对镍和铜的亲和力下降了的改良血清白蛋白

摘要

本发明提供了一种改良的血清白蛋白，其在n－末端区域或结合区(VI)进行了修饰，诸如通过在n－末端截取至少一个氨基酸而获得，由此其降低或消除了对痕量金属诸如镍和/或铜的结合。另一适宜的对此结合区的修饰包括突变，诸如延长或插入，其可足以破坏在此位点最多的痕量金属的结合。本发明经修饰的白蛋白是有利的，这在于其降低或消除了对痕量金属的结合，伴随着在使用白蛋白组合物的人体中由痕量金属引起的过敏反应的可能性的降低或消除，本发明经修饰的白蛋白将比未修饰的白蛋白可更加安全有效的使用。

说明书

发明领域

本发明主要涉及可用作血容量膨胀剂的改良血清白蛋白，且尤其涉及重组或是改良血清白蛋白，这些经过诸如在其n-末端区域进行切除、延伸、或插入的变异的，并在金属结合性质上有所改善，且对于金属元素，诸如镍和铜的亲和力有所下降的血清白蛋白可以在各种应用中，包括用作用于赋形剂和培养介质的血容量膨胀剂、或广泛的用作正常的使用未改良形式的白蛋白产品，包括药物、化妆品、乳制品和食品强化剂，或相关产品的补充剂或替代物的应用中安全的使用并生效。

发明背景

血清白蛋白属于多基因(multigene family)族蛋白质，包括α-胎儿球蛋白和人类种群专效组分，同样所知的还有维生素-D结合蛋白。多基因族的成员典型的由相对较大的多畴蛋白(multi-domain)组成，且这些血清白蛋白多数是循环系统的可溶蛋白，并参与多项与生命有关的生理过程。血清白蛋白占全血成分干重量的大约50％，其对于维持80％的胶质渗透血压起作用，并对控制血液的生理pH起着主要作用。

白蛋白及相关血蛋白同样在人体内的多种内源和外源性配体，包括各种化学上不同的分子，包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、钙、诸如铜和锌的金属；及各种药学试剂的传输、分布和代谢中起着非常重要的作用。白蛋白类分子被认为可促进多种上述配体穿透器官-循环界面，诸如肝脏、肠、肾脏和大脑；研究显示存在着一种白蛋白细胞表面受体。参见，如Schnitzer等人，P.N.A.S.85：6773(1988)。因此白蛋白广泛的与循环和代谢功能密切相关。

人血清白蛋白(HSA)是一种约为66,500kD的蛋白质，并由包括至少17个二硫化物桥的585个氨基酸组成。人血清白蛋白与其他许多白蛋白一起，在人的生理学上起着特别重要的作用，并确实存在于每一人体组织和体内分泌物中。如上所述，HSA具有结合并传递广谱的配体而使其通过循环系统，其中包括在循环血浆中反而不溶的长链脂肪酸。白蛋白的原子结构和关于其的结合亲和力的特殊详情以及对这些结合性质起首要作用的特定区域已经事先确定；如在美国专利申请08/448,196，1993年5月25日申请，现为美国专利号5,780,594以及美国专利申请08/984,176，1997年12月3日申请，现为美国专利号5,948,609,中所阐述的，这两篇文献都通过在此引证而全部合并于本文。

除人血清白蛋白之外，还对各种动物的白蛋白进行了研究，人们确认：在所知的许多动物，诸如牛、大鼠和人血清白蛋白的白蛋白序列中，超过60％的氨基酸序列是守恒的。而且，由于越来越多的从动物中获得的白蛋白得到测序，人们发现从大部分脊椎动物种，包括绵羊、青蛙、大麻哈鱼、小鼠、猪甚至海七鳃鳗中得到的白蛋白的序列有不同程度的同源性，并且都具有在人血清白蛋白中观察到的特征性的二硫化物桥的重复模式，由此，它们都隐含着共同的三级结构。进而，所有那些序列得到了确定的白蛋白多基因类物质显示具有内部序列的同源性(从2-至7倍)，这不仅表明这些蛋白质是从相同的原始组蛋白中进化而来的，还反馈影响了此蛋白质的生命本能和功能。参见，如Carter等人，科学244：1195(1989)。

