一种双份反义蜡质基因的表达载体及其制法和用途

摘要

本发明公开了一种双份反义蜡质基因的表达载体及其制法和用途，具有摘要附图中(d)所示的结构和特征。包括启动子、目标基因的反义DNA片段、终止子和内切酶敏感序列或者标记基因序列，且为同一方向排列的双份拷贝。可应用于转化禾本科植物如水稻，获得不含抗性选择标记基因的低直链淀粉含量的新型水稻品种。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地涉及植物基因工程领域。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的提高和对外贸易的开拓，稻米食味品质已日益引起人们的关注，如今稻米食味品质改良研究已成为水稻品质研究中的热点。据文献报道，在影响稻米食味品质中，稻米直链淀粉含量是一项最重要的指标(李秀兰等，中国农学通报，2002，18(3)：61-64，119；张小明等，中国水稻科学，2002，16(2)：157-161；罗志祥等，中国农学通报，2002，18(6)：18-21)。直链淀粉含量越高的稻米，食味越差；低直链淀粉含量的米煮饭胀性小，食味相对较好。

如今世界上正在兴起的一种新型稻米----软米的研究(宣文敏，农业与技术，2002(3)：67-69，74)。软米的米质界于糯性与粘性之间。天然软米最大的特点是稻米直链淀粉含量较低，一般小于10％(赵则胜等，中国特种稻，上海科学技术出版社，1995：49；宋文昌等，特种稻栽培与利用，科学出版社，1997：11-12)，这样的软米是制作饭团等快餐食品的原料。

水稻稻米中的直链淀粉是由编码“结合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的蜡质基因(Waxy)催化合成的(Okagaki等，Genetics，1988，120：1137-1143)。目前已有报道表明导入蜡质基因(Waxy)反义片段能够有效降低稻米直链淀粉含量(Shimada H，et al，Theor ApplGenet，1993，86(6)：665-672；Terada R，et al，Plant Cell Physiol，2000，41(7)：881-888；王新其等，上海农业学报，2002，18(增刊)：69-73；陈秀花等，科学通报，2002，47(9)：684-688；刘巧泉等，Transgenic Res，2003，12：71-82；李建粤等，科学通报，2004，49(24)：2556-2561；沈革志等，植物生理与分子生物学学报，2004，30(6)：637-643)。

尽管已有较多关于利用反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量的报道，但是分析这些已有的报道，所有的转基因后代中，稻米直链淀粉含量低于10％的后代或稻米直链淀粉含量明显降低后代的比例都较低。这是由于目前人们使用的转化载体都是将一份蜡质基因反义片段构建在一个T-DNA区段上(图1)，利用含有这些载体的根癌农杆菌介导转化水稻获得的转基因后代，往往是单拷贝整合的后代比多拷贝整合的后代数量多。

李建粤等的研究表明，采用p13W4载体转化获得双拷贝整合的植株T1代种子糙米直链淀粉含量平均为6.8％，至T4代纯合转基因后代的稻米直链淀粉含量仍然能够稳定在小于10％的范围内。

另一方面，随着商业化植物转基因品种的不断出现，基因工程食品的安全性问题越来越引起人们的关注。基因工程食品安全性问题主要是由于耐抗生素或耐除草剂等抗性选择标记基因存留于转基因植物中产生的，所以，获得不带有抗性选择标记基因的表达载体进行转基因操作，对于转基因作物的推广应用极为重要。采用共转化法能够解决这一问题。目前已有报道将分别含有抗性选择标记基因与gus报告基因载体和只含有一份反义蜡质基因载体(p13W8)的根癌农杆菌共转化水稻，可以培育出无抗性选择标记基因而稻米直链淀粉含量比对照降低的转基因后代(李建粤等，科学通报，2004，49(24)：2556-2561)。

然而，利用根癌农杆菌介导的共转化法培育转基因后代，获得双拷贝转基因植株的概率比较小，而且即便获得双拷贝整合的转基因植株，由于两个拷贝整合在水稻基因组的不同位点，筛选两个T-DNA整合位点都纯合的转基因后代也比较困难。

