饲料添加剂应用于畜牧养殖和水产动物的养殖中。参见2006年7月12日公开的中国专利申请200510045358.7，“多功能益生菌制剂及其制备方法”。

益生菌制剂主要是活菌制剂，大多是专性厌氧菌，其中的乳酸菌及双歧杆菌为一类厌氧菌，在空气中、干燥或室温条件下很难存活，使其产品的保质期缩短。同时乳酸菌及双歧杆菌被人或动物食入后，在人或动物胃内不能耐受胃部酸性环境(pH值1～2)，导致益生菌死亡不能达到所需益生效果。

CN1613455公开了一种靶向益生菌微胶囊，该微胶囊是由益生菌和/或保护剂以及三层保护层组成，其中第一层保护层为采用转谷氨酰胺酶交联后的蛋白质将益生菌包埋形成初级微胶囊；第二层保护层为将初级微胶囊与适当的稀释剂混合后，用熔点在30-40℃的氢化油脂包覆形成次级微胶囊；第三层保护层为控释包衣材料。该方法的不足之处是：包被工艺复杂，操作时间长；在操作过程中，益生菌长时间与空气接触或操作过程中温度偏高或变化过快，造成菌体容易失活；且部分包被材料对菌体活性有一定影响，不易长期保存。

三、发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种肠溶性多层包被益生菌微胶囊及其制备方法。

本发明的肠溶性多层包被益生菌微胶囊，以乳酸菌或双歧杆菌为囊芯物，海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖为微胶囊包被材料，包被材料中海藻酸盐是由β-1，4-D型甘露糖醛酸(M)和α-1，4-L型古罗糖醛酸(G)共聚而成。在Ca2⁺溶液中形成凝胶利用海藻酸钠与氯化钙发生离子交换形成海藻酸钙包被，它在海藻酸盐(带负电荷)周围形成一层半透膜，利用海藻酸钙与壳聚糖等电点不同使壳聚糖在海藻酸钙表面形成二次包被，低温冷冻干燥制成。

上述益生菌微胶囊颗粒直径在10～100μm。

本发明的包被材料中海藻酸钙具有良好的耐酸性，壳聚糖是一种带正电荷的聚合物，能与带负电荷的肠道上皮细胞互相结合因此具有良好的肠道吸附性，所得多层包被益生菌微胶囊能长期保存并能在肠道定位释放的效果。可用于人的保健食品或动物饲料添加剂。

本发明的肠溶性多层包被益生菌微胶囊的制备方法，步骤如下：

1.将乳酸菌或双歧杆菌发酵液离心收集湿菌体，将湿菌体用生理盐水或者pH值6.8的磷酸缓冲液洗出为菌悬液。

2.将所得湿菌体的菌悬液按体积比1∶5～10加入到1～2％wt的海藻酸钠溶液中混匀，得海藻酸钠菌体混悬液。

3.将海藻酸钠菌体混悬液制成微液滴，加入到2～4％wt的氯化钙溶液中搅拌，微液滴与氯化钙溶液体积比1∶1～2，得到包被海藻酸钙的微囊颗粒。

4.离心收集微囊颗粒，加入到1～2％wt的壳聚糖溶液中进行二次包被。微囊颗粒与壳聚糖溶液体积比1∶1～1.5。

5.离心收集微囊颗粒，冷冻干燥，得肠溶性多层包被益生菌微胶囊。

本发明的方法在常温下进行，操作简单，所选用包被材料都是食用安全对人体无害的天然有机物质，最外层包被材料壳寡糖具有提高免疫，抑制癌肿细胞生长，促进肝脾抗体形成，促进钙及矿物质的吸收，促进双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群增殖，降血脂、降血压、降血糖、调节胆固醇，减肥，预防成人疾病等功能。本发明的包被方法不用调节酸碱度，也不必使用固定剂(如甲醛等有害物质)。

本发明的方法操作时间短，使菌体在空气中暴露时间短，包被材料对菌体无害并且食用安全；包被后的微囊进行低温冷冻干燥，可延长益生菌的保存时间，冷冻干燥后的产品在2～8℃的条件下可保存5～10年，室温条件下可保存2年以上。

本发明通过制备肠溶性微胶囊，使乳酸菌或双歧杆菌包裹于微囊中，隔绝空气同时可耐受胃部酸性环境。由于微囊材料的等电点与肠道上皮细胞的等电点相反，可使微胶囊吸附于肠上皮表面，并且微胶囊可溶于肠液，达到定位释放的作用，使乳酸菌或双歧杆菌能够到达适宜定植的位置生长繁殖，起到益生效果。

四、具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1：

(1)将海藻酸钠配成2％溶液100ml，配制4％氯化钙溶液100ml，配制1％wt壳聚糖溶液100ml。

(2)将500ml乳酸菌发酵液离心收集湿菌体，将湿菌体混悬于10ml生理盐水中。

(3)将湿菌体的混悬液加入上述海藻酸钠溶液中混匀，得海藻酸钠菌体混悬液。

(4)将海藻酸钠菌体混悬液制成微液滴，加入上述氯化钙溶液中搅拌，得到海藻酸钙微囊颗粒。

(5)离心收集微囊颗粒，加入到上述1％wt壳聚糖溶液中进行二次包被。

(6)离心收集多层包被的微囊颗粒，冷冻干燥。

(7)干燥后的微胶囊颗粒直径在10～100μm。

对本实施例的微胶囊按如下方法检验：

1、取0.1g冻干的微胶囊颗粒两份，分别进行胃溶性试验及肠溶性试验并将活菌计数。

2、配制人工胃液：盐酸16.4mL，胃蛋白酶10g，加水搅匀后定容至1000mL，pH＝1.2。人工肠液：磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g加水适量使其溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL。

3、取微胶囊0.1g置于盛有50mL、pH1.2人工胃液的三角瓶中，再置于(37±1)℃恒温、转速为150r/min的摇床上，微胶囊在人工胃液中透光率的变化情况。微胶囊与胃液接触3h，处理液中透光率基本保持不变，因此可以证明益生菌微胶囊能够耐受胃液的破坏。

4、取微胶囊0.1g置于盛有50mL、pH6.8人工肠液的三角瓶中，再置于(37±1)℃恒温、转速为150r/min的摇床上，在45min后微胶囊已完全崩解，由此判断微胶囊能在模拟肠环境中45min内释放益生菌。

5、将崩解后的的菌悬液进行平板倾注厌氧培养法活菌计数，冻干后的微胶囊平均含活菌1～2×10¹⁰CFU/mL。

实施例2：

将500ml双歧杆菌发酵液离心收集湿菌体，用pH值6.8的磷酸缓冲液稀释至10ml。将所得湿菌体混悬液加入到100ml的2％海藻酸钠溶液中混匀，得海藻酸钠菌体混悬液。将海藻酸钠菌体混悬液制成微液滴，加入到100ml 3％的氯化钙溶液中搅拌，得到包被海藻酸钙的微囊颗粒。

离心收集上述微囊颗粒，再加入到100ml的2％的壳聚糖溶液中进行二次包被。

离心收集上述微囊颗粒，冷冻干燥，干燥后的微胶囊颗粒直径在10～100μm。得肠溶性多层包被益生菌微胶囊。