由于白蛋白类起作用的生命规律的原因，毫不夸张的说，血清白蛋白有千种的应用，而且其相关蛋白质涵盖了广泛的生理学情况，其中使用最频繁的是自然血清白蛋白。然而，和血红蛋白等血液蛋白不同，自然血清白蛋白在氧的运输系统中是不起作用的，因此其在需要运输氧的血液更新系统中是无用的。近来，发明了一种可作为血容量膨胀剂使用的以氧-运输白蛋白为基础的血液更新组合物，其公开于美国专利号5,948,609之中，该篇文献通过在此引证而全部合并于本文，此组合物进一步的提高了血清白蛋白的重要性和有用性。

此外，在涉及到白蛋白的应用中，人们公知的要使用原型人血清白蛋白序列或者主要的异型人血清白蛋白序列，包括熟知的n-末端氨基酸序列n-DAHK-c。参见如，Carter等人，蛋白质化学进展(Advances in Protein Chemistry)，Vol.45，153-203(1994)和Peters的“白蛋白祥述(All about albuin)”，Academic出版社(1995)。铜和镍对白蛋白的n-末端肽的结合情况是公知的并且已经被研究多年，且此位置在Carter等人，(1994)的著作中被指为是功能性的结合位点VI。X-X-组氨酸的序列显示为是铜和镍金属在此位点结合的关键，其它重要的是n-末端多肽的结构上的弹性，其不能在结构上造成阻碍。

在生理学pH点上，铜对此位点有非常强的亲和力(Ka＝1.6×10¹⁶M^-1)(参见Camerman等人，Can.J.Chem.，第54卷：1309-1316(1976))，可能是据报道的配体对血清白蛋白的最高结合常数。通过比较，镍的结合的Ka＝3×10⁵M^-1。参见Lau等人，生物化学杂志第249卷：5878-5884(1974)。当白蛋白分子的特点是用于保护身体避免金属的潜在的伤害性影响，尤其是铜、镍混合物与白蛋白结合公知的会在某些人体上会引起过敏反应，这将导致其后摄入Ni(II)或承受镀镍珠宝或相似的状况。例如，由于镍结合而导致的一种职业性哮喘是公知的，且被认为是由抗Ni(II)的抗体，尤其必定为人血清白蛋白n-末端造成的。参见Carter等人，(1994)，supra和Nieboer等人，Br.J.Ind.Med.，第41卷：56-63(1984)。

在正常的白蛋白和其它蛋白质的重组产物过程中，通常有某些金属，包括镍和铜的给定浓度，其作为培养介质的组分并且用于白蛋白的生产中。因此，显著水平的镍、铜和/或其它金属在白蛋白的生产中将被螯合在白蛋白的n-末端肽上，其可通过将人血清白蛋白染色成绿色和黄色而证明。但是，这些金属的存在，即使是痕量级的，在通过重组方法制备白蛋白的过程中，可将导致显著的上文所述的健康问题。

人们急切的需要制备一种安全且有效的血清白蛋白产品用于多种应用中，尤其是涉及用于人类内用或外用，可降低或消除白蛋白对铜和镍和/或其它金属的高亲和力，从而降低了以潜在白蛋白为基础的产品对用白蛋白组合物进行治疗的且体内结合有金属的人类或动物产生过敏反应的危险。