故为了更有效地利用共转化法将反义蜡质基因导入水稻培育无抗性选择标记基因而稻米直链淀粉含量又能够明显降低的特种水稻，需要构建在一个可使转化子更容易得到含有双份反义蜡质基因的表达载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种双份反义蜡质基因的表达载体及其制法和用途，以克服现有的表达载体含有抗性选择标记基因或含有来自于病毒的启动子，不利于基因工程植物的安全性控制；及只含有一份反义蜡质基因，获得的转化子及其后代的相关基因表达降低不显著、难以获得两个T-DNA整合位点都纯合的转化子的缺陷。

技术方案

本发明的第一个方面是提供一种双份反义基因的表达载体，包括如下序列：

(1)启动子；

(2)目标基因的部分或者全部反义DNA片段；

(3)终止子；

(4)内切酶敏感序列或者标记基因序列；

其中，序列(1)、(2)和(3)均为双份。

上述的双份反义基因的表达载体，其中的双份序列的顺序为同一方向排列的(1)、(2)、(3)和(1)、(2)、(3)。

本发明提供的双份反义蜡质基因的表达载体的一种特例为，所说的目标基因为编码淀粉合成酶的蜡质基因。

本发明提供的双份反义蜡质基因的表达载体的另一种优选方案为，所说的启动子为水稻蜡质基因的启动子，终止子为CaMV 35S基因终止子。

本发明提供的双份反义蜡质基因的表达载体的又一种优选方案为，在启动子下游还有内含子。

本发明的双份反义蜡质基因的表达载体中不带有抗性选择标记基因，如耐抗生素或耐除草剂基因，也不含有来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子。

本发明的第二个方面是提供双份反义蜡质基因的表达载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用PCR方法扩增获得蜡质基因启动子和蜡质基因反义DNA片段；

(2)将含蜡质基因启动子和蜡质基因反义DNA的PCR产物与终止子和其他载体序列连接，得到中间载体；

(3)设计一对引物，分别与终止子下游和蜡质基因启动子上游配对，以中间载体为模板进行扩增；

(4)将PCR扩增产物插入中间载体的蜡质基因启动子上游和T-DNA右边界之间构建成双份反义蜡质基因载体。

上述的双份反义蜡质基因的表达载体的制备方法的一种特例为，步骤(1)所说的采用PCR方法扩增获得的蜡质基因启动子和蜡质基因反义DNA片段之间还有第一内含子片段。

上述的双份反义蜡质基因的表达载体的制备方法的另一种特例为，步骤(4)所说的PCR扩增产物插入中间载体的蜡质基因启动子上游和T-DNA右边界之间的多克隆位点中的限制性内切酶位点。该内切酶位点可以是KpnI。

上述的双份反义蜡质基因的表达载体的制备方法的一种特例为，所说的步骤(2)将含蜡质基因启动子及第一内含子和蜡质基因反义DNA的PCR产物与终止子和其他载体序列连接这一步骤是通过以PCR产物替代载体中的抗性基因及其启动子来实现的。

本发明的第三个方面是提供双份反义蜡质基因的表达载体的应用，包括以所说的表达载体转化禾本科植物；还包括以所说的表达载体转化水稻、小麦、大麦、玉米、高粱或者青稞。

上述的双份反义蜡质基因的表达载体的应用的一种特别方案为，以双份反义蜡质基因的表达载体转化水稻获得低直链淀粉水稻。

本发明双份反义蜡质基因的表达载体转化稻米直链淀粉含量约为15％的水稻获得的新品种，其稻米的直链淀粉含量小于10％。

本发明提供的双份的目标基因为编码淀粉合成酶的蜡质基因部分反义DNA的表达载体，只是一种特例，所说的目标基因还可以是储藏蛋白、植物激素、抗性蛋白、热激蛋白或者支链淀粉的合成或者调解过程中的功能基因。

