铜转运蛋白(Ctr1)N端功能区域由血清白蛋白(HSA)获取铜的机理研究

摘要

铜是人体中含量位居第二的必需微量元素。虽然正常人体内含铜量仅为100-200毫克，但却是人体内不可缺少的重要营养元素，对血液循环系统、神经系统和免疫系统，头发、皮肤和骨骼组织以及脑、肝脏和心脏等器官的发育和功能有着重要影响。蛋白中组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸等残基的侧链上含有与铜亲和的配体，主链上氨基酸残基间的酰胺肽键上也含有N原子，而且蛋白N端往往有游离的氨基，它们都有可能与铜发生配位。铜的配位可能影响蛋白质的结构与功能，进而调控一系列生命必需的生理过程。 肠道中大约50％的铜通过小肠上皮细胞吸收，然后由基侧膜上的ATP7A泵出胞外进入血液循环。其中铜摄取受到铜转运蛋白(CTR1)与二价金属转运蛋白(DMT1)调控。进入血液后，铜主要与血清蛋白和α2-巨球蛋白结合，铜以复合物形式被转运到各个组织细胞中。 本文中，我们主要使用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、电喷雾质谱、X射线吸收光谱、电子顺磁共振谱、表面等离子体共振谱等分析手段检测CTR1-N端区域蛋白(CTR11-46)与Cu(Ⅱ)的结合性质，以及CTR11-46蛋白和血清白蛋白HSA对Cu(Ⅱ)的竞争，还有两种蛋白间的相互作用。Cu(Ⅱ)的结果与文献中Cu(Ⅰ)结合在CTR1-N端富含Met区域的结果不同，CTR1-N端富含His的区域能够多比例结合Cu(Ⅱ)并且能够竞争下Cu(Ⅱ)与HSA蛋白复合物中的铜。除此之外，荧光光谱和表面等离子体共振谱数据显示CTR11-46蛋白和HSA蛋白间存在弱的相互作用，揭示了铜转运蛋白(Ctr1)N端功能区域由血清白蛋白(HSA)获取铜的机理。 第一章在调研相关文献之后，对铜代谢相关内容做了系统的综述，包括铜的重要意义，铜与疾病的关系，铜的摄取与代谢，血浆中铜的分布，铜离子转运蛋白的发现、结构和功能等。 第二章主要研究了位于细胞外的hCTR1-N端区域与Cu2+/Cu+的反应。hCTR1-N端结构域的前46个氨基酸的被选择作为研究对象，其包括主要的组氨酸区域和蛋氨酸区域。实验过程中使用了UV-vis，XAFS，ESI-MS和EPR等方法对反应进行检测。结果表明，hCtr1-N1-46蛋白在与铜反应的过程中，表现出了较高的活性，其中第二个组氨酸序列是重要的Cu(Ⅱ)结合位点，Cu(Ⅱ)与hCtr1-N端蛋白以平面方型四配位的形式存在。 第三章主要研究了位于细胞外的hCTR1-N端区域与HSA与Cu(Ⅱ)的复合物的反应。我们首先将HSA与Cu(Ⅱ)以4∶3的比例充分反应，得到HSA与Cu(Ⅱ)的复合物，然后通过多种手段检测HSA与Cu(Ⅱ)的复合物能否作为载体向hCtr1-N1-46蛋白传递铜。实验过程中使用了荧光，EPR，ESI-MS和SPR等方法对反应进行检测。结果表明，Cu(Ⅱ)在hCtr1-N1-46蛋白与HSA蛋白间的传递是可逆的，HSA蛋白能作为铜的载体向hCTR1-N端区域提供Cu(Ⅱ)。铜传递过程很可能是通过蛋白间的相互作用发生的，而Cu(Ⅱ)也可能通过连接两个蛋白上的组氨酸残基增强相互作用。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1前言

1．2铜与疾病

1．3铜的摄取与代谢

1．4血浆中铜的分布

1．4．1铜蓝蛋白

1．4．2血清白蛋白

1．4．3巨球蛋白

1．4．4组氨酸

1．5铜离子转运蛋白

1．6细胞对铜的摄取与代谢

参考文献

第二章铜离子与铜转运蛋白(CTR1)N端功能区域的作用

2．1引言

2．2实验部分

2．2．1实验材料

2．2．2 GB1-hCtr11-55蛋白重组质粒的构建与表达

2．2．3 GB1-TEV-hCtr11-55蛋白质粒的构建与表达

2．2．4 GB1-hCtr11-55-HA突变型蛋白的构建与表达

2．2．5 GB1-TEV-hCtr11-46蛋白的构建与表达

2．2．6实验方法

2．3结果与讨论

2．3．1电喷雾质谱分析铜转运蛋白(hCtr1-N1-46)与Cu的结合比例和结合位点

2．3．2电子顺磁共振谱分析铜转运蛋白(hCtr1-N1-46)与Cu(Ⅱ)的结合方式和结合位点

2．3．3紫外竞争法分析铜转运蛋白(hCtr1-N1-46)与Cu(Ⅰ)的结合能力

2．3．4 hCTR1-N端区域与Cu复合物的配位结构信息

2．4结论

参考文献

第三章铜转运蛋白(CTR1)N端功能区域由血清白蛋白(HSA)获取铜的机理研究

3．1引言

3．2实验部分

3．2．1实验材料

3．2．2 GB1-TEV-hCtr11-46蛋白的构建与表达

3．2．3实验方法

3．3结果与讨论

3．3．1血清蛋白(HSA)与Cu2+的作用

3．3．2 hCtr1-N1-46蛋白与HSA-Cu2+的作用

3．3．3 hCtr1-N1-46蛋白与HSA-Cu2+的作用

3．4结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果