发明概述

相应的，本发明的目的是为了提供一种新的、对痕量金属诸如镍和/或铜的亲和力下降或消失了的血清白蛋白组合物。

本发明的进一步的目标是提供一种新型的对痕量金属的亲和力下降了的改良血清白蛋白，其可用于各种应用，包括作为血液代用产品、化妆的、医学的或药学的添加剂。

本发明的进一步的目标是提供一种新型的具有改良的澄明度的血清白蛋白产品从而能更好的在涉及光谱学的科学应用中使用。

本发明的更进一步的目标是提供一种以新型的血清白蛋白为基础的血液代用产品，其不仅具有各种可用的生理学功能，包括运输氧和扩充血容量，还可以被安全的用于人类和动物，并且降低或解除了对痕量金属诸如镍和/或铜的亲和力，从而能极大的降低导致过敏反应或其它有害状况的危险。

本发明的上述和其它目的可通过本发明提供一种改良的血清白蛋白的优点而实现，此血清白蛋白都在其n-末端切除了至少已和氨基酸，或者通过同样的方法进行变异以破坏血清白蛋白原有的被视为结合位点VI的金属结合点。这些对结合点的改变和变异包括延长、插入或其它对n-末端，诸如对组氨酸的氨基酸位置3所作的改变，这些改变足以对位点VI产生空间位阻或者消除主要的结合作用，由此降低此区域对金属，诸如镍和/或铜的亲和力。通过重组或其它适宜的物理或化学方法进行修饰的结果，所得的血清白蛋白组合物将大大的降低或完全消除其对痕量金属的结合，由此可以安全并有效的用于各种应用之中，包括血液产品、化妆品、药物、药物添加剂；或者多种其它需要用到白蛋白组合物的应用。

本发明的上述和其它特点在下文优选的实施方式的发明详述中阐述，或者将显见于这些详述中。

附图说明

本发明将参照其优选的实施方式进行详细描述，这些实施方式将与附图一同进行说明：

图1是对人血清白蛋白的结构的观察，其图示了由晶体学确定的结合区域。

图2对血清白蛋白的摄影观察，其按照本发明进行了变异(左侧)，并且与未改良的血清白蛋白(右侧)相比，基本上不含痕量金属，而未改良的血清白蛋白比本发明经修饰的血清白蛋白含有更高的痕量金属诸如镍和铜。

发明详述

根据本发明，提供了一种经修饰的人血清白蛋白，其在结合点VI上或者在n-末端区域进行了修饰，以降低或消除对痕量金属诸如镍和/或铜的亲和力。对人血清白蛋白晶体的作概略的结晶学观测，显示的某些白蛋白结合区域，包括结合区VI示于图1中。通过人血清白蛋白，可以理解其能对血清白蛋白蛋白质、或任一其它的与人血清白蛋白相似方法运作的并在结合位点具有相似性质的血清白蛋白蛋白质起指示作用。相应的，任一的与结合区IV相比具有足够相似度的血清白蛋白，如包括牛血清白蛋白(BSA)的其它血清白蛋白，根据本发明也是有用的。此外，当其它的含有人血清白蛋白结合区VI、或者等价于此区域且具有相似性质的肽类、片断、或亚单元同样也在本发明的范围之内，因为这些片断或亚单元可以分离并以与含有这些结合区域的自然白蛋白相似的方式运作。这些含有结合区VI的肽类、片断或其它白蛋白的亚单元白蛋白可以按照此处详述的方式在需要降低或消除的应用中降低或消除不希望的与痕量金属诸如镍或铜的结合。人血清白蛋白中的结合区VI位于n-末端区域，其包括1-3个氨基酸残基链，其序列为Asp-Ala-His。

根据本发明的一项优选的实施方式，可使亲和力降低的一种修饰方法可以通过在血清白蛋白的n端截去至少一个氨基酸而使其对痕量金属的亲和力降低。在一特别优选的实施方式中，截去操作包括从血清白蛋白的n-末端除去一个氨基酸，可足以降低或消除与痕量金属的结合而对白蛋白及其正常的性质不产生影响。然而，尽管截去单个氨基酸可以降低金属亲和力，从氨基酸的n-末端截去多个氨基酸也能降低白蛋白对痕量金属的亲和力。