有益效果

(1)现有技术降低水稻稻米直链淀粉含量，都是利用反义蜡质基因p13W4或p13W8两种单份反义蜡质基因载体(图1)。本发明提供的双份反义蜡质基因的表达载体，带有同方向排列的两个拷贝的完整的启动子、目标基因的部分反义DNA片段和终止子(图3)，可以比单份反义蜡纸基因载体更加有效地降低水稻稻米的直链淀粉的表达。

(2)p13W4或p13W8两种载体都是将一份蜡质基因反义片段构建在一个T-DNA区段上，转化水稻后获得的稻米，其所有转基因后代中，单拷贝整合的后代比多拷贝整合的后代数量多，造成后代的稻米直链淀粉含量低于10％范围的比例都较低，本发明在一个T-DNA区段上构建的双份反义蜡质基因可使转基因后代中保持高比例的低直链淀粉稻米。

(3)目前在利用共转化法将分别含有抗性选择标记基因载体和只含有反义蜡质基因载体(p13W8，图1b)转化水稻，可以培育出直链淀粉含量比对照降低的转基因后代，但获得双拷贝转基因植株的概率比较小，而且即便获得双拷贝整合的转基因植株，由于两个拷贝整合在水稻基因组的不同位点，筛选两个T-DNA整合位点都纯合的转基因后代也比较困难。本发明提供的双份反义蜡质基因载体可以有效地获得双份反义蜡质基因整合的转基因植株，且双份反义蜡质基因整合在水稻基因组的同一染色体，并且呈紧密连锁，便于筛选纯合子。

(4)本发明提供的双份反义蜡质基因的表达载体不带有耐抗生素或耐除草剂等抗性选择标记基因，在育种过程中避免了基因工程食品安全性问题的困扰，对于转基因作物的推广应用极为重要。

本文所用的术语“蜡质基因(Waxy)”是指编码“结合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的基因。

本文所用的术语“PCR方法”是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。

本文所用的术语“CaMV 35S基因终止子”是指来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子。

本文所用的术语“中间载体”是指在目标载体制备过程中获得的载体。

本文所用的术语“T-DNA”是指根癌农杆菌Ti质粒基因组中可转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。

附图说明

图1是两种能够用于降低稻米直链淀粉含量的载体p13W4(a)和p13W8(b)T-DNA区的结构图。图中，232Wx-pro、232INT.l：水稻232Waxy基因的启动子和第一内含子；Wx frag：水稻232Waxy基因的反义DNA片段(756bp)；LB、RB：T-DNA的左右边界；Nos-ter：Nos基因终止子；35S-pro、35S-ter：CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt：潮霉素抗性基因；gus：β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh：XhoI；E：EcoRI；Sa：SacI；B：BamHI；X：XbaI；S：SalI；P：PstI；H：HindIII。

图2是无抗性标记的单份反义蜡质基因中间载体p13AW-1(c)T-DNA区的结构图。图中，Wx-pro、Int.l：水稻Waxy基因的启动子和第一内含子；Wx frag：水稻Waxy基因的反义DNA片段；LB、RB：T-DNA的左右边界；Terminator：基因终止子；Xh：XhoI；E：EcoRI；B：BamHI；K：kpnI；P：PstI。

图3是无抗性标记的双份反义蜡质基因载体p13AW-2(d)T-DNA区的结构图。图中，Wx-pro、Int.l：水稻Waxy基因的启动子和第一内含子；Wx frag：水稻Waxy基因的反义DNA片段；LB、RB：T-DNA的左右边界；Terminator：基因终止子。

图4是pCAMBIA1300质粒T-DNA区的结构图。图中，LB、RB：T-DNA的左右边界；35S-pro、35S-ter：CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt：潮霉素抗性基因；Xh：XhoI；Bs：BstXI；E：EcoRI；Sa：SacI；K：KpnI；S：SmaI；B：BamHI；X：XbaI；Sal：SalI；P：PstI；H：HindIII。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例是为了说明构建双份反义基因的表达载体的方法及所获载体的结构组成。