类似的，其它改变白蛋白n-末端的修饰在降低或消除其对痕量金属的亲和力中也是适宜的。例如，这种修饰可以是延长或插入适宜的氨基酸以改变n-末端区域的性质并使得结合点区域VI非常不易于结合和/或保留痕量金属。任何在n-末端区或在结合区VI的延长或插入，足以造成结合点VI的空间位阻或消除在此区域的结合作用，是适于在本发明中使用的，并能对白蛋白与包括镍和铜的痕量金属的结合提供必要的阻碍作用。尽管各种不同长短的氨基酸序列可用于本发明，延长或插入具有1至10个氨基酸的肽类通常是较优选的。

根据本发明，优选得到一种截去或缺失了特定的在n-末端的三个易蜷曲残基(称作Asp-Ala-His残基)的白蛋白，此残基原本连接在序列Lys-Ser-Glu的n-末端区域。在本发明一特别优选的实施方案中，所需的白蛋白序列仅截去了一个氨基酸，即从n-末端除去了Asp残基，从而得到序列Ala-His-Lys-Ser-Glu……。此具体实施方式是特别优选的，因为其似乎很少产生抗原应答从而显著的降低痕量金属在n-末端的结合。类似的，缺失或截去大于一个氨基酸长度的尺寸也是本发明可适用的并能获得一种不易对诸如铜和镍金属结合的改良白蛋白。相应的，在三个可蜷曲残基区域的n-末端删去其它的n端也是适用于本发明的，由此n-末端序列，诸如His-Lys-Ser-Glu……和Lys-Ser-Glu……也可用在本发明经修饰的白蛋白中。此外，任一进一步的截去n-末端都是有效的，因此对结合点VI造成空间位阻或者在此区域消除生理学上的结合反应都是适宜用作本发明的经修饰的白蛋白。

此外，其它本发明适宜的形式包括在n-末端区域或结合点VI处添加或替代氨基酸序列而足以破坏痕量金属诸如铜和镍对白蛋白的结合，既可以通过提供足够的位阻以阻止金属结合，也可以通过破坏或消除生理学上的结合反应来实施。例如，在n-末端序列Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu……上任一适宜的前导序列或其它的延伸都可用于得到本发明的经修饰的白蛋白。

进而，在本发明的另一个优选的实施方式中，对组氨酸残基所在的3号位置上所作的任一的替换都可以产生改良的非金属结合修饰的白蛋白，因为组氨酸是白蛋白与铜和镍结合的决定性因素。本发明优选的经取代修饰的白蛋白序列具有的序列为Asp-Ala-X-Lys-Ser-Glu……，其中X表示任一氨基酸的替换(或插入或缺失)该序列可以造成位阻或破坏生理上的结合作用从而足以降低或消除金属诸如铜镍对血清白蛋白的结合。由于组氨酸所在的3号位置具有决定性的特点，因此在组氨酸之前的前导序列中进行任一的氨基酸插入操作通常都可足以破坏金属对白蛋白的结合。

相应的，根据本发明，通过组氨酸所在的氨基酸链上的3号位置处造成血清白蛋白的突变而获得经修饰的对痕量金属亲和力降低的血清白蛋白，此位置如上所述是序列X-X-组氨酸的一部分，而序列X-X-组氨酸看来是金属诸如镍和/或铜结合的重要位点。据观察，在生理pH下，铜以极高的亲和力与此位点相结合(Ka＝1.6×10¹⁶M^-1)，可能是所报道的任一结合配体对血清白蛋白相结合的最高结合常数。通过替换或截去组氨酸残基而破坏此结合位点，或者通过在此位置点或附近进行足以破坏结合点的结构完整性的延伸操作，都可得到降低或消除了对痕量金属的亲和力的修饰白蛋白。

在制备本发明修饰白蛋白的优选的实施方式中，所述白蛋白可通过重组的方法制备，在制备过程中，白蛋白蛋白质的核酸编码由基因工程方式得到以制备具有所需的如上所述在其n-末端区域得到修饰的白蛋白。相应的，本发明同样注重制备、分离和/或纯化用于本发明白蛋白的核酸序列编码。然而，可使用众多的常用传统方法得到修饰蛋白质，比如物理学的、化学的或酶方法的都适于制备本发明修饰白蛋白，这都是本领域技术人员非常熟知的。

根据本发明，本发明的改良血清白蛋白可因此而用于各种应用中，从血液制品和血液代用品到化妆品及其它局部的用途。通常，本发明修饰白蛋白，只要通过上述对于本领域普通技术人员来说显而易见的传统方法制备出来后，即可制成有用的组合物，如，作为安全和有效的血液制品，诸如血容量膨胀剂。同样作为可以被本领域技术人员所认同的，本发明白蛋白可以通过各种本领域熟知的常用方法，使用生理学上可接受的流体或其它制备血液代用品时常用的物质制成适宜的血液代用组合物。一旦制成了生理学相容的血液代用品，本发明修饰白蛋白可以在需要增加血容量的时候给药，或者也可以将白蛋白修饰后运输氧以增加患者循环系统中的氧运输，例如，向那些由于失血而痛苦的病人或者在外科手术期间。本发明经修饰的白蛋白也可以HSA或牛血清白蛋白(BSA)或者其它相似的相关化合物的形式用于各种应用中，诸如在现今需要用到白蛋白的那些化妆或医药学的用途。

本发明经修饰的白蛋白也可通过向生理学可接受的赋型剂、辅料或载体中导入白蛋白而制成药学组合物。这些药学组合物对于原本用未修饰的白蛋白制备的组合物是非常优选的，由此制备这些本发明组合物可以在制备此种组合物时常用的方法制备获得，并且此内容可以被本领域技术人员所理解。

概括的说，本发明经修饰的白蛋白的使用可以延伸至现今使用未修饰白蛋白的应用，从上述血容量膨胀剂、化妆品、药物和药学组合物，可适当的用于洗发水、滴眼液、药物补充剂等等，如本领域普通技术人员所能认识到的。此外，大规模的生产重组修饰的白蛋白可提供更安全更可耐受的白蛋白制品，并且可以潜在的用于各种新的应用中，包括乳制品(如，哺乳制品，尤其对于很多被诊断为对牛奶中的牛白蛋白过敏的儿童)和另外的食品强化剂(如，当天然的动物血清白蛋白不适宜的时候)。在所有的上述情况中，本发明的修饰的白蛋白可以降低对痕量金属的亲和力，因此与非改良血清白蛋白相比，不易引起过敏反应或者其它有害的状况，后者中含有显著高水平的痕量金属。

最后，其它本发明所注重的重要应用是将本发明经修饰的白蛋白通过转基因植物与此蛋白质制品联合使用。本发明经修饰的白蛋白特别适合在转基因植物中的大量的重组产物的原因是：所述白蛋白可以从植物中整理出不希望有的痕量金属诸如镍或铜，因此在本发明相应的n-末端区域的氨基酸的修饰可以使得白蛋白大量的从转基因植物中获得，而没有在其它情况下潜在的金属蓄积的危险。

需要提出的是，前述具体实施方式仅仅用作阐述所要求保护的发明，且其它的对于本领域技术人员来说熟知的或显而易见的实施方式，虽然前述没有涉及，但是也落在权利要求的范围之内。

此外，下述实施例用作阐述所要求保护的发明，并非用于以任何形式限制由权利要求所定义的本发明的范围。

实施例

                   实施例1

除了以下在n-末端的氨基酸Glu-Ala-Glu-Phe-Asp-Ala-His之外，在诸如NCP控制数A99-13，2393)所定义的重组白蛋白中，得到纯化的重组白蛋白的染色大大的降低。此白蛋白通过正常的运用常用的重组方法而制备，从而从核酸中得到白蛋白，同时核酸进行重组以得到用于变异白蛋白的序列编码(可直接得到或通过简并序列得到)。染色的降低表明痕量金属结合的降低，并且还通过比较本发明白蛋白与其它条件下制备的rHSA的A₄₀₀，从A₄₀₀的降低来定量的证明上述结果。