构建该表达载体操作中涉及的常规PCR扩增、限制性内切酶酶切和连接等方法主要参考《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1992)。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

从已公开的日本晴水稻基因组中查找一个在BamHI酶切位点两端长度大约为100bp核苷酸序列中没有SmaI和XhoI酶切位点的DNA序列，并根据该序列设计引物，引物两端各携带有SmaI酶切位点和XhoI酶切位点。利用常规PCR从日本晴水稻总DNA中扩增该序列，将PCR产物与T载体连接获得T-1载体，并转化感受态大肠杆菌。利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测T-1载体。

从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因启动子核苷酸序列，参照该序列在距离翻译起始点ATG上游约2.6kb处和翻译起始点ATG前分别设计引物，在设计的引物两端各携带有SmaI酶切位点和BamHI酶切位点。利用常规PCR从9311籼型水稻总DNA中扩增获得约2.6kb蜡质基因启动子和第一内含子，将PCR产物与T载体连接获得T-2载体，并转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测T-2载体。

再从公开号为CN1298021A专利说明书上查找232籼型水稻蜡质基因核苷酸序列，参照该序列在第2333位碱基至3087位碱基两端各设计一对PCR引物，同时在上游引物引入XhoI和下游引物引入BamHI酶切位点。利用常规PCR从9311籼型水稻的总DNA中扩增获得约0.750kb部分蜡质基因片段，将PCR产物与T载体连接获得T-3载体，也转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测T-3载体。

从大肠杆菌中分别提取T-1和T-2载体，利用SmaI和BamHI两种限制性内切酶消化T-1和T-2载体，电泳回收T-1载体双酶切后的大片段和T-2载体酶切后的小片段，利用T₄连接酶完成连接过程，获得T-4载体。

用BamHI和XhoI对T-3和T-4载体进行双酶切，电泳回收T-3的小片段和T-4的大片段，将这两个回收的大小片段进行连接获得T-5载体，转化感受态大肠杆菌。再利用SmaI和XhoI对T-5载体进行双酶切，电泳回收含有蜡质基因启动子、第一内含子和蜡质基因部分反义片段的大片段DNA。

利用Bst XI酶消化pCAMBIA1300质粒(图4，来自于中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员)后采用T₄DNA聚合酶补平粘性末端，再采用XhoI酶消化补平后的线形pCAMBIA1300 DNA，琼脂糖凝胶电泳有三个DNA片段，回收最大的片段。将该片段与如上T-5载体SmaI和XhoI双酶切电泳回收的大片段进行连接，形成中间载体p13AW-1(图2c)。

根据pCAMBIA1300序列，在p13AW-1的终止子下游和蜡质基因启动子上游，各设计一个引物，两个引物都引入KpnI酶切位点，以p13AW-1中间载体为模板进行扩增，将PCR产物与T载体连接获得T-6载体，也转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR、测序等常规方法检测T-6载体。用KpnI分别酶切T-6和p13AWY-1载体，将T-6电泳回收的大片段插入p13AW-1上蜡质基因启动子上游多克隆位点中的KpnI位点，构建成p13AW-2载体(图3d)。如上两种表达载体中的蜡质基因反义片段长度大约为0.75kb，位于蜡质基因反义片段前的启动子及第一内含子DNA长度约为2.6kb。

实施例2

本实施例是为了说明如何利用构建的双份反义蜡质基因的表达载体转化水稻。

在培育转基因水稻中涉及的根癌农杆菌培养、水稻转化及抗性愈伤组织筛选及植株再生主要参照刘巧泉的方法进行(刘巧泉等，植物生理学报，1998，24(3)：259-271)。

利用根癌农杆菌介导的共转化法(李建粤等，科学通报，2004，49(24)：2556-2561)将p13AW-2表达载体导入上师大2号或超2-10等稻米直链淀粉含量大约为15％水稻品系或品种，即可获得无抗性选择标记基因的、能够在长江中下游地区种植的、低直链淀粉含量的新型种质。