在本实施例中痕量金属结合的戏剧性的降低情况可最佳的观察于图2之中，其中显示根据本发明而进行变异的血清白蛋白(左侧)根本不含痕量金属，与之相比，未改良血清白蛋白(右侧)含有比本发明经修饰的白蛋白多的多的痕量金属诸如镍和铜。

相应的，这些试验证明：本发明的改良血清白蛋白与未修饰的重组人血清白蛋白相比能显著的降低对痕量金属的结合。

                   实施例2

一种培养级的人血清白蛋白按照本发明进行准备，其中在n-末端区域含有延伸的氨基酸末端[可加上序列]。此经修饰的含有延伸氨基酸末端的培养级重组白蛋白(A25799-099)可通过金属分析与未修饰的A11400-199x NCP“超纯”(正常白蛋白序列)制品进行分析比较，未修饰的A11400-199x NCP“超纯”(正常白蛋白序列)制品在白蛋白含量的上要纯于本发明经修饰的粗培养级血清白蛋白，但是本发明白蛋白既没有进行纯化也没有完全的除去盐类。尽管缺乏纯化步骤，如所附的表1中所观察到的，本发明经修饰的白蛋白在铜含量上要大大低于未修饰的超纯白蛋白16倍。如其在常用白蛋白制品的使用中的情况，当盐和其它未结合的金属更彻底的除去时，此系数将另外再增加6倍，且本发明经修饰的白蛋白比未修饰的白蛋白在铜含量上(和/或其它相似痕量金属)要低于超过96倍数值。

再一次的，这些金属分析显示根据本发明的改良血清白蛋白与未改良的人血清白蛋白相比可显著的降低对痕量金属诸如铜的结合。

表1

          rHSA A25799-099            rHSA A11400-199x  金属mg/kg  (干燥)  检测限   检测  到的  金属mg/kg  (干燥)  检测限   检测  到的  铝    24  锑    ＜14.9  砷    ＜9.93  钡    ＜2.98  钹    ＜0.50  硼    16.1  镉    ＜1.49  钙    63.8  铬    ＜4.97  钴    ＜2.48  铜    19.7  铁    ＜0.50  铅    ＜9.93  锂    0  镁    8130  锰    5.17  钼    ＜9.93  镍    ＜2.98  磷    14500  钾    447  硒    ＜19.9  硅    99.6  锶    0  铊    ＜24.8  锡    3.48  钛    1.21  钒    ＜0.99  锌    8.15  银    ＜0.99  钠    27100  9.93  14.9  9.93  2.98  0.5  未检测到  1.49  3.48  4.97  2.48  0.99  0.5  9.93  未检测到  4.97  1.24  9.93  2.98  14.9  49.7  19.9  4.97  未检测到  24.8  未检测到  0.99  0.99  1.99  0.99  4.97  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  6/21/00  7.17  ＜2.99  ＜1.99  3.11  ＜0.10  ＜4.98  ＜0.30  61.1  ＜1.00  1.15  322.3  69.4  ＜1.99  ＜9.97  1.79  0.55  ＜1.99  7.09  2050  1180  ＜3.99  74.5  ＜7.98  ＜4.98  ＜6.98  ＜0.20  ＜0.20  4.82  0.28  4540  1.99  2.99  1.99  0.60  0.10  4.98  0.30  0.70  1.00  1.15  0.20  0.10  1.99  9.97  1.00  0.25  1.99  0.60  2.99  9.97  3.99  1.00  7.98  4.98  6.98  0.20  0.20  0.40  0.20  1.00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00  5/16/00